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Distribución de densidad espacial de kinesina-5 / dineína citoplásmica en neuronas

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¿Existe alguna forma de determinar experimentalmente la distribución de densidad de kinesina y dineína en una neurona? El etiquetado de fluorescencia sería imposible (?) Ya que los marcadores de GFP probablemente alterarían la dinámica motora. ¿Algunas ideas? ¿O existe algún estudio que analice este tema?


Es posible etiquetar motores moleculares con proteínas fluorescentes. Puede obstaculizar su movimiento, pero como describe este documento, se puede crear una variante que no tenga la capacidad de atar carga.

Se pueden generar motores de quinesina constitutivamente activos mediante truncamientos que eliminan las regiones autoinhibidoras y de unión a carga del polipéptido. Para este trabajo, generamos KHC (1-560) (Figura 1A), un motor dimérico que ha sido bien caracterizado in vitro e in vivo [16], [18], [19]. Los motores KHC (1-560) se etiquetaron con tres copias en tándem de Citrine monomérico (mCit), una variante de proteína fluorescente amarilla mejorada (FP) (Figura 1A), y se expresaron en células COS (Figura 1B). Los motores de Kinesin-1 individuales se rastrearon en células vivas utilizando un microscopio TIRF modificado (Figura 1C) en el que se varió el ángulo de iluminación para permitir imágenes más profundas como se describe [17]

Sin embargo, si su objetivo es para determinar la distribución de densidad de kinesina y dineína en una neurona, puede simplemente arreglar las células y realizar una tinción IHC para las proteínas motoras, seguida de imágenes de alta resolución.


Reguladores del motor dineína citoplasmático

La dineína citoplasmática es el único microtúbulo menos motor dirigido al extremo en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas y, por lo tanto, lleva a cabo una amplia gama de funciones, incluido el transporte de orgánulos y ARNm, el posicionamiento nuclear y del huso, y el transporte de las proteínas del punto de control del ensamblaje del huso mitótico.

El motor de dineína funciona como una holoenzima, ensamblándose en un complejo con varias subunidades no catalíticas más pequeñas que ayudan a conectarlo con cargas de dineína, así como con otros factores reguladores que ayudan a acoplar el motor de dineína a sus muchas funciones celulares.

Dos adaptadores de dineína, dinactina y un complejo de lisencefalia 1 (Lis1) y proteína de distribución nuclear E (NUDE) o similar a NUDE (NUDEL) parecen ser ubicuamente necesarios para todas las funciones de dineína. Dynactin aumenta la procesividad de dineína in vitro y ayuda a vincular la dineína con sus cargas y puntos de anclaje en la celda. LIS1 – NUDE y LIS1 – NUDEL pueden actuar principalmente como un interruptor para la actividad de la dineína. Tanto la dinactina como LIS1-NUDE y LIS1-NUDEL modulan la asociación de dineína con los extremos positivos de los microtúbulos, lo que parece ser importante para el suministro de dineína a sus sitios de actividad.

Bicaudal D y el complejo Rod-ZW10-Zwilch (RZZ) son adaptadores de dineína multifuncionales, pero están restringidos a organismos metazoarios. Bicaudal D vincula la dineína con varias cargas en interfase, y RZZ, con su socio Spindly, acopla la dineína en el cinetocoro mitótico y podría ayudar a regular la transición entre las diversas funciones de dineína en el cinetocoro.

Las pequeñas GTPasas, que son muy específicas de los compartimentos subcelulares, regulan la asociación de dineína con algunas de sus cargas.

Los adaptadores de la dineína están fuertemente interconectados por la interacción física y por el fenotipo, por lo que deben cooperar para coordinar la función de la dineína en la célula.


Abstracto

La mayoría de los movimientos intracelulares de largo alcance de vesículas, orgánulos y otras cargas son impulsados ​​por motores moleculares basados ​​en microtúbulos (MT). La dineína citoplasmática, un complejo proteico de múltiples subunidades, con la ayuda de dinactina, impulsa el transporte de una amplia variedad de cargas hacia el extremo negativo de los MT. En este artículo, reviso nuestra comprensión actual de los mecanismos que subyacen a la regulación espacio-temporal del transporte vesicular impulsado por dineína-dinactina, con especial énfasis en los muchos pasos del movimiento direccional a lo largo de las pistas MT. Estos incluyen el reclutamiento de dineína a los extremos MT plus, la activación y procesividad de la dineína y el reconocimiento y liberación de la carga por parte del complejo motor en la membrana objetivo. Además, resumo los hallazgos más recientes sobre los mecanismos de control fino para el transporte intracelular a través de la interacción entre el complejo motor dineína-dinactina y sus cargas vesiculares.


Descripción general de la familia de la dineína

Las dineínas operan como complejos de proteínas construidos alrededor de subunidades generadoras de fuerza llamadas cadenas pesadas, denominadas así debido a su gran masa molecular (típicamente ∼ 500 kDa) (Fig. 2). Cada cadena pesada contiene un dominio motor que pertenece a la superfamilia AAA + 11 unido a un dominio de cola amino-terminal divergente (Fig. 2a). La cola especifica distintas propiedades de oligomerización y sirve como plataforma para la unión de varios tipos de subunidades asociadas (Fig. 2b), que a su vez median las interacciones con la carga mediante la unión directa o mediante el reclutamiento de proteínas adaptadoras.

a | Representación lineal de dominios dentro de la cadena pesada de dineína. El dominio de la cola amino-terminal está involucrado en la oligomerización de dineína, la unión de carga y la regulación, pero no es parte del dominio motor mínimo capaz de producir movimiento. in vitro. El dominio motor comprende el dominio enlazador, seis módulos AAA + (1–6), el tallo y puntal en espiral y la región carboxi-terminal. El dominio motor de Dictyostelium discoideum La dineína tiene una masa molecular de ∼ 380 kDa. En muchas dineínas fúngicas, la región C-terminal es más corta y el dominio motor es ∼ 330 kDa. Cada uno de los módulos AAA + está compuesto por un subdominio de terminal N grande y un subdominio de terminal C más pequeño (ver recuadro y recuadro 2). B | El complejo de dineína citoplasmática contiene un par de cadenas pesadas idénticas. Dentro de cada cadena pesada, los seis módulos AAA + se pliegan en un anillo. El tallo sobresale como una extensión del pequeño subdominio de AAA4. La cola está conectada a AAA1 por el dominio del enlazador, que se arquea sobre el anillo AAA +. En Chlamydomonas reinhardtii dineína-c del brazo interno, existe un doblez agudo de ∼ 90 ° entre el enlazador y la cola 90,92,115. Aunque aún no se visualiza en la dineína citoplasmática, podría existir una torcedura similar, ya que evitaría un choque estérico entre la cola y el microtúbulo. En la dineína-c, esta región del cuello de la cola es un sitio natural de flexibilidad en la molécula, lo que permite que el ángulo de la cola varíe con respecto al dominio motor 90,92,115. Las cadenas pesadas de dineína citoplasmática se ensamblan con hasta cinco tipos de subunidades asociadas, que también son dímeros 148. Las subunidades asociadas comprenden la cadena intermedia, la cadena ligera-intermedia y tres clases de cadena ligera: TCTEX, LC8 y Roadblock. Las líneas discontinuas indican interacciones informadas de las subunidades asociadas entre sí y con la cola 26. Se desconoce la disposición tridimensional (3D) de las subunidades asociadas con respecto a la cola. C | Un modelo 3D del dominio motor de dineína citoplasmática unido al microtúbulo (no se muestran las subunidades asociadas). Como actualmente no existe una estructura de alta resolución para todo el dominio motor unido a un dímero de tubulina, este modelo se basa en una estructura cristalina de 2,8 Å del D. discoideum dominio motor de dineína que carece del dominio de unión a microtúbulos 93 (ID del banco de datos de proteínas: 3VKG), unido a un modelo derivado de microscopía electrónica criogénica del dominio de unión a microtúbulos de ratón unido a un dímero de α-tubulina-β-tubulina 112 (proteína ID del banco de datos: 3J1T). Los subdominios se muestran en la representación de la superficie, con las dos hélices α largas en el tallo representadas por separado para enfatizar su disposición en espiral. Los seis módulos AAA + están etiquetados numéricamente.

Filogenéticamente, hay nueve clases principales de cadena pesada de dineína 20. La cadena pesada citoplasmática de dineína 1 (codificada por DYNC1H1 en humanos) se utiliza para casi todo el transporte dirigido al extremo negativo en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas (Fig. 1a). Sin embargo, los archaeplastidans, que carecen de dineínas y poseen un repertorio ampliado de quinesinas dirigidas negativamente 21, son una excepción. Dineína citoplasmática 2 (codificada por DYNC2H1 en humanos) tiene un papel especializado en el transporte de material a lo largo de los flagelos y cilios sensoriales y móviles (Fig. 1b). En esta revisión, nos referimos a la dineína citoplásmica 1 como "dineína citoplásmica" y a la dineína citoplasmática 2 como "dineína de transporte intraflagelar (IFT)" para distinguirla. Las siete clases de dineína restantes están integradas en el axonema, donde impulsan el latido ciliar (Cuadro 1). Algunas clases de dineína axonemal tienen múltiples representantes por genoma, por lo que el número total de genes de cadena pesada distintos en los organismos que construyen un axonema móvil generalmente excede nueve. Por ejemplo, hay 16 genes de cadena pesada de dineína en el genoma humano 22.

Recuadro 1: Funciones de la dineína en el axonema

Observado en sección transversal, el axonema tiene un aspecto característico de '9 + 2' en muchos eucariotas, correspondiente a nueve microtúbulos dobles periféricos que rodean un par central de microtúbulos singlete (ver la figura). Cada doblete consta de un microtúbulo completo con 13 protofilamentos (denominado túbulo A) y un microtúbulo incompleto de 10 protofilamentos (denominado túbulo B), con proteínas distintas de la tubulina en la unión 138. La polaridad de los microtúbulos se indica mediante signos más. Numerosas proteínas adicionales, como radios radiales, complejos reguladores de nexina-dineína y proteínas internas de microtúbulos (no mostradas), tienen funciones cruciales en la motilidad, estructura y regulación del axonema.

Dentro de los axonemas móviles, las dineínas impulsan el deslizamiento de los dobletes de microtúbulos adyacentes entre sí 139. Estos movimientos de deslizamiento son resistidos por otros componentes axonemales, convirtiéndolos en deformaciones de flexión que se propagan a lo largo del axonema. Las oscilaciones resultantes pueden impulsar la celda a través de su entorno fluido o crear un flujo sobre la superficie de la celda. Para producir deslizamiento, las dineínas axonémicas forman una unión estable a un microtúbulo de carga a través de sus colas y utilizan sus dominios motores para translocar a lo largo de un microtúbulo de vía adyacente.

Las dineínas axonemales se subdividen en brazos internos y externos, según su posición 3. Actualmente, su disposición se caracteriza mejor en las algas verdes. Chlamydomonas reinhardtii, en el que se han obtenido conocimientos detallados de estudios de genética molecular y tomografía crioelectrónica 140. Cada brazo exterior consta de tres cadenas pesadas de dineína diferentes (cadenas α, β y γ, véase la figura), que adoptan una disposición apilada y se purifican conjuntamente como un complejo con ∼ 15 subunidades más pequeñas 141. Los brazos externos se repiten a intervalos de 24 nm a lo largo del axonema y son cruciales para generar la frecuencia de latido adecuada. Los brazos internos comprenden ocho cadenas pesadas de dineína diferentes (un heterodímero (fα y fβ) y seis monómeros (a – e y g), cada uno con su propio complemento de subunidades asociadas), que se repiten con una periodicidad de 96 nm 142. Cada dineína del brazo interno tiene distintas propiedades móviles y funciones en la configuración de la forma de onda ciliar 143.

A partir de este diseño general, la composición de dineína puede variar tanto alrededor como a lo largo del axonema. Por ejemplo, en C. reinhardtii, tres cadenas pesadas especializadas reemplazan las dineínas canónicas del brazo interno cerca de la base del axonema 144, y uno de los dobletes carece de brazos externos a lo largo de su longitud 142. En la mayoría de los metazoos, cada brazo exterior contiene dos cadenas pesadas, en lugar de tres. La disposición 9 + 2 también varía en algunos organismos. Por ejemplo, el axonema de esperma altamente móvil de la anguila Anguila anguila es una estructura mínima de 9 + 0 que carece de brazos externos, radios radiales y el par central de microtúbulos 145. Estas variaciones estructurales probablemente contribuyen a las distintas formas de onda y propiedades móviles mostradas por los cilios. En todos los sistemas, para que se produzcan movimientos de flexión en forma de onda, se propone que las zonas de actividad de dineína cambien de un lado del axonema al otro y se propaguen a lo largo de su longitud. Los modelos para la coordinación y regulación de la actividad de la dineína se analizan en las Refs. 16,17,18,19. La forma en que las dineínas axonemales se ensamblan en esta configuración y funcionan como un sistema integrado, con los muchos reguladores y proteínas estructurales en el axonema, apenas está comenzando a emerger.


Resultados

Efectos de la sobreexpresión de dinamitina (p50) sobre la morfología mitocondrial

La expresión de DsRed dirigido mitocondrialmente en células HeLa de control (transfectadas con vector vacío) y la adquisición de imágenes confocales revelaron la existencia de mitocondrias con una variedad de estructuras y longitudes (Fig. 1A, a, b Fig. 2A, a, c) . Regiones de alta conectividad mitocondrial aparente (es decir, un "retículo" mitocondrial) (Rizzuto et al., 1998) (Fig. 2A, a, c), así como mitocondrias individuales claramente discretas (Fig. 1A, Fig. 2A, a , c) (Collins et al., 2002) también fueron evidentes. Una gran proporción (65-70%, examinada en siete células que coexpresan mito.DsRed y α-tubulina.EGFP) de mitocondrias individuales se ubicaron a lo largo de los microtúbulos en las células vivas (Fig. 1A, a, b) y las mitocondrias también fueron evidentes. en la periferia de la celda en las celdas de control (Fig. 1A, a, b 2A, a, c, B).

Las mitocondrias se localizan parcialmente a lo largo de los microtúbulos en las células HeLa vivas. (A) Las células se cotransfectaron con 0,25 μg de mito.DsRed y 1 μg de α-tubulina.EGFP. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un UltraVISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas en tampón KRH (consulte Materiales y métodos) a 22 ° C. La región encuadrada en a se muestra en una escala ampliada en b) las flechas en b indican regiones de colocalización. (B) Los microtúbulos se despolimerizaron con nocodazol 10 µM. La región encuadrada en a se muestra en una escala ampliada en b. Barras, 1,0 μm. (C) Subunidades de dinactina (p50 y p150 Pegado ) y la dineína están asociadas con una fracción mitocondrial. Se obtuvo un sedimento mitocondrial pesado (HMP) después de centrifugar el sobrenadante postnuclear (PNSN) a 3000 gramo durante 10 minutos (ver Materiales y métodos). Se cargó una cantidad igual (3 µg) de proteína en cada carril. La intensidad de las bandas de proteínas se midió utilizando el software NIH ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). PHMSN, sobrenadante mitocondrial post-pesado DIC, cadena intermedia de dineína.

Las mitocondrias se localizan parcialmente a lo largo de los microtúbulos en las células HeLa vivas. (A) Las células se cotransfectaron con 0,25 μg de mito.DsRed y 1 μg de α-tubulina.EGFP. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un UltraVISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas en tampón KRH (consulte Materiales y métodos) a 22 ° C. La región encuadrada en a se muestra en una escala ampliada en b) las flechas en b indican regiones de colocalización. (B) Los microtúbulos se despolimerizaron con nocodazol 10 µM. La región encuadrada en a se muestra en una escala ampliada en b. Barras, 1,0 μm. (C) Subunidades de dinactina (p50 y p150 Pegado ) y la dineína están asociadas con una fracción mitocondrial. Se obtuvo un sedimento mitocondrial pesado (HMP) después de centrifugar el sobrenadante postnuclear (PNSN) a 3000 gramo durante 10 minutos (ver Materiales y métodos). Se cargó una cantidad igual (3 µg) de proteína en cada carril. La intensidad de las bandas de proteínas se midió utilizando el software NIH ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). PHMSN, sobrenadante mitocondrial post-pesado DIC, cadena intermedia de dineína.

La sobreexpresión de dinamitina (p50) induce el colapso mitocondrial alrededor del núcleo y MTOC. (A) Las células HeLa se cotransfectaron con 0,5 μg de mito.DsRed (a, b, e, f) y 1 μg de pAdTrack-CMV (vector vacío / control) (a, b) o p50.EGFP (e, f) . Las mitocondrias se visualizaron con MitoTrackerRed ™ (c, d, g, h) en células transfectadas con pcDNA3 (vector vacío / control) (c, d) o p50.pcDNA3 (g, h). Los límites sombreados en cyd indican la periferia de la celda. Doce horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un microscopio confocal Leica TCS-NT (a, b, e, f) o se fijaron (c, d, g, h) y luego se inmunoteñieron con un anticuerpo monoclonal anti-p50 de ratón ( 1: 250) y se visualizó con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa Fluor 488 (1: 500) antes de la imagen confocal. Las células que sobreexpresan p50 se identificaron excitando EGFP o el anticuerpo secundario a 488 nm. Se visualizó la fluorescencia de DsRed o MitoTrackerRed ™ en las mismas células mediante excitación a 568 nm. Imágenes confocales típicas de mitocondrias marcadas con DsRed en células de control o que expresan p50 se muestran en aye, fluorescencia de MitoTrackerRed ™ en cyg, imágenes compuestas b, d, fy h. Nótese la reubicación de las mitocondrias cerca del núcleo en las células que expresan p50 (e versus a, g versus c). Barras, 10 μm. (B) Reconstrucción de campos de microscopía electrónica de transmisión adyacentes que muestran una célula (B) control-HeLa con mitocondrias distribuidas al azar en todo el citosol y una célula HeLa transfectada con (C) p50 con mitocondrias redistribuidas a la región perinuclear dentro de 2-3 μm de la membrana nuclear. Las mitocondrias están en gran parte ausentes en la periferia celular. (D) Misma sección que se muestra en C con mayor aumento. Es evidente la estrecha asociación de las mitocondrias con el RE. RE, retículo endoplásmico m, mitocondria nu, núcleo pm, membrana plasmática.

La sobreexpresión de dinamitina (p50) induce el colapso mitocondrial alrededor del núcleo y MTOC. (A) Las células HeLa se cotransfectaron con 0,5 μg de mito.DsRed (a, b, e, f) y 1 μg de pAdTrack-CMV (vector vacío / control) (a, b) o p50.EGFP (e, f) . Las mitocondrias se visualizaron con MitoTrackerRed ™ (c, d, g, h) en células transfectadas con pcDNA3 (vector vacío / control) (c, d) o p50.pcDNA3 (g, h). Los límites sombreados en cyd indican la periferia de la celda. Doce horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un microscopio confocal Leica TCS-NT (a, b, e, f) o se fijaron (c, d, g, h) y luego se inmunoteñieron con un anticuerpo monoclonal anti-p50 de ratón ( 1: 250) y se visualizó con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa Fluor 488 (1: 500) antes de la imagen confocal. Las células que sobreexpresan p50 se identificaron excitando EGFP o el anticuerpo secundario a 488 nm. Se visualizó la fluorescencia de DsRed o MitoTrackerRed ™ en las mismas células mediante excitación a 568 nm. Imágenes confocales típicas de mitocondrias marcadas con DsRed en células de control o que expresan p50 se muestran en aye, fluorescencia de MitoTrackerRed ™ en cyg, imágenes compuestas b, d, fy h. Tenga en cuenta la re-localización de las mitocondrias cerca del núcleo en las células que expresan p50 (e versus a, g versus c). Barras, 10 μm. (B) Reconstrucción de campos de microscopía electrónica de transmisión adyacentes que muestran una célula (B) control-HeLa con mitocondrias distribuidas al azar en todo el citosol y una célula HeLa transfectada con (C) p50 con mitocondrias redistribuidas a la región perinuclear dentro de 2-3 μm de la membrana nuclear. Las mitocondrias están en gran parte ausentes en la periferia celular. (D) Misma sección que se muestra en C con mayor aumento.Es evidente la estrecha asociación de las mitocondrias con el RE. RE, retículo endoplásmico m, mitocondria nu, núcleo pm, membrana plasmática.

La dineína citoplasmática es un complejo de proteínas motoras de microtúbulos de múltiples subunidades que está implicado en el control de una amplia variedad de procesos celulares (Allan y Schroer, 1999). Para impulsar el movimiento de los orgánulos de carga, la dineína requiere el factor accesorio dinactina (Gill et al., 1991 Burkhardt et al., 1997). Al igual que la dineína citoplasmática, la dinactina es un gran complejo de múltiples subunidades (Holleran et al., 1998) que puede alterarse por la sobreexpresión de su subunidad de dinamitina (p50) (Echeverri et al., 1996 Burkhardt et al., 1997). Para detectar subunidades de dinactina y dineína en las mitocondrias, preparamos una fracción mitocondrial pesada que contenía predominantemente membranas mitocondriales y estaba esencialmente libre de la presencia de otros orgánulos. p50, p150 Pegado y dineína se asociaron con raciones mitocondriales (Fig. 1C) y más del 10% del contenido celular total de cada proteína se encontró en la fracción mitocondrial pesada. Mientras que la despolimerización de microtúbulos con nocodazol tuvo un efecto relativamente pequeño sobre la estructura mitocondrial (Figura 1B), la sobreexpresión de p50 condujo a una reubicación dramática de las mitocondrias hacia la periferia nuclear, según se evaluó usando DsRed dirigido a las mitocondrias (Varadi et al., 2002) (Fig. 2A, e versus a), o la tinción mitocondrial, MitoTrackerRed ™ (Fig. 2A, g versus c). El efecto de p50 sobre la distribución mitocondrial fue altamente reproducible y no se vio afectado por la fusión de EGFP en el extremo C-terminal de p50 (Fig. 2A, e versus g). Además, la gravedad de la redistribución mitocondrial se correlacionó bien con el grado de sobreexpresión de p50. Por lo tanto, en las células que expresaron niveles moderados (~ 50% de la mediana de fluorescencia) de p50 exógeno (basado en la intensidad de fluorescencia de EGFP o tinción anti-p50), el 43% (66 de 150 células) mostró una estructura mitocondrial en gran parte interconectada que tenía una tendencia a localizarse a cierta distancia de la membrana plasmática. Por el contrario, la mayoría (116 de 200 o el 58% de los datos de cinco experimentos independientes) de las células con niveles altos de dinamitina (∼70% de fluorescencia media) mostraron mitocondrias "colapsadas". Además, observamos una relocalización similar de las mitocondrias en una célula β pancreática tipo MIN6 metabólicamente más activa (datos no mostrados).

Las limitaciones de la metodología anterior son que: (a) la aparente redistribución de las mitocondrias puede simplemente reflejar un cambio en la capacidad de esas mitocondrias en la periferia celular para acumular las sondas, y (b) ese análisis cuidadoso del efecto de p50 en las mitocondrias la morfología no fue posible a la resolución del microscopio óptico debido a la alta densidad de mitocondrias cerca del núcleo (Fig. 2A, e, g). Para evitar ambos problemas, examinamos los cambios en la morfología mitocondrial mediante microscopía electrónica (ME) (Fig. 2B-D). Este enfoque demostró claramente que la sobreexpresión de p50 provocó una acumulación marcada de mitocondrias cerca del núcleo y una pérdida completa de mitocondrias en regiones más remotas de la célula (Fig. 2, C frente a B). Además, las mitocondrias con morfología altamente inusual, ramificada (Fig. 2D y Fig. 3A) y alargada (Fig. 3B) también eran evidentes en las células transfectadas con p50, pero no se observaron en las células de control. Por lo tanto, observamos consistentemente que aproximadamente el 15% de las mitocondrias en HeLa transfectado con p50 exhibían una forma de 'Y' o 'T' en oposición a las células de control en las que tales estructuras rara vez se observaban (menos del 1% de las mitocondrias). Además, aproximadamente el 10% de las mitocondrias en los transfectantes p50 presentaban una morfología alargada, que a veces alcanzaba aproximadamente 12 μm de longitud, en comparación con las células de control (mitocondrias & lt2.5 μm).

La sobreexpresión de p50 altera la morfología y la ultraestructura mitocondrial. Las micrografías electrónicas de transmisión de secciones transversales de células HeLa que expresan p50 a gran aumento muestran una morfología inusualmente ramificada (A) o alargada (B) de las mitocondrias. La punta de flecha en A indica la ramificación de las mitocondrias Las puntas de flecha en B indican una sola mitocondria de ~ 10 μm de longitud. Observe la dramática pérdida de cisternas en las mitocondrias marcadas con un asterisco en A.

La sobreexpresión de p50 altera la morfología y la ultraestructura mitocondrial. Las micrografías electrónicas de transmisión de secciones transversales de células HeLa que expresan p50 a gran aumento muestran una morfología inusualmente ramificada (A) o alargada (B) de las mitocondrias. La punta de flecha en A indica la ramificación de las mitocondrias Las puntas de flecha en B indican una sola mitocondria de ~ 10 μm de longitud. Observe la dramática pérdida de cisternas en las mitocondrias marcadas con un asterisco en A.

La alteración aguda de la actividad de la dineína citoplásmica imita los efectos de la sobreexpresión de p50

Para confirmar que la redistribución observada de las mitocondrias inducida por la sobreexpresión de p50 se debió directamente a la inhibición de la dineína citoplásmica, más que a factores como el bloqueo del ciclo celular (en la fase pro y meta), o un cambio en el número de mitocondrias, se a continuación, se microinyectó un anticuerpo de bloqueo de funciones (Heald y col., 1996 Burkhardt y col., 1997) contra la cadena intermedia de 74 kDa de dineína citoplásmica (DIC). La microinyección de anti-DIC indujo una reubicación clara y rápida (en 2-4 horas) de las mitocondrias a la periferia nuclear (Fig. 4A, c, d) de una manera muy similar al efecto de la sobreexpresión de p50 (Fig. 2A, p.ej). El efecto de anti-DIC fue dependiente de la dosis (no mostrado) y no fue imitado por un anticuerpo de control usado a la misma concentración (Fig. 4Aa, b, B).

El efecto de la sobreexpresión de p50 sobre la distribución mitocondrial es imitado por el anticuerpo anti-dineína. (A) Las células se transfectaron con 0,5 μg de mito.DsRed durante 16 horas y luego se microinyectaron junto con 1 mg ml -1 de IgG de control (a, b) o un anticuerpo monoclonal de ratón anti-cadena intermedia de dineína (DIC) (c, d) y 1 mg ml –1 dextrano BAPTA Verde Oregon. De dos a cuatro horas después de la inyección, las células tratadas con anticuerpos se identificaron excitando Oregon Green a 488 nm y usando filtros de isotiocianato de fluoresceína para la emisión de fluorescencia en el microscopio confocal Leica. Imágenes confocales in vivo de 568 nm típicas de mitocondrias en las células de control de IgG (a) y anticuerpo anti-DIC (c) inyectadas en las células by d imágenes compuestas. Barras, 10 μm. (B) Se puntuó el fenotipo de mitocondrias colapsadas en células transfectadas con p50 o microinyectadas con el anticuerpo anti-DIC. Los datos se presentan como el número de células que presentan este fenotipo como una fracción del número total de células transfectadas o microinyectadas. Se analizaron doscientas células que expresan p50 y diez microinyectadas en cinco experimentos independientes. (C) Efectos de la sobreexpresión de p50 sobre los orgánulos endocíticos. Las células HeLa se transfectaron transitoriamente con p50.EGFP (como se describe anteriormente) y se fijaron y tiñeron 12 horas después. La inmunocitoquímica se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TGN38 (a, b) (Lee y Banting, 2002) y un anticuerpo monoclonal anti-LAMP-1 de proteína de membrana asociada a lisosomas (c, d) (un marcador de endosomas tardíos y lisosomas ( Ihrke et al., 1998). Luego se visualizó la fluorescencia de un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa 568 en ayc a 568 nm. Se visualizó la fluorescencia de EGFP intrínseca a 488 nm en byd, que son imágenes compuestas que también muestran TGN38 e inmunotinción de LAMP1, respectivamente. Las puntas de flecha en a) indican la posición de las puntas de flecha de las células que expresan p50 en c) indican el desplazamiento extremo de los endosomas tardíos y lisosomas positivos a LAMP hacia la periferia después de la sobreexpresión de p50. Los asteriscos indican celdas de control. Barras, 10 μm. (D) La sobreexpresión de p50 no tiene ningún efecto sobre el potencial de la membrana mitocondrial (Δψmit). Las células se incubaron con TMRE 1 µM durante 30 minutos y posteriormente se adquirieron imágenes confocales. Utilizando configuraciones confocales idénticas, la fluorescencia de TMRE fue 28 ± 3,5 (norte= 6) y 30 ± 3,1 (norte= 14) unidades arbitrarias en las células de control (a) y que expresan p50 (b), respectivamente. Barras = 10 μm (A-E). Los límites sombreados en A, C y D, obtenidos de una superposición con la imagen transmitida de la celda, indican la periferia de la celda.

El efecto de la sobreexpresión de p50 sobre la distribución mitocondrial es imitado por el anticuerpo anti-dineína. (A) Las células se transfectaron con 0,5 μg de mito.DsRed durante 16 horas y luego se microinyectaron junto con 1 mg ml -1 de IgG de control (a, b) o un anticuerpo monoclonal de ratón anti-cadena intermedia de dineína (DIC) (c, d) y 1 mg ml –1 dextrano BAPTA Verde Oregon. De dos a cuatro horas después de la inyección, las células tratadas con anticuerpos se identificaron excitando Oregon Green a 488 nm y usando filtros de isotiocianato de fluoresceína para la emisión de fluorescencia en el microscopio confocal Leica. Imágenes confocales in vivo de 568 nm típicas de mitocondrias en imágenes compuestas de células byd inyectadas con IgG (a) y anticuerpo anti-DIC (c) de control. Barras, 10 μm. (B) Se puntuó el fenotipo de mitocondrias colapsadas en células transfectadas con p50 o microinyectadas con el anticuerpo anti-DIC. Los datos se presentan como el número de células que exhiben este fenotipo como una fracción del número total de células transfectadas o microinyectadas. Se analizaron doscientas células que expresan p50 y diez microinyectadas en cinco experimentos independientes. (C) Efectos de la sobreexpresión de p50 sobre los orgánulos endocíticos. Las células HeLa se transfectaron transitoriamente con p50.EGFP (como se describe anteriormente) y se fijaron y tiñeron 12 horas después. La inmunocitoquímica se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TGN38 (a, b) (Lee y Banting, 2002) y un anticuerpo monoclonal anti-LAMP-1 de proteína de membrana asociada a lisosomas (c, d) (un marcador de endosomas tardíos y lisosomas ( Ihrke et al., 1998). Luego se visualizó la fluorescencia de un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa 568 en ayc a 568 nm. Se visualizó la fluorescencia de EGFP intrínseca a 488 nm en byd, que son imágenes compuestas que también muestran TGN38 e inmunotinción de LAMP1, respectivamente. Las puntas de flecha en a) indican la posición de las puntas de flecha de las células que expresan p50 en c) indican el desplazamiento extremo de los endosomas tardíos y lisosomas positivos a LAMP hacia la periferia después de la sobreexpresión de p50. Los asteriscos indican celdas de control. Barras, 10 μm. (D) La sobreexpresión de p50 no tiene ningún efecto sobre el potencial de la membrana mitocondrial (Δψmit). Las células se incubaron con TMRE 1 µM durante 30 minutos y posteriormente se adquirieron imágenes confocales. Utilizando configuraciones confocales idénticas, la fluorescencia de TMRE fue 28 ± 3,5 (norte= 6) y 30 ± 3,1 (norte= 14) unidades arbitrarias en las células de control (a) y que expresan p50 (b), respectivamente. Barras = 10 μm (A-E). Los límites sombreados en A, C y D, obtenidos de una superposición con la imagen transmitida de la celda, indican la periferia de la celda.

La sobreexpresión de p50 provoca una redistribución anterógrada del complejo de Golgi y los orgánulos endocíticos.

Dado el efecto inesperado de p50 sobre la distribución mitocondrial, a continuación probamos los efectos de la sobreexpresión de p50.EGFP en otros orgánulos, cuya distribución se ha informado que es dependiente de dineína-dinactina (Burkhardt et al., 1997 Helfand et al., 2002). Como se anticipó, la sobreexpresión de p50 provocó la fragmentación y redistribución del complejo de Golgi (Fig. 4C, a, punta de flecha frente a células de control, asterisco). Este patrón de tinción se observó en el 51% de las células que expresan p50 (células 187/370, tres experimentos independientes). También se reveló una redistribución espectacular de lisosomas y endosomas tardíos en células transfectadas con p50 con un anticuerpo anti-proteína de membrana asociada a lisosoma (LAMP-1) (Lee y Banting, 2002) (Fig. 4C, c). Estos orgánulos se alejaron del centro de la célula, acumulándose en la periferia extrema y los procesos de la célula (Fig. 4C, punta de flecha c frente a célula de control, asterisco). Sin embargo, este fenotipo fue raro, y se observó en aproximadamente el 20% de las células que expresan p50 (85/425 células, tres experimentos independientes).

La sobreexpresión de p50 también tuvo efectos relativamente menores sobre la distribución de microtúbulos y microfilamentos (no mostrado). Por lo tanto, el 51% (153/300 células, tres experimentos independientes) de las células de control (transfectadas con pAdTrack-CMV) tenían un MTOC claro ubicado cerca del núcleo, que disminuyó al 35% (122/350 células, tres experimentos independientes) después de la transfección con p50. . En el 85% (424/500, tres experimentos independientes) de las células de control (que expresan pAdTrack-CMV), la red de filamentos intermedios de vimentina se extendió desde el núcleo hasta la periferia celular, con la mayoría de los filamentos de vimentina en la región perinuclear. Después de la sobreexpresión de p50, hubo una clara reducción en la tinción de vimentina en la región perinuclear con tinción intensa cerca de la superficie celular en el 27% (53/200 células, tres experimentos independientes) de las células que sobreexpresaban p50. Sin embargo, también se observó una tinción considerable de vimentina en todo el citoplasma. No se observaron efectos detectables de la sobreexpresión de p50 en la red de F-actina (datos no mostrados), la morfología celular general (Figuras 2 y 4) o la distribución del retículo endoplásmico (RE) (Varadi et al., 2004).

Para eliminar la posibilidad de que la relocalización de las mitocondrias inducida por la sobreexpresión de p50 pueda ser secundaria a cambios en el potencial de la membrana mitocondrial (Δψmit) (Ishihara et al., 2003 Legros et al., 2002) cargamos las células con el tinte etil éster de tetrametilrodamina (TMRE) cargado positivamente (Ainscow et al., 2000). La fluorescencia de TMRE fue 28 ± 3,5 (norte= 6 celdas) y 30 ± 3,1 (norte= 14 células) unidades arbitrarias en células de control y que expresan p50, respectivamente (Fig. 4D). Los cambios en la concentración de ATP mitocondrial libre en respuesta a la histamina, medidos usando una luciferasa dirigida recombinante (Jouaville et al., 1999) tampoco se vieron afectados por la sobreexpresión de p50 (Varadi et al., 2004). Finalmente, la expresión de p50 no tuvo ningún impacto en la incidencia de apoptosis según se evaluó mediante la tinción de fosfatidilserina en la superficie celular. Por tanto, medido a las 24 o 48 horas después de la transfección, no se encontraron células aparentemente apoptóticas entre las 234 células que expresan p50 que se examinaron.

Interacción entre kinesina I y dinactina

Una posible explicación de los efectos anteriores de p50 sobre la estructura mitocondrial es que la interrupción del complejo dinactina inhibe el transporte basado tanto en dineína como en quinesina-I, de modo que la localización neta de las mitocondrias se determina entonces solo por la motilidad basada en actina. Para probar si la kinesina I y la dineína interactuaban a través del complejo de dinactina, como se demostró recientemente para la kinesina II (Deacon et al., 2002), realizamos una coinmunoprecipitación de extractos de células HeLa utilizando el protocolo descrito anteriormente (Deacon et al., 2002) con un Anticuerpo monoclonal contra p150. Pegado subunidad del complejo dinactina. Se observó una banda de proteína muy débil correspondiente a la cadena pesada de kinesina I (KHC) en el p150 Pegado muestras inmunoprecipitadas pero estuvo ausente en las muestras de control (Fig. 5A). Las mismas transferencias también se probaron en busca de un compañero de interacción conocido de p150 Pegado , dinamitina (p50) (Gill et al., 1991). Como se esperaba, el anticuerpo anti-p50 reveló una banda de proteína muy fuerte en las muestras inmunoprecipitadas pero no en los controles (Fig. 5A). Por el contrario, un anticuerpo monoclonal anti-DIC no derribó la cadena ligera o pesada de la kinesina I (datos no mostrados) pero inmunoprecipitó p150 Pegado . Por el contrario, cuando se utilizó el protocolo de inmunoprecipitación descrito anteriormente (Martin et al., 1999), p150 Pegado no derribó la kinesina I, presumiblemente como resultado de la presencia de Triton X-100 en el tampón. Aunque estos resultados indican que una pequeña proporción de quinesina I y dinactina pueden interactuar directamente en las células HeLa, es evidente que el alcance de esta interacción es muy limitado.

La cadena pesada de kinesina I y el complejo de dinactina interactúan en el extracto de células HeLa. (A) p150 Pegado se precipitó a partir de extractos de células HeLa mediante un anticuerpo monoclonal y las transferencias se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-quinesina-cadena pesada (SUK4) panel derecho) o un anticuerpo monoclonal anti-p50 (panel izquierdo). Las muestras de control (-Cont.) Se precipitaron mediante un anticuerpo monoclonal no relacionado. Se cargaron cinco μg de proteína del homogeneizado celular, se utilizó el equivalente a 35 μg de proteína como material de partida para la inmunoprecipitación y se cargó una cantidad igual de proteína de las muestras inmunoprecipitadas (carriles p150 Pegado y -Cont.). (B) La despolimerización de los filamentos de actina restaura parcialmente la distribución normal de las mitocondrias en las células que expresan p50. Las células se cotransfectaron con 0,5 µg de mito.DsRed y 1 µg de p50.EGFP. Veinte horas después de la transfección, las células se incubaron con latrunculina B (25 μg ml -1) en tampón KRH a 37 ° C y luego se tomaron imágenes en un Ultra VISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas. Mitocondrias de la misma célula (a) antes de la adición de latrunculina B, (b) después de una incubación de 30 minutos o (c) después de una incubación de 60 minutos con el fármaco.

La cadena pesada de kinesina I y el complejo de dinactina interactúan en el extracto de células HeLa. (A) p150 Pegado se precipitó a partir de extractos de células HeLa mediante un anticuerpo monoclonal y las transferencias se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-quinesina-cadena pesada (SUK4) panel derecho) o un anticuerpo monoclonal anti-p50 (panel izquierdo). Las muestras de control (-Cont.) Se precipitaron mediante un anticuerpo monoclonal no relacionado. Se cargaron cinco μg de proteína del homogeneizado celular, se utilizó el equivalente a 35 μg de proteína como material de partida para la inmunoprecipitación y se cargó una cantidad igual de proteína de las muestras inmunoprecipitadas (carriles p150 Pegado y -Cont.). (B) La despolimerización de los filamentos de actina restaura parcialmente la distribución normal de las mitocondrias en las células que expresan p50. Las células se cotransfectaron con 0,5 µg de mito.DsRed y 1 µg de p50.EGFP. Veinte horas después de la transfección, las células se incubaron con latrunculina B (25 μg ml -1) en tampón KRH a 37 ° C y luego se tomaron imágenes en un Ultra VISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas. Mitocondrias de la misma célula (a) antes de la adición de latrunculina B, (b) después de una incubación de 30 minutos o (c) después de una incubación de 60 minutos con el fármaco.

Para probar si los movimientos hacia adentro impulsados ​​por la miosina y los microfilamentos podrían ser responsables del colapso de la estructura mitocondrial en las células que sobreexpresan p50, despolimerizamos los microfilamentos con latrunculina B. De acuerdo con la observación de que la mayoría de las mitocondrias están localizadas a lo largo de los microtúbulos ( Fig. 1), el tratamiento con latrunculina B revirtió parcialmente los efectos de p50 en el 36% de las células examinadas (9 de 25 células, Fig. 5B), mientras que no tuvo un efecto evidente sobre la distribución mitocondrial en las células de control. Estas observaciones indican que los movimientos impulsados ​​por la miosina pueden desempeñar algún papel en la relocalización de las mitocondrias después de la interrupción del complejo dineína-dinactina.A continuación, analizamos el efecto de la sobreexpresión de p50 sobre los movimientos mitocondriales en células vivas. Las mitocondrias se visualizaron mediante la expresión de mito.DsRed y se tomaron imágenes a 2 Hz en el UltraVISTA™ microscopio confocal. Se seleccionaron veinticinco regiones mitocondriales en diez células de control (Fig. 6A), y en células con niveles de expresión de p50 moderados (Fig. 6B) o altos (Fig. 6C), luego se analizaron los movimientos de las mitocondrias fuera de línea. En las células de control se observaron tres tipos principales de movimientos mitocondriales [ver datos suplementarios Película 1 y 2 Información suplementaria]]. Una gran proporción de mitocondrias (& gt50%) mostró movimiento browniano o térmico, ∼30% mostró un tipo de movimiento de empuje hacia adelante-retracción (Fig. 6A, by material suplementario Película 1) y ∼10% mostró lo que parecía ser ' verdadero 'transporte activo sobre microtúbulos (Fig. 6A, a, material suplementario Película 2). Este último movimiento no se observó después del tratamiento con nocodazol (datos no mostrados). A un nivel intermedio de expresión de p50, las mitocondrias se volvieron más interconectadas (Fig. 6B, a, by material suplementario Película 3) pero colapsaron alrededor del núcleo a una alta expresión de p50 (Fig. 6C, cy datos suplementarios Película 4). Incluso en células con mitocondrias colapsadas, se pudieron observar los movimientos hacia afuera de las mitocondrias individuales (Fig. 6C y material suplementario Película 5). No podemos excluir la posibilidad de que la sobreexpresión de p50 inhiba la función motora en diferente medida en diferentes regiones de la célula, un fenómeno que podría explicar la detección de movimientos activos de las mitocondrias incluso a niveles altos de expresión de p50. Sin embargo, la inhibición de los movimientos impulsados ​​tanto por la quinesina como por la dineína no puede explicar completamente el aumento de la interconectividad de las mitocondrias en las células que expresan p50 porque no se observó después del tratamiento con nocodazol (Fig. 1C).

Movimientos mitocondriales en células HeLa vivas. Las células se cotransfectaron con 0,25 μg de mito.DsRed y (A) 1 μg de padTrack-CMV o (B, C) p50.EGFP. Doce horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un UltraVISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas en tampón KRH a 37 ° C, se adquirieron imágenes a 2 Hz. Las regiones encuadradas en la celda de control (A) se amplían en los paneles ay b. Las puntas de flecha blancas indican una única mitocondria en movimiento cuya posición inicial original está marcada con un asterisco rojo. La dirección del movimiento se indica mediante flechas amarillas. (B, C) Distribución mitocondrial en células HeLa que expresan niveles moderados (B) y altos (C) de p50.EGFP. Observe las mitocondrias largas interconectadas en los paneles inferiores Ba y b, y la estructura mitocondrial colapsada en el panel inferior Cc. (D) Se seleccionaron veinticinco regiones mitocondriales en diez células de control (barras negras), y en células con expresión de p50 moderada (barras grises) y alta (barras blancas) y se analizaron los movimientos de las mitocondrias (ver Materiales y métodos, y Resultados ). Los movimientos de las mitocondrias son más evidentes en imágenes dinámicas (ver material complementario Películas 1-5).

Movimientos mitocondriales en células HeLa vivas. Las células se cotransfectaron con 0,25 μg de mito.DsRed y (A) 1 μg de padTrack-CMV o (B, C) p50.EGFP. Doce horas después de la transfección, se obtuvieron imágenes de las células en un UltraVISTA™ Sistema de imágenes confocales de células vivas en tampón KRH a 37 ° C, se adquirieron imágenes a 2 Hz. Las regiones encuadradas en la celda de control (A) se amplían en los paneles ay b. Las puntas de flecha blancas indican una única mitocondria en movimiento cuya posición inicial original está marcada con un asterisco rojo. La dirección del movimiento se indica mediante flechas amarillas. (B, C) Distribución mitocondrial en células HeLa que expresan niveles moderados (B) y altos (C) de p50.EGFP. Observe las mitocondrias largas interconectadas en los paneles inferiores Ba y b, y la estructura mitocondrial colapsada en el panel inferior Cc. (D) Se seleccionaron veinticinco regiones mitocondriales en diez células de control (barras negras), y en células con expresión de p50 moderada (barras grises) y alta (barras blancas) y se analizaron los movimientos de las mitocondrias (ver Materiales y métodos, y Resultados ). Los movimientos de las mitocondrias son más evidentes en imágenes dinámicas (ver material complementario Películas 1-5).

La sobreexpresión de p50 altera la distribución de Drp1

La sobreexpresión de p50 no solo indujo la agregación de las mitocondrias sino que también alteró su morfología (Fig. 2D y Fig. 3A, B). Esta observación sugirió que el equilibrio dinámico entre los eventos de fusión y fisión puede verse afectado cuando se inhibe la función de la dineína. Para probar esta posibilidad, investigamos el efecto de la sobreexpresión de p50 en la distribución de la proteína relacionada con la dinamina humana (Drp1), que es necesaria para la fisión mitocondrial en levaduras (Bleazard et al., 1999) y células de mamíferos (Smirnova et al. , 2001 Yoon et al., 2001). Drp1 endógeno se asoció con numerosas estructuras puntiformes similares a vesículas en las células de control (Fig. 7b, f, y Fig. 8A, a). Una gran proporción de estos puntos positivos para Drp1 se alinearon a lo largo de los microtúbulos (Fig. 7e-g, II, III). La tinción conjunta de microtúbulos y Drp1 mostró que una proporción de los puntos discretos positivos para Drp1 estaban dispuestos a lo largo de microtúbulos individuales (Fig. 7, III, flechas). El marcaje doble con anticuerpo mito.DsRed y anti-Drp1 reveló que una fracción del puncta Drp1 positivo se localizaba en las mitocondrias (Fig. 7a-c, I, flechas). Sin embargo, las matrices lineales de Drp1-positivas aparentes observadas en las células de control (Fig. 7b, fy Fig. 8A, a, c, norte= 57 células) fueron reemplazadas por una tinción difusa marcadamente diferente para Drp1 en células que sobreexpresan p50 (Fig. 8A, b, d, norte= 23 celdas). De acuerdo con esto, el fraccionamiento subcelular de las células HeLa reveló que la sobreexpresión de p50 redujo la cantidad de Drp1 asociada con las mitocondrias en un 55% (Fig. 8C, carriles 'Mito.P'). Se encontró una gran proporción de Drp1 en el sobrenadante post-mitocondrial (93% y 95% en las células de control y p50, respectivamente Fig. 8C, carriles 'PMSN') calculado a partir de la intensidad de las bandas de Drp1 y las concentraciones de proteína en cada fracción. De acuerdo con los datos publicados anteriormente (Smirnova et al., 2001), una fracción muy pequeña & lt2% de Drp1 podría sedimentarse mediante centrifugación a alta velocidad (Fig. 8C, carriles "MP"). La intensidad de Drp1 en MP fue un 40% mayor en las células que expresan p50 que en los controles, lo que sugiere que una fracción de Drp1 de las membranas mitocondriales se reubicó en esta fracción. La cantidad total de Drp1 no se vio afectada significativamente por la sobreexpresión de p50 (Fig. 8C, carriles 'PNSN').

Localización subcelular de Drp1 endógeno en células HeLa. Las células HeLa se fijaron primero con metanol-acetona fría (1: 1) y Drp1 endógeno y tubulina se detectaron por inmunofluorescencia con un anti-Drp1 (1: 250) y un anti-α-tubulina (1: 1000) antidody. (a) mito.DsRed (b, f) Drp1 y (e) α-tubulina-inmunofluorescencia (c, g) superposición de a y b, ye y f, respectivamente. Las áreas encuadradas en cyg se muestran en una escala ampliada en I, II y III respectivamente. la imagen ampliada (III) se rotó 90 ° en el sentido de las agujas del reloj. Las flechas indican la asociación de Drp1 con estructuras vesiculares puntiformes que están alineadas a lo largo de las mitocondrias (I) y los microtúbulos (II, III).

Localización subcelular de Drp1 endógeno en células HeLa. Las células HeLa se fijaron primero con metanol-acetona fría (1: 1) y Drp1 endógeno y tubulina se detectaron por inmunofluorescencia con un anti-Drp1 (1: 250) y un anti-α-tubulina (1: 1000) antidody. (a) mito.DsRed (b, f) Drp1 y (e) α-tubulina-inmunofluorescencia (c, g) superposición de a y b, ye y f, respectivamente. Las áreas encuadradas en cyg se muestran en una escala ampliada en I, II y III respectivamente. la imagen ampliada (III) se rotó 90 ° en el sentido de las agujas del reloj. Las flechas indican la asociación de Drp1 con estructuras vesiculares puntiformes que están alineadas a lo largo de las mitocondrias (I) y los microtúbulos (II, III).

La sobreexpresión de p50 altera la localización de Drp1 en las membranas mitocondriales. (A) Se tiñó Drp1 endógeno en (a) vector vacío o (b) células transfectadas con p50.EGFP (norte= 15 células en tres experimentos independientes). Las áreas encuadradas en se muestran en una escala ampliada debajo (c, d) La imagen en la esquina superior derecha muestra la distribución de las mitocondrias en las mismas células. Observe la tinción filamentosa y dispersa de Drp1 en las imágenes de control y en las células p50. (B) La sobreexpresión de Drp1 de tipo salvaje restaura la distribución normal de las mitocondrias en las células p50. Las mitocondrias se visualizaron con MitoTrackerRed ™ en células transfectadas con (a) vector vacío, (b) p50.EGFP, (c) p50.EGFP + Drp1 wt y (d) Drp1 K38A (norte= 8 células en tres experimentos independientes). Los límites sombreados, obtenidos de una superposición con la imagen transmitida de la celda, indican la periferia de la celda. Barras, 10 μm (C) La sobreexpresión de p50 reduce la cantidad de Drp1 en las membranas mitocondriales. Las células transfectadas con p50.EGFP (p50) o vector vacío (Cont.) Se fraccionaron como se describe en Materiales y métodos. El sobrenadante post-nuclear (PNSN), el sobrenadante post-mitocondrial (PMSN), el sedimento mitocondrial (Mito.P) y el sedimento microsomal (MP) se sondaron con un anticuerpo Drp1 antihumano policlonal de conejo. Se cargó una cantidad igual de proteína (26 μg / carril) de cada fracción. El anticuerpo reconoció Drp1 en el tamaño esperado (80 kDa). (D) La sobreexpresión de Drp1 de tipo salvaje restaura la cantidad normal de Drp1 en las membranas mitocondriales en las células que expresan p50. El sobrenadante post-nuclear (PNSN) y el sedimento mitocondrial (Mito.P) se prepararon a partir de células de control (Cont.) Y de células que sobreexpresan Drp1 (Drp1) y Drp1 + p50 (Drp1 + p50). Se cargó una cantidad igual de proteína (16 μg) en cada carril. Las transferencias se escanearon y cuantificaron con el software NIH ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

La sobreexpresión de p50 altera la localización de Drp1 en las membranas mitocondriales. (A) Se tiñó Drp1 endógeno en (a) vector vacío o (b) células transfectadas con p50.EGFP (norte= 15 células en tres experimentos independientes). Las áreas encuadradas en se muestran en una escala ampliada debajo (c, d) La imagen en la esquina superior derecha muestra la distribución de las mitocondrias en las mismas células. Observe la tinción filamentosa y dispersa de Drp1 en las imágenes de control y en las células p50. (B) La sobreexpresión de Drp1 de tipo salvaje restaura la distribución normal de las mitocondrias en las células p50. Las mitocondrias se visualizaron con MitoTrackerRed ™ en células transfectadas con (a) vector vacío, (b) p50.EGFP, (c) p50.EGFP + Drp1 wt y (d) Drp1 K38A (norte= 8 células en tres experimentos independientes). Los límites sombreados, obtenidos de una superposición con la imagen transmitida de la celda, indican la periferia de la celda. Barras, 10 μm (C) La sobreexpresión de p50 reduce la cantidad de Drp1 en las membranas mitocondriales. Las células transfectadas con p50.EGFP (p50) o vector vacío (Cont.) Se fraccionaron como se describe en Materiales y métodos. El sobrenadante post-nuclear (PNSN), el sobrenadante post-mitocondrial (PMSN), el sedimento mitocondrial (Mito.P) y el sedimento microsomal (MP) se sondaron con un anticuerpo Drp1 antihumano policlonal de conejo. Se cargó una cantidad igual de proteína (26 μg / carril) de cada fracción. El anticuerpo reconoció Drp1 en el tamaño esperado (80 kDa). (D) La sobreexpresión de Drp1 de tipo salvaje restaura la cantidad normal de Drp1 en las membranas mitocondriales de las células que expresan p50. El sobrenadante post-nuclear (PNSN) y el sedimento mitocondrial (Mito.P) se prepararon a partir de células de control (Cont.) Y de células que sobreexpresan Drp1 (Drp1) y Drp1 + p50 (Drp1 + p50). Se cargó una cantidad igual de proteína (16 μg) en cada carril. Las transferencias se escanearon y cuantificaron con el software NIH ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Para probar si los efectos de p50 en la distribución mitocondrial se deben a un agotamiento del grupo mitocondrial de Drp1, exploramos la acción de Drp1 introducido en células que también sobreexpresan p50. La coexpresión de Drp1 restauró, al menos en parte, la distribución normal de las mitocondrias en las células que sobreexpresan p50 (Fig. 8B, c, observada en 17/17 células examinadas, así como la cantidad de Drp1 en las membranas mitocondriales (Fig. 8D, carriles `Mito.P '). Por el contrario, la sobreexpresión de un Drp1 mutante (Drp1 K38A , que lleva una mutación puntual en el dominio GTPasa) causó un fenotipo mitocondrial colapsado sorprendentemente similar al causado por la sobreexpresión de p50 (Fig. 8B, d) (Smirnova et al., 1998 Smirnova et al., 2001 Yoon et al., 1998) .

Interacción entre dinactina y Drp1

Los datos anteriores sugieren que el complejo dineína / dinactina es importante para la correcta orientación de Drp1 a la membrana mitocondrial externa. Una explicación probable de este requisito es que el propio Drp1, o las vesículas decoradas con Drp1, son cargas de dineína. Para probar esta posibilidad inmunoprecipitamos p50, p150 Pegado y Drp1 de células HeLa en presencia y ausencia de detergente (± SP40) y luego sondear estas muestras con anti-p50, p150 Pegado o anticuerpos Drp1. Una banda de proteína correspondiente a p150 Pegado se observó en las muestras inmunoprecipitadas con Drp1 en ausencia y presencia de detergente (Fig. 9A, B) pero no se detectó en las muestras de control (Fig. 9A, B). Como se esperaba, p150 Pegado también estaba presente en las muestras inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-p50 (Fig. 9A, B). La cantidad de p150 Pegado detectado en la muestra inmunoprecipitada anti-Drp1 se redujo en ~ 50% en las células que sobreexpresan p50 (Fig. 9B, carril Drp1 *). Por el contrario, la sobreexpresión de Drp1 K38A (que lleva una mutación puntual en el dominio GTPasa) no cambió la cantidad de p150 Pegado tirado hacia abajo con p50 (Fig. 9B, carril p50 *). También se detectó una banda de proteína débil correspondiente a p50 en la muestra inmunoprecipitada anti-Drp1 solo en ausencia de detergente (Fig. 9C, panel –pNP40). Cuando se llevó a cabo la inmunoprecipitación con anticuerpos contra las subunidades de dinactina, el anticuerpo Drp1 reconoció muchas bandas de inmunoglobulina inespecíficas fuertes (entre 60-80 kDa) y, por tanto, la proteína correspondiente a Drp1 no pudo identificarse claramente. Los datos anteriores sugieren que Drp1 interactúa con dinactina y que esta interacción se reduce después de la sobreexpresión de p50.

El complejo Drp1-dinactina interactúa en extractos de células HeLa. p50, p150 Pegado y Drp1 se inmunoprecipitaron (IP) a partir de extractos de células HeLa utilizando los anticuerpos correspondientes. Las inmunoprecipitaciones se realizaron en presencia (+ NP40) y ausencia (-NP40) de detergente. Las transferencias se sondaron con un anti-p150 monoclonal Pegado anticuerpo (A, B) o un anticuerpo monoclonal anti-p50 (C). Muestras de control (-Cont.), Precipitadas por un anticuerpo monoclonal no relacionado o suero preinmune de conejo. Se cargaron cinco µg de proteína del homogeneizado celular y se usaron 500 µl como material de partida para la inmunoprecipitación. Dentro de cada panel, se cargó una cantidad igual de proteína de las muestras inmunoprecipitadas (carriles p150 Pegado y -Cont.). Drp1 *, células que expresan p50 p50 *, células que expresan Drp1 K38A.

El complejo Drp1-dinactina interactúa en extractos de células HeLa. p50, p150 Pegado y Drp1 se inmunoprecipitaron (IP) a partir de extractos de células HeLa usando los anticuerpos correspondientes. Las inmunoprecipitaciones se realizaron en presencia (+ NP40) y ausencia (-NP40) de detergente. Las transferencias se sondaron con un anti-p150 monoclonal Pegado anticuerpo (A, B) o un anticuerpo monoclonal anti-p50 (C). Muestras de control (-Cont.), Precipitadas por un anticuerpo monoclonal no relacionado o suero preinmune de conejo. Se cargaron cinco µg de proteína del homogeneizado celular y se usaron 500 µl como material de partida para la inmunoprecipitación. Dentro de cada panel, se cargó una cantidad igual de proteína de las muestras inmunoprecipitadas (carriles p150 Pegado y -Cont.). Drp1 *, células que expresan p50 p50 *, células que expresan Drp1 K38A.


DISCUSIÓN

Para determinar si la dineína y el complejo de dinactina tienen funciones importantes en el transporte axonal rápido y para investigar las posibles interacciones entre los sistemas de transporte anterógrado y retrógrado in vivo, realizamos pruebas genéticas y bioquímicas enDrosophila. Los fenotipos neuronales de mutaciones encDhc64C y Gl indican que la dineína y el complejo de dinactina tienen funciones importantes en el transporte axonal. Los fenotipos de hinchazón axonal y parálisis posterior llenos de orgánulos observados son similares a los causados ​​por mutaciones de kinesina convencionales. Las cargas de transporte rápido retrógradas y anterógradas se acumulan en las hinchazones, a pesar de que la dineína es un motor retrógrado. Los mismos fenotipos de transporte axonal bidireccional son generados por combinaciones heterocigotas por pares de mutaciones enKhc, Klc, cDhc64C, y Gl. Estas interacciones genéticas dominantes y los fenotipos de mutante único compartidos indican que los sistemas motores de kinesina y dineína son interdependientes durante el transporte axonal rápido.

Es curioso que la alteración del sistema motor de la kinesina o la dineína inhiba el transporte axonal rápido anterógrado y retrógrado. Consideramos tres modelos no exclusivos para explicar los efectos bidireccionales. El primer modelo se basa en la evidencia de que los motores de microtúbulos conocidos son unidireccionales y que & gt90% de los microtúbulos en los axones tienen polaridad uniforme, es decir, extremos más hacia el terminal (Burton y Paige, 1981 Heidemann et al., 1981 Baas et al., 1988 Topp et al., 1994). Por lo tanto, la mayoría de los motores dirigidos al extremo negativo, como la dineína, que se sintetizan en el cuerpo celular, probablemente se transportan al axón como cargas anterógradas rápidas antes de que se utilicen para impulsar el transporte retrógrado. Si la kinesina transporta dineína por el axón, las mutaciones de la kinesina deberían reducir la concentración de dineína en el axón. Por tanto, tanto el transporte retrógrado como el anterógrado sufrirían. La debilidad de este modelo es que no explica por qué cDhc64C y Gl las mutaciones interrumpen el transporte anterógrado. Debido a que presumiblemente la kinesina se degrada en la terminal (Hirokawa et al., 1991), los niveles de kinesina no deberían verse afectados directamente por cambios en el transporte retrógrado. En un segundo modelo propuesto por Hurd y Saxton (1996), el estancamiento de un orgánulo como resultado de una actividad de kinesina defectuosa dificulta el paso de otros complejos de carga y motor anterógrados y retrógrados, alentándolos a separarse de sus pistas de microtúbulos en ese mismo punto. . Las cargas desprendidas se acumulan y generan hinchazones axonales. La inhibición del transporte bidireccional causada por mutaciones citoplasmáticas de dineína o del complejo dinactina también podría atribuirse a este tipo de impedimento estérico.

En un tercer modelo, las actividades de la quinesina convencional, la dineína citoplásmica y el complejo de dinactina están vinculadas a través de contactos físicos. Por tanto, en neuronas sin dineína, la kinesina no funciona normalmente y viceversa.Este modelo es interesante porque tal vínculo podría asegurar la coordinación adecuada de las actividades motoras opuestas y proporcionar una distribución uniforme de los motores a lo largo del axón. Hasta la fecha, no hay evidencia bioquímica de una interacción directa dineína-quinesina. Sin embargo, esto no elimina la posibilidad de tales interacciones. Por ejemplo, aunque se acepta generalmente que el complejo de dinactina y la dineína citoplasmática tienen importantes contactos físicos in vivo, la fuerte evidencia de tales contactos permaneció esquiva durante varios años. Ahora, una demostración de la unión de p150 pegada a una cadena intermedia de dineína, combinada con fenotipos compartidos e interacciones genéticas entre el complejo de dinactina y las mutaciones de dineína, proporciona un argumento convincente para las interacciones directas subestequiométricas pero importantes (Muhua et al., 1994 Plamann et al., 1994 Karki y Holzbaur, 1995 McGrail et al., 1995 Vaughan y Vallee, 1995 Bruno et al., 1996 Tinsleyet al., 1996). Ha habido varias observaciones que son consistentes con una asociación entre dineína, el complejo dinactina y kinesina en el transporte axonal rápido. La kinesina y la dineína se localizan en orgánulos anterógrados rápidos (Hirokawa et al., 1990, 1991). En axoplasma extruido y axones intactos, los orgánulos individuales pueden moverse en ambas direcciones en los microtúbulos (p. Ej., Allen et al., 1985 Schnapp et al., 1985 Demasiado et al., 1996). Algunas vesículas purificadas más dirigidas al extremo se unen a motores dirigidos tanto al extremo positivo como negativo (Muresan et al., 1996). La inhibición de la kinesina en el axoplasma de calamar extruido con mAbs específicos altera la motilidad de las vesículas anterógrada y retrógrada (Bradyet al., 1990 Stenoien y Brady, 1997). Asimismo, los anticuerpos p150 Glued que interrumpen la interacción de dineína y el complejo dinactina inhiben la motilidad vesicular en ambas direcciones (Waterman-Storer et al., 1997). La motilidad de los orgánulos en los microtúbulos individuales periféricos y en los grupos interiores de los microtúbulos se vio afectada de manera similar en esos estudios de disrupción de anticuerpos. Por lo tanto, parece poco probable que el simple impedimento estérico entre el movimiento organelo anterógrado y retrógrado sea la explicación de la inhibición bidireccional (Brady et al., 1990 Stenoien y Brady, 1997 Waterman-Storer et al., 1997). Nuestro hallazgo de que los heterocigotos simples y dobles cDhc64C y Gllas mutaciones exhiben fenotipos menos severos que las combinaciones heterocigóticas simples o dobles que incluyen mutaciones de kinesina que podrían explicarse por un mayor flujo de cargas anterógradas versus cargas retrógradas. Sin embargo, a la luz de los estudios previos discutidos anteriormente, nuestras observaciones genéticas actuales apoyan la idea de un vínculo físico entre los motores de transporte rápido anterógrados y retrógrados. Esta vinculación puede ser indirecta, por ejemplo, ambos motores unen la misma carga pero en sitios distintos. O el enlace podría ser directo en forma de contactos físicos o regulatorios entre la kinesina, la dineína y el complejo de dinactina en los mismos sitios de unión de carga o en lugares cercanos.

Para determinar la validez y las influencias relativas de los tres modelos de enlace anterógrado-retrógrado discutidos anteriormente, se necesitará más experimentación. Mediciones directas de la motilidad de los orgánulos en mutantes y de tipo salvaje Drosophila proporcionan un enfoque excelente para estas cuestiones y las cuestiones más generales de la regulación y coordinación motora. El análisis de la motilidad de una gota de lípido único en embriones de tipo salvaje y mutantes sugiere que tanto la dineína como una quinesina dirigida al final positivo son activas y que el complejo de dinactina es importante para coordinar sus actividades (Welte et al., 1998 Gross, Welte, Block y Wieschaus, comunicación personal). Estamos desarrollando pruebas de motilidad de un solo orgánulo en mutantes y de tipo salvaje. Drosophila axones que deberían resultar muy informativos. Las investigaciones bioquímicas y genéticas continuas de los motores y sus asociaciones deberían identificar nuevas proteínas reguladoras y de enlace de carga. La integración de los resultados obtenidos de estos enfoques diferentes conducirá a una comprensión definitiva de la relación entre la quinesina, la dineína y el complejo de dinactina en el transporte axonal rápido.


Kinesina y espermatogénesis

La espermatogénesis de los mamíferos implica varios procesos fundamentales, que incluyen la renovación y diferenciación de las células madre, la división mitótica y meiótica, la migración celular, la reorganización del citoesqueleto, la conformación nuclear y la biogénesis del flagelo. Muchos de estos procesos implican un número considerable de cambios dinámicos, en particular los relacionados con el citoesqueleto, el movimiento de los orgánulos y la regulación de los microtúbulos [16]. La dinámica y organización de los microtúbulos está regulada no solo por las proteínas asociadas a los microtúbulos, que pueden organizar, agrupar y estabilizar los filamentos de los microtúbulos, sino también por las proteínas motoras que modulan el movimiento y permiten el transporte de cargas, como la dineína y la quinesina [17, 18]. . Son estas últimas proteínas motoras las que se consideran participantes clave en una variedad de procedimientos durante la espermatogénesis.

Mitosis

La proliferación mitótica de espermatogonias sienta las bases para la producción sucesiva de cantidades suficientes (millones) de espermatozoides con el objetivo de que al menos uno pueda alcanzar y fecundar un óvulo. Se ha estimado que alrededor de una docena de quinesinas están involucradas en el ensamblaje del huso bipolar, la alineación de los cromosomas en el ecuador del huso y en la segregación cromosómica y la citocinesis. Todos estos procesos son fundamentales para la segregación fiel de los cromosomas y la formación de dos células hijas durante las fases M mitótica y meiótica [19]. La mitosis somática ha sido bien estudiada mediante la microinyección de oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de ARNm [20, 21] o anticuerpos específicos para bloquear la función normal de proteínas motoras [22] o mediante la transfección de ADNc que contiene diversas mutaciones [23], etc. El análisis integral de inferencia de ARN (ARNi) también se ha aplicado en la Drosophila Línea celular S2 y células Hela humanas para identificar proteínas motoras esenciales durante la mitosis / citocinesis [24, 25]. Aquí, resumimos varias de las kinesinas más importantes involucradas en la mitosis. Debido a que las cinesinas mitóticas se investigan en células somáticas, sus expresiones en la línea de células germinales se han confirmado utilizando la base de datos “Germonline” [26], que proporciona información confiable para las espermatogonias y, por lo tanto, agrega mayor relevancia a la espermatogénesis (Tabla 1).

Kinesinas relacionadas con la mitosis y la meiosis.

Tipo de kinesina. Etapa de efecto. Función. Referencia. Expresar en testículos.
Kinesina-13 Mitosis Organización del husillo, bipolaridad del husillo 30, 31 Espermatogonias
MCAK / Kif2c
Kinesina-13 Mitosis Bipolaridad del huso 32, 33 Espermatogonias
Kif2a, Kif2b
Kinesina-13 Mitosis Posicionamiento del cromosoma del ensamblaje del husillo en el husillo 34 Desconocido
XKCM1 35
Kinesina-13 Mitosis Dinámica de los microtúbulos del huso 36 Espermatogonias
KLP10A y KLP59C
Kinesina-8 Mitosis Controla la longitud y el número de microtúbulos astrales 39 Espermatogonias
Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación cromosómica 41 Espermatogonias
Kif18A
DrosophilaMitosis Control de longitud del eje de alineación de cromosomas 42, 59 Espermatogonias
Klp67A
Kinesina-10 Mitosis Alineación cromosómica 44, 45 Desconocido
Xkid
Kinesina-10 Mitosis Congresión cromosómica 46 Espermatogonias
hKid / KIF22
Kinesina-4 Mitosis Posición de los cromosomas de la organización del huso 21 Desconocido
Xklp
Kinesina-4 Mitosis Condensación, congresión, separación de cromosomas 47, 48 Espermatogonias
KIF4A
DrosophilaMitosis Separación de polos de husillo 49 Espermatogonias
KLP3A
Kinesina-12 Mitosis Separación de polos del husillo, bipolaridad del husillo 50 Espermatogonias
Hklp2 / kif15
Kinesin-5 y 14 Mitosis Bipolaridad del huso 51, 52 Espermatogonias
Eg5 y KIFC1
Kif18A y cromocinesina Mitosis Alineación cromosómica 53 Espermatogonias
Kinesina 13 Mitosis Separación de cromátidas 54 Espermatogonias
KLP59C y KLP10A
Kinesin-13 y 8 Mitosis Catástrofe de microtúbulos 55, 56 Espermatogonias
MCAK y Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación y congresión cromosómica 57 Espermatocito
Kif18A
Kinesina-12 Mitosis Citocinesis 58 Espermatocito
PAKRP / kinesin12A
PAKRPKL / kinesin12B
DrosophilaMitosis Citocinesis del ensamblaje del huso 59 Espermatocito
KLP67A
DrosophilaMitosis Citocinesis 60 Espermatocito
KLP3A
DrosophilaMitosis Integridad de la lámina nuclear del conjunto del husillo 62 Espermatocito
KLP61F
Tipo de kinesina. Etapa de efecto. Función. Referencia. Expresar en testículos.
Kinesina-13 Mitosis Organización del husillo, bipolaridad del husillo 30, 31 Espermatogonias
MCAK / Kif2c
Kinesina-13 Mitosis Bipolaridad del huso 32, 33 Espermatogonias
Kif2a, Kif2b
Kinesina-13 Mitosis Posicionamiento del cromosoma del ensamblaje del husillo en el husillo 34 Desconocido
XKCM1 35
Kinesina-13 Mitosis Dinámica de los microtúbulos del huso 36 Espermatogonias
KLP10A y KLP59C
Kinesina-8 Mitosis Controla la longitud y el número de microtúbulos astrales 39 Espermatogonias
Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación cromosómica 41 Espermatogonias
Kif18A
DrosophilaMitosis Control de longitud del eje de alineación de cromosomas 42, 59 Espermatogonias
Klp67A
Kinesina-10 Mitosis Alineación cromosómica 44, 45 Desconocido
Xkid
Kinesina-10 Mitosis Congresión cromosómica 46 Espermatogonias
hKid / KIF22
Kinesina-4 Mitosis Posición de los cromosomas de la organización del huso 21 Desconocido
Xklp
Kinesina-4 Mitosis Condensación, congresión, separación de cromosomas 47, 48 Espermatogonias
KIF4A
DrosophilaMitosis Separación de polos de husillo 49 Espermatogonias
KLP3A
Kinesina-12 Mitosis Separación de polos del husillo, bipolaridad del husillo 50 Espermatogonias
Hklp2 / kif15
Kinesin-5 y 14 Mitosis Bipolaridad del huso 51, 52 Espermatogonias
Eg5 y KIFC1
Kif18A y cromocinesina Mitosis Alineación cromosómica 53 Espermatogonias
Kinesina 13 Mitosis Separación de cromátidas 54 Espermatogonias
KLP59C y KLP10A
Kinesin-13 y 8 Mitosis Catástrofe de microtúbulos 55, 56 Espermatogonias
MCAK y Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación y congresión cromosómica 57 Espermatocito
Kif18A
Kinesina-12 Mitosis Citocinesis 58 Espermatocito
PAKRP / kinesin12A
PAKRPKL / kinesin12B
DrosophilaMitosis Citocinesis del ensamblaje del huso 59 Espermatocito
KLP67A
DrosophilaMitosis Citocinesis 60 Espermatocito
KLP3A
DrosophilaMitosis Integridad de la lámina nuclear del conjunto del husillo 62 Espermatocito
KLP61F

Kinesinas relacionadas con la mitosis y la meiosis.

Tipo de kinesina. Etapa de efecto. Función. Referencia. Expresar en testículos.
Kinesina-13 Mitosis Organización del husillo, bipolaridad del husillo 30, 31 Espermatogonias
MCAK / Kif2c
Kinesina-13 Mitosis Bipolaridad del huso 32, 33 Espermatogonias
Kif2a, Kif2b
Kinesina-13 Mitosis Posicionamiento del cromosoma del ensamblaje del husillo en el husillo 34 Desconocido
XKCM1 35
Kinesina-13 Mitosis Dinámica de los microtúbulos del huso 36 Espermatogonias
KLP10A y KLP59C
Kinesina-8 Mitosis Controla la longitud y el número de microtúbulos astrales 39 Espermatogonias
Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación cromosómica 41 Espermatogonias
Kif18A
DrosophilaMitosis Control de longitud del eje de alineación de cromosomas 42, 59 Espermatogonias
Klp67A
Kinesina-10 Mitosis Alineación cromosómica 44, 45 Desconocido
Xkid
Kinesina-10 Mitosis Congresión cromosómica 46 Espermatogonias
hKid / KIF22
Kinesina-4 Mitosis Posición de los cromosomas de la organización del huso 21 Desconocido
Xklp
Kinesina-4 Mitosis Condensación, congresión, separación de cromosomas 47, 48 Espermatogonias
KIF4A
DrosophilaMitosis Separación de polos de husillo 49 Espermatogonias
KLP3A
Kinesina-12 Mitosis Separación de polos del husillo, bipolaridad del husillo 50 Espermatogonias
Hklp2 / kif15
Kinesin-5 y 14 Mitosis Bipolaridad del huso 51, 52 Espermatogonias
Eg5 y KIFC1
Kif18A y cromocinesina Mitosis Alineación cromosómica 53 Espermatogonias
Kinesina 13 Mitosis Separación de cromátidas 54 Espermatogonias
KLP59C y KLP10A
Kinesin-13 y 8 Mitosis Catástrofe de microtúbulos 55, 56 Espermatogonias
MCAK y Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación y congresión cromosómica 57 Espermatocito
Kif18A
Kinesina-12 Mitosis Citocinesis 58 Espermatocito
PAKRP / kinesin12A
PAKRPKL / kinesin12B
DrosophilaMitosis Citocinesis del ensamblaje del huso 59 Espermatocito
KLP67A
DrosophilaMitosis Citocinesis 60 Espermatocito
KLP3A
DrosophilaMitosis Integridad de la lámina nuclear del conjunto del husillo 62 Espermatocito
KLP61F
Tipo de kinesina. Etapa de efecto. Función. Referencia. Expresar en testículos.
Kinesina-13 Mitosis Organización del husillo, bipolaridad del husillo 30, 31 Espermatogonias
MCAK / Kif2c
Kinesina-13 Mitosis Bipolaridad del huso 32, 33 Espermatogonias
Kif2a, Kif2b
Kinesina-13 Mitosis Posicionamiento del cromosoma del ensamblaje del husillo en el husillo 34 Desconocido
XKCM1 35
Kinesina-13 Mitosis Dinámica de los microtúbulos del huso 36 Espermatogonias
KLP10A y KLP59C
Kinesina-8 Mitosis Controla la longitud y el número de microtúbulos astrales 39 Espermatogonias
Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación cromosómica 41 Espermatogonias
Kif18A
DrosophilaMitosis Control de longitud del eje de alineación de cromosomas 42, 59 Espermatogonias
Klp67A
Kinesina-10 Mitosis Alineación cromosómica 44, 45 Desconocido
Xkid
Kinesina-10 Mitosis Congresión cromosómica 46 Espermatogonias
hKid / KIF22
Kinesina-4 Mitosis Posición de los cromosomas de la organización del huso 21 Desconocido
Xklp
Kinesina-4 Mitosis Condensación, congresión, separación de cromosomas 47, 48 Espermatogonias
KIF4A
DrosophilaMitosis Separación de polos de husillo 49 Espermatogonias
KLP3A
Kinesina-12 Mitosis Separación de polos del husillo, bipolaridad del husillo 50 Espermatogonias
Hklp2 / kif15
Kinesin-5 y 14 Mitosis Bipolaridad del huso 51, 52 Espermatogonias
Eg5 y KIFC1
Kif18A y cromocinesina Mitosis Alineación cromosómica 53 Espermatogonias
Kinesina 13 Mitosis Separación de cromátidas 54 Espermatogonias
KLP59C y KLP10A
Kinesin-13 y 8 Mitosis Catástrofe de microtúbulos 55, 56 Espermatogonias
MCAK y Kif18B
Kinesina-8 Mitosis Alineación y congresión cromosómica 57 Espermatocito
Kif18A
Kinesina-12 Mitosis Citocinesis 58 Espermatocito
PAKRP / kinesin12A
PAKRPKL / kinesin12B
DrosophilaMitosis Citocinesis del ensamblaje del huso 59 Espermatocito
KLP67A
DrosophilaMitosis Citocinesis 60 Espermatocito
KLP3A
DrosophilaMitosis Integridad de la lámina nuclear del conjunto del husillo 62 Espermatocito
KLP61F

Entre todas las familias de kinesinas, las kinesin-13 son actores clave en la mitosis que inducen la despolimerización de los microtúbulos para regular la dinámica mitótica y controlar el ensamblaje del huso y las uniones cinetocoro-microtúbulos [27]. El Kif2c es una proteína asociada al centrómero que es necesaria para la correcta congresión y segregación cromosómicas [20, 28, 29], así como para el establecimiento y mantenimiento adecuados de la organización y dinámica de los microtúbulos del huso [30]. También se conoce como quinesina asociada al centrómero mitótico (MCAK) en organismos superiores [31]. Junto con las otras dos proteínas kinesin-13, Kif2a y Kif2b, MCAK también es esencial para la bipolaridad del huso. Esto se demuestra por la observación de que la doble pérdida de MCAK rescata el huso monopolar en células que carecen de Kif2a o Kif2b [32, 33]. Por lo tanto, las tres kinesina-13 cumplen una función distinta pero concertada durante la mitosis, siendo Kif2a y Kif2b las más importantes para el ensamblaje del huso bipolar y MCAK es esencial para la congresión y separación de la cromatina. La proteína homóloga MCAK XKCM1, que es la abreviatura de Xenopus kinesin motor central 1 o Xenopus kinesin catastrophe modulator-1, se localiza en los centrómeros desempeñando un papel similar en el ensamblaje del huso mitótico [34] y el posicionamiento de los cromosomas en el huso [35]. Otras dos despolimerasas de quinesina-13, KLP10A y KLP59C, cooperan para regular la dinámica de los microtúbulos durante la interfase de una manera distinta. Aquí, KLP10A estimula la catástrofe de microtúbulos, mientras que KLP59C actúa para suprimir su rescate [36]. KLP10A también es responsable de la formación y el mantenimiento del huso bipolar, ya que un agotamiento de KLP10A aumenta la densidad y longitud de los microtúbulos del huso [37] y rescata los husos monopolares en órbita agotada Drosophila Células S2 [38].

Las proteínas Kinesin 8 son otra familia de motores despolimerizadores de microtúbulos que son funcionales en la alineación cromosómica y la dinámica del huso. Kif18B es un motor dirigido a microtúbulos (MT) plus-end que se localiza en el núcleo durante la interfase y luego se enriquece en los extremos astrales MT plus durante la mitosis temprana. Esto controla la longitud y el número de MT astral de una manera dependiente de EB1 [39]. Kip3p, un motor dirigido al extremo positivo y una despolimerasa específica del extremo positivo, se mueve hacia los extremos positivos del microtúbulo en crecimiento y se acumula en ellos. Esto promueve catástrofes de microtúbulos e inhibe el crecimiento de microtúbulos como método para controlar la posición del huso mitótico [40]. Durante la metafase, Kif18A se acumula como un gradiente en los microtúbulos del cinetocoro y se encuentra que controla la alineación de los cromosomas mitóticos al suprimir las oscilaciones de los cromosomas [41]. Drosophila La proteína kinesina-8 Klp67A se ha encontrado en dos conjuntos de metafase separados, en los cinetocoros y a lo largo de los husos. Se observa que es necesario tanto para la alineación cromosómica como para el control de la longitud del huso [42].

La superfamilia de quinesinas incluye un grupo de quinesinas que se unen directamente al cromosoma, por lo que se denominan cromocinesinas. Se ha demostrado que estas cromocinesinas tienen varias funciones intracelulares, incluida la condensación y separación de cromosomas y el ensamblaje del huso durante los ciclos celulares [43]. Se han identificado y caracterizado previamente dos cromocinesinas en Xenopus como Xkid (kinesin 10) y Xklp (kinesin 4) y se ha demostrado que son esenciales para la alineación de los cromosomas en la placa de metafase (Xkid) [44, 45] y para la organización del huso y el posicionamiento de los cromosomas (Xklp) [21]. Se demostró que los homólogos humanos de estas dos proteínas, hKid y KIF4A, promueven la congresión cromosómica mediante el control del posicionamiento del brazo cromosómico y la dinámica de los microtúbulos del huso, respectivamente [46]. También se observó que KIF4A se localiza en el nucleoplasma durante la interfase y en los brazos del cromosoma condensado durante la mitosis, donde interactúa con los complejos I y II de condensación. Su agotamiento provoca hipercondensación cromosómica y segregación errónea de los cromosomas, lo que sugiere su papel esencial en el mantenimiento de la arquitectura cromosómica normal y la segregación durante la división celular [47]. Además, KIF4 puede regular la longitud de la zona media durante la citocinesis al terminar la elongación de la zona media durante la anafase tardía [48]. Se ha demostrado que otra cromocinesina, KLP3A, contribuye a la separación de los polos del huso durante la transición de prometafase a metafase y promueve la suficiente motilidad cromátida durante la anafase [49].Más tarde se identificaron nuevas cromocinesinas Hklp2 / kif15 (kinesina 12) y se descubrió que se dirigían al cromosoma a través de la interacción con ki67 en células humanas y se demostró que participaban en la separación de los polos del huso y en el mantenimiento de la bipolaridad del huso durante la metafase [50].

El proceso de mitosis también requiere las actividades concertadas de múltiples proteínas motoras basadas en microtúbulos. Si bien se informó que la proteína kinesina-5 Eg5 estaba altamente conservada en la formación del huso bipolar, este proceso también requiere la función antagonista de las proteínas kinesina-14 para impulsar el equilibrio de fuerza necesario para la bipolaridad [51, 52]. La proteína Kinesina 8 KIF18A funciona sinérgicamente con las cromocinesinas para limitar el movimiento del centrómero y controlar la tensión del cinetocoro para asegurar la alineación de los cromosomas en la placa de metafase [53]. Durante la anafase, dos cromátidas hermanas se separan y se mueven hacia polos opuestos. En Drosophila, dos proteínas kinesina-13 distintas cooperan para asegurar el movimiento normal de la cromátida al polo. Aquí, se requiere KLP59C para despolimerizar microtúbulos de cinetocoro en sus extremos positivos asociados a cinetocoro, mientras que se requiere KLP10A para despolimerizar microtúbulos en sus extremos negativos asociados a polos. Este proceso mueve las cromátidas utilizando un flujo hacia los polos [54]. La catástrofe de microtúbulos durante la anafase también requiere la cofunción de múltiples depolimerasas de microtúbulos, incluida la proteína kinesina 13 MCAK y las proteínas kinesina 8 Kip3 y Kif18b [55, 56].

Mitosis

El proceso de meiosis asegura el emparejamiento y separación de cromosomas homólogos para crear gametos haploides. Además de los defectos somáticos, que afectan la fertilidad masculina, los errores meióticos también son una causa de infertilidad humana y aneuploidía [11]. A pesar de la escasez de datos de tales estudios, las quinesinas o proteínas similares a la quinesina parecen ser responsables del proceso meiótico (Tabla 1). La proteína kinesina-8 Kif18A funciona para controlar la alineación cromosómica mitótica y meiótica en la zona media mediante la regulación negativa de la oscilación del cinetocoro. Su pérdida da como resultado atrofia testicular y esterilidad completa en ratones machos debido al deterioro de la congresión cromosómica [57]. Se observó que dos proteínas kinesina 12 homólogas, PAKRP / kinesin12A y PAKRP1L / kinesin12B, se localizan exclusivamente en el extremo positivo yuxtapuesto de los microtúbulos antiparalelos en la región media de la Arabidopsis phragmoplasts. En ausencia de ambas quinesinas, se observa que los microtúbulos están desorganizados después de la segregación de cromátidas y no logran formar matrices de microtúbulos antiparalelas entre los núcleos reformadores. Esto conduce a la inhibición de la primera citocinesis posmeiótica más allá de la cual no se observa formación de células generativas o espermatozoides [58].

Además de los motores de la quinesina, las proteínas similares a la quinesina también son funcionales durante la meiosis. los Drosophila La proteína similar a la quinesina KLP67A es una despolimerasa dirigida a un microtúbulo más un extremo que regula la longitud de los microtúbulos durante la mitosis y la meiosis masculina y es esencial para el ensamblaje del huso y la citocinesis. Los machos hemicigotos con niveles reducidos de KLP67A son casi completamente estériles. Un análisis citológico de sus testículos sugiere defectos en la segregación cromosómica y falla de la citocinesis durante la primera división meiótica. Esto produce espermátidas de tamaño anormal o con un número anormal de núcleos [59]. los Drosophila La proteína de tipo cinesina KLP3A se localiza en el ecuador del huso central durante la anafase tardía y la telofase de la meiosis masculina [60]. La pérdida de KLP3A se ha asociado con husos centrales desorganizados [61]. Como la organización adecuada del huso central es esencial para completar la citocinesis, se supuso que KLP3A era fundamental para el inicio de la citocinesis de la meiosis [60]. los Drosophila La proteína de tipo kinesina-5 KLP61F funciona de una manera específica de células germinales. Su pérdida no solo genera defectos del huso que dan como resultado una división desigual, sino que también compromete la integridad de la lámina nuclear y la formación de micronúcleos en los espermatocitos [62].

Espermiogénesis

La espermiogénesis es el paso final de la espermatogénesis, que implica la maduración final de las espermátidas en espermatozoides maduros, móviles e intactos y termina con la liberación de espermatozoides viables y funcionales en la luz de los túbulos seminíferos. Durante la espermiogénesis, se producen cambios notables, como la biogénesis del acrosoma, la remodelación nuclear y la formación de la cola, así como el proceso de translocación de la espermátide. Debido a que los espermatozoides de especies de orden inferior pueden homologarse con formas flageladas de mamíferos en la medida en que ambos contienen un núcleo modificado con el que transmitir información genética y un acrosoma para una fertilización eficaz, los modelos animales se utilizan a menudo para explorar los mecanismos subyacentes a la espermiogénesis. Se ha demostrado que varios miembros de la kinesina realizan funciones críticas durante este proceso (Tabla 2).

Kinesinas relacionadas con la espermiogénesis.

Etapas. Tipo de kinesina. Funciones. Especies Referencia.
Biogénesis de acrosomas Kinesina-14 Los vehículos de transporte amarran el acrosoma al núcleo Rata y crustáceos 64, 65, 67,, 68
KIFC1
Kinesina-9 Transporte de vehículos como Golgi Rata, toro 69, 70
KRP3A, KRP3B
Kinesina-1 Redistribución de proteínas relacionadas con la formación de acrosomas. Ratones 72
KIF5C
Conformación nuclear Kinesina-14 Interactuar con manchette y promover la conformación nuclear Ratones 76
KIFC5A
Kinesina-14 Unir el núcleo a manchette promueve la condensación y elongación del núcleo. Ratones y Pulpo tankahkeei 73, 77
KIFC1
Kinesina-2 Promover la conformación nuclear de una manera dependiente de la manchette Ratones 78, 79
KIF17b
Kinesina-2 Organización de manchette y modelado de la cabeza de los espermatozoides. Ratones 81
KIF3A
Formación de la cola Kinesina-2 Transporte intraflagelar Rata 80
Kif17b
Kinesina-2 Formación de axonemas Ratones 81
KIF3A
Kinesina-1 Transportar las mitocondrias a la pieza intermedia Rata 82
KLC3
Maduración espermátida KIF20 Translocación espermátida Rata y raton 97
Kinesina-9 Translocación espermátida Rata 98
KRP3
Transcripción de espermátidas KIF17b ACT distribución subcelular Línea celular de mono COS-1 103
KIF17b Transporte de ARNm de CREM Ratones 104
KIF17b Movimiento corporal cromatoide, metabolismo del ARN Ratones 105
Etapas. Tipo de kinesina. Funciones. Especies Referencia.
Biogénesis de acrosomas Kinesina-14 Los vehículos de transporte amarran el acrosoma al núcleo Rata y crustáceos 64, 65, 67,, 68
KIFC1
Kinesina-9 Transporte de vehículos como Golgi Rata, toro 69, 70
KRP3A, KRP3B
Kinesina-1 Redistribución de proteínas relacionadas con la formación de acrosomas. Ratones 72
KIF5C
Conformación nuclear Kinesina-14 Interactuar con manchette y promover la conformación nuclear Ratones 76
KIFC5A
Kinesina-14 Unir el núcleo a manchette promueve la condensación y elongación del núcleo. Ratones y Pulpo tankahkeei 73, 77
KIFC1
Kinesina-2 Promover la conformación nuclear de una manera dependiente de la manchette Ratones 78, 79
KIF17b
Kinesina-2 Organización de manchette y modelado de la cabeza de los espermatozoides. Ratones 81
KIF3A
Formación de la cola Kinesina-2 Transporte intraflagelar Rata 80
Kif17b
Kinesina-2 Formación de axonemas Ratones 81
KIF3A
Kinesina-1 Transportar las mitocondrias a la pieza central. Rata 82
KLC3
Maduración espermátida KIF20 Translocación espermátida Rata y raton 97
Kinesina-9 Translocación espermátida Rata 98
KRP3
Transcripción de espermátidas KIF17b ACT distribución subcelular Línea celular de mono COS-1 103
KIF17b Transporte de ARNm de CREM Ratones 104
KIF17b Movimiento corporal cromatoide, metabolismo del ARN Ratones 105

Kinesinas relacionadas con la espermiogénesis.

Etapas. Tipo de kinesina. Funciones. Especies Referencia.
Biogénesis de acrosomas Kinesina-14 Los vehículos de transporte amarran el acrosoma al núcleo Rata y crustáceos 64, 65, 67,, 68
KIFC1
Kinesina-9 Transporte de vehículos como Golgi Rata, toro 69, 70
KRP3A, KRP3B
Kinesina-1 Redistribución de proteínas relacionadas con la formación de acrosomas. Ratones 72
KIF5C
Conformación nuclear Kinesina-14 Interactuar con manchette y promover la conformación nuclear Ratones 76
KIFC5A
Kinesina-14 Unir el núcleo a manchette promueve la condensación y elongación del núcleo. Ratones y Pulpo tankahkeei 73, 77
KIFC1
Kinesina-2 Promover la conformación nuclear de una manera dependiente de la manchette Ratones 78, 79
KIF17b
Kinesina-2 Organización de manchette y modelado de la cabeza de los espermatozoides. Ratones 81
KIF3A
Formación de la cola Kinesina-2 Transporte intraflagelar Rata 80
Kif17b
Kinesina-2 Formación de axonemas Ratones 81
KIF3A
Kinesina-1 Transportar las mitocondrias a la pieza central. Rata 82
KLC3
Maduración espermátida KIF20 Translocación espermátida Rata y raton 97
Kinesina-9 Translocación espermátida Rata 98
KRP3
Transcripción de espermátidas KIF17b ACT distribución subcelular Línea celular de mono COS-1 103
KIF17b Transporte de ARNm de CREM Ratones 104
KIF17b Movimiento corporal cromatoide, metabolismo del ARN Ratones 105
Etapas. Tipo de kinesina. Funciones. Especies Referencia.
Biogénesis de acrosomas Kinesina-14 Los vehículos de transporte amarran el acrosoma al núcleo Rata y crustáceos 64, 65, 67,, 68
KIFC1
Kinesina-9 Transporte de vehículos como Golgi Rata, toro 69, 70
KRP3A, KRP3B
Kinesina-1 Redistribución de proteínas relacionadas con la formación de acrosomas. Ratones 72
KIF5C
Conformación nuclear Kinesina-14 Interactuar con manchette y promover la conformación nuclear Ratones 76
KIFC5A
Kinesina-14 Unir el núcleo a manchette promueve la condensación y elongación del núcleo. Ratones y Pulpo tankahkeei 73, 77
KIFC1
Kinesina-2 Promover la conformación nuclear de una manera dependiente de la manchette Ratones 78, 79
KIF17b
Kinesina-2 Organización de manchette y modelado de la cabeza de los espermatozoides. Ratones 81
KIF3A
Formación de la cola Kinesina-2 Transporte intraflagelar Rata 80
Kif17b
Kinesina-2 Formación de axonemas Ratones 81
KIF3A
Kinesina-1 Transportar las mitocondrias a la pieza intermedia Rata 82
KLC3
Maduración espermátida KIF20 Translocación espermátida Rata y raton 97
Kinesina-9 Translocación espermátida Rata 98
KRP3
Transcripción de espermátidas KIF17b ACT distribución subcelular Línea celular de mono COS-1 103
KIF17b Transporte de ARNm de CREM Ratones 104
KIF17b Movimiento corporal cromatoide, metabolismo del ARN Ratones 105

Biogénesis de acrosomas de kinesina y espermatozoides

Durante la espermiogénesis se observa una serie de alteraciones orquestadas, particularmente relacionadas con el acrosoma. La biogénesis del acrosoma se inicia cuando las vesículas acrosómicas se adhieren a un polo del núcleo. Se forma gradualmente un gránulo acrosómico que posteriormente se aplana y cubre la mayor parte del núcleo condensado. El acrosoma es una estructura importante que realiza funciones críticas durante la fertilización con su gran cuerpo de hidrolasas que permiten que los espermatozoides penetren a través de la capa de Zona pelúcida que rodea al ovocito [63]. En cuanto al origen del acrosoma, el aparato de Golgi se considera la fuente principal a partir de la cual las vesículas derivadas de Golgi que contienen membranas y proteínas se administran al sitio predeterminado en un polo del núcleo. Se han identificado varias quinesinas implicadas en el proceso de biogénesis de acrosomas.

KIFC1 es un miembro de la familia de kinesin-14 con su dominio motor en el C-terminal. Se mueve desde el extremo positivo hasta el extremo negativo a lo largo de los microtúbulos. En las ratas, KIFC1 se encuentra cerca del aparato de Golgi en las primeras espermátidas, y pronto se localiza en el acrosoma. La reubicación de KIFC1 es consistente con su desempeño potencial en el transporte de vesículas desde el Golgi al acrosoma. Esto sugiere su papel en la biogénesis del acrosoma a través del reciclaje de la membrana de regreso al Golgi o al orientar las cargas hacia el acrosoma [64]. Durante la espermiogénesis del camarón carideo Macrobrachium nipponense (Crustacea, Natantia), KIFC1 se encontró inicialmente en el citoplasma de las primeras espermátidas. Luego se colocaliza con el acrosoma en un patrón de puntos y se distribuye al núcleo de las espermátidas posteriores en un estado difuso [65]. La colocalización de KIFC1 en microtúbulos contribuye a la biogénesis del acrosoma mediante el transporte de vesículas para la formación del acrosoma y mediante la unión del acrosoma al núcleo [65]. El ARNm de kifc1, según lo detectado por hibridación in situ, también se ha observado que está relacionado con la formación de acrosomas durante Eriocheir sinensis espermiogénesis. En primer lugar, se observó que este ARNm se agregaba para formar la vesícula proacrosómica en un polo del núcleo. Luego se invagina en un núcleo en forma de media luna junto con la vesícula proacrrosomal y luego se distribuye finalmente en el túbulo acrosómico que rodea al acrosoma esférico maduro [66]. Los análisis inmunocitoquímicos y ultraestructurales han demostrado que la proteína KIFC1 se localiza en la estructura perforatoria de E. sinensis esperma, que consta de un casquete apical y un túbulo acrosómico. También se ha demostrado que las vesículas originadas en Golgi contribuyen a la biogénesis del acrosoma de E. sinensis [67] y Exopalaemon modestus [68] uniéndose a KIFC1. A partir de los ejemplos enumerados anteriormente, está claro que en la espermiogénesis tanto de mamíferos como de crustáceos, KIFC1 realiza funciones esenciales para la biogénesis de acrosomas mediante el transporte de vesículas.

KRP3A y KRP3B son isoformas de KRP3 relacionadas, que pertenecen a la familia de la kinesina-9. Se observó inicialmente que KRP3A y KRP3B estaban colocalizados con el acrosoma en desarrollo de ratas, donde el patrón de tinción reveló su presencia en forma de C rugosa sobre la cabeza de la espermátida redonda. Este hallazgo sugirió que podrían localizarse en el acrosoma de la espermátide redonda [69]. KRP3B también mostró una red fibular que cubre un pequeño parche de la membrana nuclear en espermátidas muy tempranas. En algunos casos, las tinciones de isoformas de KRP3 revelaron una forma similar a la del gránulo acrosómico. Además, las isoformas de KRP3 se localizaron en la cabeza del esperma alargada. Este hallazgo sugirió su desempeño potencial en la reestructuración de la cabeza del esperma [69]. Sin embargo, las isoformas de KRP3 muestran un patrón de distribución que está estrechamente relacionado con el aparato de Golgi. Antes de la formación del acrosoma en las primeras espermátidas, el patrón de tinción de KRP3B sigue siendo muy similar a la ubicación y estructura del aparato de Golgi. La tinción de KRP3 en espermátidas redondas es casi idéntica a la localización del aparato de Golgi relacionada con el acrosoma del toro en desarrollo [70]. La formación de acrosomas durante la espermiogénesis probablemente esté regulada por un mecanismo común, en el que el procesamiento de KRP3 representa un papel potencial para el transporte de vesículas para formar el acrosoma en un sitio predeterminado, mediado por la ubicación específica de varias moléculas de señalización.

KIF5C es un miembro de la familia de la kinesina-1, que se ha detectado en espermátidas de ratón [71, 72]. Se encontró que KIF5C era un socio de unión para la subunidad CK2α y se colocaliza con CK2α en el acrosoma de las espermátidas de ratón. Además, mostraron patrones de distribución similares durante la espermiogénesis. Dado que las combinaciones de subunidades de CK2 pueden determinar interacciones con otras proteínas durante la espermatogénesis, KIF5C puede contribuir a redistribuciones de proteínas que son parcialmente responsables de la formación de acrosomas. Sin embargo, KIF5C, con la participación de TNP1, también puede funcionar en la condensación nuclear [72].

Conformación nuclear de kinesina y esperma

La remodelación del núcleo ocurre durante la espermiogénesis, y el núcleo sufre una condensación y compresión cromosómicas llamativas que, en última instancia, da como resultado el alargamiento de los núcleos. El proceso de elongación de la espermátide de los mamíferos se acompaña de la aparición de una estructura de microtúbulos única, la manchette, que se muestra como un haz en forma de cono que encierra el núcleo. Esta estructura luego se mueve caudalmente y finalmente se desmonta [73]. La manchette es una estructura de microtúbulos que puede funcionar como un andamio organizativo para las proteínas necesarias para la formación de la cola o la cabeza del esperma [74, 75]. Aparece en las espermátidas del paso 8, pero se desmonta en las espermátidas del paso 14 [76]. De manera similar al huso, la manchette también muestra una motilidad compleja que probablemente se basa en numerosas actividades motoras. Se ha dilucidado que varios miembros de la kinesina están asociados con la estructura de la manchette y desempeñan funciones críticas en la condensación nuclear y la conformación nuclear.

KIFC5A es un miembro de la familia de kinesin-14 que muestra una amplia homología con CHO2 de hámster, HSET humano y KIFC1 y KIFC4 de ratón [76]. Actúa para agrupar los microtúbulos y mejorar la estabilidad y puede unirse con todas las estructuras que contienen microtúbulos en la espermátide, como la manqueta y los flagelos. El anticuerpo monoclonal de CHO2 se utilizó para localizar proteínas similares a KIFC5, que se ha demostrado que están asociadas con la manchette en espermátidas de ratón en estadio intermedio en el punto donde se encuentran el núcleo alargado y poco citoplasma residual [76]. Este patrón de tinción persiste durante todo el proceso de espermiogénesis y se acompaña de la transformación de manchette de una estructura en forma de cono en las primeras espermátidas a una banda en el extremo distal del núcleo en las espermátidas más maduras. Este hallazgo sugiere su papel en la promoción de la conformación nuclear a través de una interacción con la manchette. También se encontró que KIFC1 se asocia con el factor de importación nuclear importina β y nucleoporina NUP62 en espermátidas de ratón [73]. Esta asociación está regulada por el desarrollo, ya que aparece después del inicio de la elongación del núcleo y depende de la pequeña GTPasa Ran [73]. Por lo tanto, KIFC1 puede unir el núcleo a la manchette a través de su interacción con la importina β y NUP62, por lo que KIFC1 se mueve a lo largo de la manchette y ejerce su poder sobre la superficie nuclear para promover su elongación. Además, KIFC1 se distribuyó en el núcleo de espermátidas redondas. Este patrón indica que KIFC1 puede ser responsable del transporte citoplásmico-nuclear a través de la importina β [73], que a su vez es responsable de la transformación de proteínas nucleares de transición en protamina para promover la condensación y elongación nuclear durante la espermiogénesis del ratón. Otro homólogo de KIFC1 se clonó en Pulpo tankahkeei testículo y se demostró que desempeña un papel durante la espermiogénesis [77]. La proteína KIFC1 inició su expresión en la espermátide temprana y se asoció con los microtúbulos perinucleares y la envoltura nuclear en las espermátidas alargadas y finalmente se enriquece en un extremo de la espermátide final. El patrón de expresión y distribución de la proteína KIFC1 indicó que está implicada en el núcleo del esperma, muy probablemente, uniendo los microtúbulos perinucleares tipo manchette con el núcleo y ayudando al tráfico nucleocitoplasmático de cargas específicas [77]. Por tanto, KIFC1 se conserva en la conformación nuclear durante la espermiogénesis tanto de ratones como de cefalópodos.

KIF17b es un miembro de la familia de la kinesina-2, que es la isoforma testicular específica del cerebro KIF17. KIF17b puede funcionar de manera independiente de los microtúbulos. En este caso, la PKA puede regular la actividad de KIF17b a través de la fosforilación, lo que le permite desplazarse entre los compartimentos nuclear y citoplasmático durante la espermiogénesis del ratón [78]. En el alargamiento de las espermátidas, KIF17b se localizó en la manchette para promover la conformación nuclear en un modo tradicional dependiente de microtúbulos [79]. Además, Spatial, como carga de KIF17b en la diferenciación de espermátidas, se localizó en el flagelo naciente opuesto al acrosoma en la etapa final de las espermátidas de rata.Este hallazgo sugiere un papel de KIF17b en la formación del flagelo y el transporte intraflagelar (IFT) [80]. También se ha descubierto que otra subunidad de kinesina-2, KIF3A, desempeña un papel crucial en la organización de las manchitas y la formación de la cabeza de los espermatozoides, en la que se observaron manchettes anormalmente largos y cabezas típicas malformadas, con forma de protuberancia y alargadas en espermátidas de ratón con KIF3A knockout (KO). [81].

Formación de cola de esperma y kinesina

Para la mayoría de las especies de mamíferos, otra estructura notable formada en el esperma es el flagelo. Esta estructura presenta cuatro fracciones distintas: la pieza de conexión, la pieza intermedia, la pieza principal y la pieza final corta [82]. El axonema flagelar representa la primera estructura de la cola formada durante la espermiogénesis, que se origina en la superficie celular de uno de los dos centríolos y luego se extiende hacia afuera hacia la luz tubular. Al final de la espermiogénesis, el flagelo desarrolla estructuras citoesqueléticas accesorias únicas a lo largo del axonema central. Estos se conocen como las fibras densas externas (ODF). En la pieza principal, se forma una estructura citoesquelética única, la vaina fibrosa, que rodea el axonema, que distingue la cola del esperma de los flagelos o cilios simples [82]. Además, la pieza intermedia es una región muy distinta que contiene una vaina mitocondrial helicoidal que rodea el ODF y el axonema [83]. Durante la formación de la pieza intermedia, aparece un punto de constricción conocido como anillo [84, 85]. Esta estructura separa el compartimento periaxonémico de membrana estrecha y larga de la mayor parte del citoplasma de la espermátide [86]. La mitocondria inicialmente rodea la membrana plasmática y luego migra a la ODF. Entonces se vuelve accesible a la futura región de la pieza intermedia. En los espermatozoides maduros, las mitocondrias parecen estar conectadas al ODF por estructuras proteínicas, que se conocen colectivamente como retículo submitocondrial (SMR) [87, 88]. Además de KIFC1, KIFC5, CHO, KIF17b y otras quinesinas que se encuentran en la región de la cola [64, 76, 80, 86], KLC3 y KIF3B también demuestran una asociación extremadamente estrecha con la formación de la cola de los espermatozoides y su mantenimiento estructural.

El axonema de la cola del espermatozoide se asemeja a los cilios en que ambos están organizados por IFT, que utiliza proteínas motoras para transportar cargas a lo largo de los dobletes de microtúbulos axonemales [81]. La subunidad de kinesina-2 KIF3A se ha observado en los flagelos de espermatozoides maduros y en la parte media del erizo de mar. Strongylocentrus droebachiensis y el dólar de arena Echinarachnius parma [89]. En un modelo de ratón KIF3A KO específico de células germinales masculinas, se pudieron recolectar pocos espermatozoides maduros y la fertilidad masculina se inhibió por completo como resultado de la falla en el desarrollo del axonema. Este hallazgo sugiere el papel indispensable del IFT mediado por KIF3A en la formación de axonemas de ratón [81].

KLC3 es un miembro de la familia de la kinesina-1. Es la única cadena ligera de kinesina conocida expresada en células germinales masculinas posmeióticas. Contiene una repetición de heptada conservada característica (HR) que se une a la cadena pesada de kinesina (KHC) [90, 91] y repeticiones de péptido tetratrico en tándem (TPR) que pueden mediar interacciones de proteínas en otras proteínas [92]. En los testículos del ratón, las proteínas KLC3 se expresan exclusivamente en espermátidas redondas y alargadas. Muestran un patrón de tinción discontinuo en la pieza intermedia [71]. También se ha propuesto que KLC3 está implicado en la formación de la pieza intermedia de la cola del espermatozoide de ratón, donde su acumulación en la pieza intermedia de la cola del esperma consiste en un axonema, un ODF y una vaina mitocondrial [71]. KLC3 muestra un patrón de distribución similar al de Odf1 y Odf2 en la cola de esperma de rata. Puede unirse a ODF a través de la región HR ya las mitocondrias usando la región TPR [93]. KLC3 se asocia con las mitocondrias durante la espermiogénesis de la rata cuando las mitocondrias se reubican y se adhieren a la ODF en la futura pieza intermedia de la cola del esperma [83]. Cuando las mitocondrias se mueven desde la membrana plasmática a la pieza intermedia en desarrollo, KLC3 puede servir como vehículo para materiales estructurales o en la fijación de estructuras subcelulares [83]. KLC3 luego ancla las mitocondrias a ODF a través de su unión a los dominios repetidos de leucina en forma de cremallera de ODF1, un componente de ODF, a través de su HR, un motivo en forma de cremallera de leucina [93]. Los espermatozoides de mamíferos maduros también mostraron un marcaje específico de KLC3 alrededor de la ODF y en el SMR rico en proteínas [86]. Por lo tanto, KLC3 puede desempeñar múltiples funciones independientes en el desarrollo de la cola de los espermatozoides.

Translocación de kinesina y espermátide

El epitelio seminífero está físicamente dividido en dos compartimentos, los compartimentos basal y apical, por la barrera epitelial de células de Sertoli (también conocida como barrera sangre-testículo), donde las células madre espermatogoniales, espermatogonias tipo A y tipo B residen en el compartimento basal de el epitelio seminífero. Esto ocurre mientras las células germinales, incluidos los espermatocitos y las espermátidas, se transportan a través del epitelio durante el ciclo epitelial [94]. Las espermátidas se unen a las células de Sertoli a través de la ES, que es una unión de adhesión especializada ubicada en la superficie alargada de Sertoli / espermátide [95]. Las espermátidas también se transportan de un lado a otro a través del epitelio seminífero hasta que se alinean en el borde de la luz del túbulo en el estadio VIII para prepararse para su liberación en la espermiación [96]. Se ha planteado la hipótesis de que las proteínas motoras del ES interactúan con los microtúbulos adyacentes de las células de Sertoli y, por tanto, impulsan el transporte de las placas de unión junto con las espermátidas adheridas [95]. Entre estos motores, KIF20, como una kinesina que se encuentra en el EE de los testículos de rata y ratón, se ha considerado un motor candidato responsable del posicionamiento de la adhesión de las espermátidas y de la translocación de las espermátidas alargadas en el epitelio seminífero [97]. Se descubrió previamente que la proteína KRP3 relacionada con la kinesina se expresaba en el epitelio seminífero de la rata y se localizaba en las cabezas de las espermátidas y las células de Sertoli [98]. Como motor dirigido al extremo positivo, se supone que transporta las espermátidas en alargamiento hacia la parte basal del epitelio de una manera dependiente de los microtúbulos. El transporte de células germinales a través del epitelio seminífero es crucial para el éxito de la espermatogénesis, y KIF20 y KRP3 son dos buenos candidatos para transportadores de espermátidas.

Transcripción de kinesina y espermátide

La espermatogénesis es un proceso notablemente complejo que requiere el ajuste fino de un gran número de genes específicos de la línea germinal [99]. Durante este proceso, la actividad transcripcional posmeiosis que comienza en las espermátidas tempranas es crítica para las alteraciones dramáticas que ocurren en las estructuras nucleares y citoplasmáticas [100].

Entre todos los componentes transcripcionales, el modulador de elemento sensible al AMPc (CREM) es un regulador transcripcional crucial para la maduración de la espermátide, como lo demuestran los espermatozoides anormales encontrados en ratones, que tienen una deleción dirigida de su activador ACT [101]. Se ha demostrado que KIF17b, como cinesina específica de las células germinales, participa en este proceso de muchas formas [102]. De una manera novedosa independiente de los microtúbulos, puede regular directamente la transcripción dependiente de CREM determinando la ubicación subcelular de ACT [103]. Además, KIF17b transporta algunos de los ARNm regulados por CREM desde el núcleo al citoplasma en células germinales posmeióticas de mamíferos, lo que se logra formando un complejo de ribonucleoproteína con la proteína de unión a ARN TB-RBP [104]. KIF17b también se encuentra en los cuerpos cromatoides de las espermátidas redondas, actuando como motor molecular que impulsa su motilidad a lo largo de los microtúbulos y como transportador de elementos transcripcionales específicos dentro y fuera de los cuerpos cromatoides [105]. En el cuerpo cromatoide, KIF17b promueve la carga de ARN en el cuerpo cromatoide mediante la interacción con MIWI, la proteína de unión al ARN citoplásmico específica de células germinales [105].


Motilidad bidireccional de las proteínas motoras kinesin-5: determinantes estructurales, funciones acumulativas y roles fisiológicos

Las proteínas motoras bipolares de quinesina-5 mitótica realizan funciones esenciales en la dinámica del huso mitótico mediante la reticulación y el deslizamiento de los microtúbulos antiparalelos (MT) dentro del huso mitótico. Dos estudios recientes han indicado que moléculas individuales de Cin8, el Saccharomyces cerevisiae homólogo de kinesina-5, se dirigen menos al final cuando se mueven en MT individuales, pero cambian de direccionalidad bajo ciertas condiciones experimentales (Gerson-Gurwitz et al., EMBO J 30: 4942–4954, 2011 Roostalu et al., Science 332: 94– 99, 2011). Este hallazgo fue inesperado ya que el dominio motor catalítico de Cin8 está ubicado en el extremo N-terminal de la proteína, y anteriormente se pensaba que tales quinesinas eran exclusivamente dirigidas al extremo positivo. Además, las funciones intracelulares esenciales de los motores de kinesina-5 en la separación de los polos del huso durante la mitosis solo pueden lograrse mediante una motilidad dirigida al extremo positivo durante el deslizamiento antiparalelo de los MT del huso. Por lo tanto, el mecanismo y el posible papel fisiológico de la motilidad menos dirigida al final de los motores de kinesina-5 siguen sin estar claros. Los estudios experimentales y teóricos de varios laboratorios en los últimos años han identificado motores de kinesina-5 adicionales que son bidireccionales, han revelado determinantes estructurales que regulan la direccionalidad, han examinado los posibles mecanismos involucrados y han propuesto roles fisiológicos para la motilidad menos dirigida de los motores de kinesina-5. . Aquí, resumimos nuestra comprensión actual de la notable capacidad de ciertos motores kinesin-5 para cambiar de direccionalidad cuando se mueven a lo largo de MT.

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Introducción

Los oligodendrocitos, el tipo de células gliales mielinizantes del sistema nervioso central (SNC), extienden numerosos procesos de membrana que contactan y envuelven los axones con mielina para facilitar la conducción rápida y eficiente de los impulsos nerviosos y mantener la integridad de los axones. La mielina es una membrana especializada compuesta de lípidos y proteínas específicos que se forma solo dentro de los procesos que entran en contacto con los axones y no en otras partes de la célula (Simons y Trotter, 2007). La formación localizada de mielina requiere, al menos en parte, el transporte activo de componentes de mielina. Por ejemplo, los ARNm que codifican la proteína básica de mielina (MBP) se acumulan en los procesos de oligodendrocitos, donde se traducen (Colman et al., 1982 Trapp et al., 1987). Los experimentos realizados en células cultivadas indicaron que el transporte depende de los microtúbulos, que están orientados con sus extremos positivos en la proximidad de la membrana celular, y de las cinesinas, proteínas motoras que mueven la carga en los filamentos de microtúbulos hacia el extremo positivo (Ainger et al., 1993 Carson et al., 1997 Song et al., 2003). De acuerdo con esto, la mutación del pez cebra kif1b, que codifica una kinesina, interrumpida mbp El transporte de ARN y provocó la formación ectópica de la membrana de mielina (Lyons et al., 2009).

El motor principal para el transporte de carga dirigido hacia el extremo negativo en los microtúbulos es la dineína citoplasmática, un complejo proteico de múltiples subunidades. La dineína citoplasmática funciona en numerosos procesos celulares, incluida la clasificación endosómica, la autofagia, la división celular y la migración celular (Eschbach y Dupuis, 2011). Además, la dineína citoplasmática tiene un papel bien caracterizado en el transporte de cargas desde los extremos distales de los axones hacia los cuerpos celulares neuronales (Zweifel et al., 2005 Cosker et al., 2008). En principio, la dineína podría funcionar de manera similar en los oligodendrocitos, transportando material desde las puntas distales de los procesos en contacto con los axones hasta el soma celular. Otro posible papel de la dineína en los oligodendrocitos es promover la extensión del proceso o la envoltura del axón, porque la dineína en la corteza celular puede estabilizar los extremos más microtúbulos y atarlos a la periferia celular, lo que potencialmente proporciona fuerza sobre el citoesqueleto en relación con la membrana celular (Hendricks et al. ., 2012). De acuerdo con ambas posibilidades, los experimentos de inmunolocalización realizados en oligodendrocitos cultivados revelaron una concentración de dineína citoplásmica dentro de los procesos periféricos (King et al., 1996). Finalmente, nuestra reciente demostración de que las células de Schwann requieren dineína citoplásmica para la mielinización de los nervios periféricos (Langworthy y Appel, 2012) planteó la posibilidad de que la dineína también sea necesaria para la mielinización del SNC. Sin embargo, no se han informado investigaciones funcionales de la dineína citoplasmática en oligodendrocitos y se desconocen sus posibles funciones en la mielinización del sistema nervioso central.

Para identificar los genes necesarios para la mielinización, realizamos pruebas de detección de mutaciones que interrumpen el desarrollo de la glía en el pez cebra. Aquí informamos el análisis de un nuevo alelo mutante de dync1h1, que codifica la subunidad de la cadena pesada de la dineína citoplasmática. dync1h1 los mutantes tienen graves déficits de mielina del SNC, que resultan de los efectos combinados de un déficit de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC), falta de formación de vainas de mielina normales en los axones y un déficit de la expresión del gen de la mielina. Algunos pacientes humanos con dominantes DYNC1H1 Las mutaciones han sido diagnosticadas con discapacidad intelectual y retraso cognitivo, que se asocian con malformaciones corticales (Vissers et al., 2010 Weedon et al., 2011 Harms et al., 2012 Willemsen et al., 2012 Poirier et al., 2013). Nuestros resultados plantean la posibilidad de que las mutaciones que alteran la función de la dineína citoplasmática también contribuyan al desarrollo anormal del cerebro y al déficit cognitivo a través de la alteración de la mielinización.


Transporte y difusión de la proteína Tau en neuronas.

En células muy polarizadas y alargadas, como las neuronas, la proteína Tau debe entrar y descender por el axón para cumplir su tarea biológica de estabilizar los microtúbulos axonales. Por lo tanto, se necesitan sistemas celulares para distribuir moléculas de Tau. Esta revisión analiza diferentes mecanismos que se han propuesto para contribuir a la dispersión de moléculas Tau en neuronas. Incluyen (1) transporte dirigido a lo largo de microtúbulos como carga de complejos de tubulina y / o proteínas motoras, (2) difusión, ya sea a través del espacio citosólico oa lo largo de los microtúbulos, y (3) mecanismos basados ​​en ARNm como el transporte de ARNm de Tau a los axones y traducción local. La difusión a lo largo de la red de microtúbulos oa través del citosol parecen ser los principales mecanismos para la distribución axonal de la proteína Tau en el rango corto a intermedio en distancias de hasta un milímetro. Los altos coeficientes de difusión aseguran que Tau pueda distribuirse uniformemente por todo el volumen axonal así como a lo largo de los microtúbulos. El transporte de Tau dependiente de proteínas motoras domina en distancias y escalas de tiempo más largas. A niveles bajos casi fisiológicos, Tau es co-transportado junto con microtúbulos cortos desde los cuerpos celulares a los axones por miembros de la familia citoplasmática de dineína y quinesina a velocidades de transporte axonal lento.

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Ver el vídeo: La neurona y sus partes (Junio 2022).


Comentarios:

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