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Cómo comprobar si un archivo fastq tiene lecturas finales únicas o emparejadas

Cómo comprobar si un archivo fastq tiene lecturas finales únicas o emparejadas


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Estoy tratando de verificar si un archivo fastq tiene lecturas finales únicas o emparejadas. ¿Cómo puedo lograr esto con un método a prueba de errores?

Revisé wikipedia y MAQ, pero quiero saber si existe un documento confiable que describa todas las variantes posibles en la ID de secuencia para verificar las lecturas finales individuales / emparejadas.

Estoy buscando también una biblioteca, mejor en Python, para lograr esto.

Gracias


A estas alturas obtuve algunas respuestas interesantes en esta pregunta sobre Biostars

Básicamente lo que hice fue lo siguiente:

  • En primer lugar, verifiqué si el ID de secuencia contiene una notación final emparejada. Como se describe en esta página de wikipedia, para las lecturas de Illumina hay dos posibles anotaciones para las lecturas finales individuales / emparejadas:

    @ HWUSI-EAS100R: 6: 73: 941: 1973 # 0/1

    Si el último número es/2en algunas lecturas, las lecturas se emparejan al final; de lo contrario, pueden ser de un solo extremo.

    La segunda notación es:

    @ EAS139: 136: FC706VJ: 2: 2104: 15343: 197393 1: Y: 18: ATCACG

    Si el primer número del segundo grupo es2en algunas lecturas, las lecturas se emparejan al final; de lo contrario, pueden ser de un solo extremo;

  • Luego busqué varios archivos. Si una muestra tiene dos archivos fastq, es probable que las lecturas estén emparejadas al final. Sin embargo, hay que tener en cuenta que con un solo archivo no es posible excluir que las lecturas finales emparejadas se puedan intercalar en un solo archivo, incluso si no es común (en mi opinión);

  • El método más general es verificar cada una de las lecturas con el conjunto completo de lecturas. Si la primera parte del ID de secuencia (en este caso, el campo que comienza en@y termina antes del#- en la primera notación - o el espacio en blanco - en la segunda notación) es único entre todas las lecturas (para cada lectura) es probable que las lecturas sean lecturas únicas, de lo contrario - si se puede encontrar un duplicado para cada lectura - las lecturas están emparejados al final. En este caso, en sistemas * nix se puede lograr con el siguiente comando (gracias a las respuestas de biostars):

    grep --no-filename @ HWUSI-EAS100R: 6: 73: 941: 1973 * .fastq | cut -d "-f1 | sort | uniq -c | sort -rgk 1,1 | head

    Si el resultado muestra en las primeras líneas un resultado como este:

    1 read1_ID

    1 read2_ID

    Es probable que sea de un solo extremo. De lo contrario:

    2 read1_ID

    2 read2_ID

    es un extremo emparejado.

Leí la documentación de la API de BioPython pero no puedo encontrar algo útil para hacerlo.

Se aceptan sugerencias y correcciones.

Gracias


Esta es una respuesta complementaria a lo que @ gc5 proporcionó.

para los casos que utilizan "la segunda notación", que se parece a:

@ EAS139: 136: FC706VJ: 2: 2104: 15343: 197393 1: Y: 18: ATCACG '^ | ________________ lo que estamos tratando de extraer

El siguiente código revisará todos los archivos de forma iterativa y producirá una salida por archivo:

grep -P "^ @" * .fastq | grep -oP " s  d +" | ordenar | uniq -c

o si tienes.fastq.gzarchivos:

zgrep -e "^ @" * .fastq.gz | grep -oP " s  d +" | ordenar | uniq -c

si tiene un solo extremo, solo verá unos y si tiene un extremo emparejado, verá unos y dos. Además, como prueba de cordura, puede ver cuántos de cada uno tiene:

zgrep --max-count = 10000 -e "^ @" * .fastq.gz | grep -oP " s  d +" | ordenar | uniq -c
6333652 1 6333652 2

Nota que agregué--máx-recuento = 10000al último. Esto es particularmente útil si tiene pares de extremos en archivos separados, ya que obtendrá todos los uno del otro y todos los dos del otro. Esto solo pasará por las primeras 10'000 líneas, lo que hace que este one-liner sea mucho más rápido.


Cómo verificar si un archivo fastq tiene lecturas finales únicas o emparejadas - Biología

La tecnología de secuenciación de Illumina utiliza la generación de grupos y la secuenciación por química de síntesis (SBS) para secuenciar millones o miles de millones de grupos en una celda de flujo, según la plataforma de secuenciación. Durante la química de SBS, para cada grupo, el software Real-Time Analysis (RTA) del instrumento realiza y almacena las llamadas de base para cada ciclo de secuenciación. RTA almacena los datos de llamadas de base en forma de archivos de llamadas de base individuales (o BCL). Cuando se completa la secuenciación, las llamadas de base en los archivos BCL deben convertirse en datos de secuencia. Este proceso se denomina conversión de BCL a FASTQ.

Un archivo FASTQ es un archivo de texto que contiene los datos de secuencia de los clústeres que pasan el filtro en una celda de flujo (para obtener más información sobre los clústeres que pasan el filtro, consulte la sección "información adicional" de este boletín). Si las muestras se multiplexaron, el primer paso en la generación de archivos FASTQ es demultiplexando. La demultiplexación asigna clústeres a una muestra, en función de las secuencias de índice del clúster. Después de la demultiplexación, las secuencias ensambladas se escriben en archivos FASTQ por muestra. Si las muestras no se multiplexaron, el paso de demultiplexación no ocurre y, para cada línea de celda de flujo, todos los grupos se asignan a una sola muestra.

Para una ejecución de lectura única, se crea un archivo FASTQ de lectura 1 (R1) para cada muestra por carril de celda de flujo. Para una corrida de extremo emparejado, se crea un archivo FASTQ R1 y un archivo Read 2 (R2) para cada muestra para cada carril. Los archivos FASTQ se comprimen y se crean con la extensión * .fastq.gz.

¿Qué aspecto tiene un archivo FASTQ?

Para cada clúster que pasa el filtro, se escribe una secuencia única en el archivo R1 FASTQ de la muestra correspondiente y, para una ejecución de fin de emparejamiento, también se escribe una secuencia única en el archivo R2 FASTQ de la muestra. Cada entrada en un archivo FASTQ consta de 4 líneas:

  1. Un identificador de secuencia con información sobre el experimento de secuenciación y el clúster. El contenido exacto de esta línea varía según el software de conversión de BCL a FASTQ utilizado.
  2. La secuencia (la base llama A, C, T, G y N).
  3. Un separador, que es simplemente un signo más (+).
  4. Las puntuaciones de calidad de la llamada base. Estos están codificados en Phred +33, utilizando caracteres ASCII para representar los puntajes de calidad numéricos.

A continuación, se muestra un ejemplo de una sola entrada en un archivo R1 FASTQ:

Puede encontrar información más detallada sobre el formato de archivo de secuencia FASTQ aquí.

Cómo ver un archivo FASTQ

Los archivos FASTQ pueden contener hasta millones de entradas y pueden tener un tamaño de varios megabytes o gigabytes, lo que a menudo los hace demasiado grandes para abrirlos en un editor de texto normal. Por lo general, no es necesario ver los archivos FASTQ, porque son archivos de salida intermedios que se utilizan como entrada para las herramientas que realizan análisis posteriores, como la alineación con una referencia o un ensamblaje de novo.

Si necesita ver un archivo FASTQ para solucionar problemas o por curiosidad, necesitará un editor de texto que pueda manejar archivos muy grandes o acceso a un sistema Unix o Linux donde los archivos grandes se pueden ver a través de la línea de comandos.

Cómo generar archivos FASTQ

La generación de archivos FASTQ es el primer paso para todos los flujos de trabajo de análisis utilizados por MiSeq Reporter en MiSeq y Local Run Manager en MiniSeq. Cuando se completa el análisis, los archivos FASTQ se encuentran en la carpeta & ltrun & gt Data Intensities BaseCalls en MiSeq y en la carpeta & ltoutput & gt Alignment _ # & ltsubfolder & gt Fastq en MiniSeq.

Para todas las ejecuciones cargadas en BaseSpace Sequence Hub, la generación de archivos FASTQ se produce automáticamente después de que la ejecución se haya cargado por completo, y los archivos FASTQ se utilizan como entrada para las diversas aplicaciones de análisis en BaseSpace Sequence Hub. En BaseSpace Sequence Hub, puede encontrar sus archivos FASTQ en los proyectos asociados con su ejecución.

El software de conversión bcl2fastq se puede utilizar para generar archivos FASTQ a partir de los datos generados en todos los sistemas de secuenciación actuales de Illumina.

Para obtener información sobre las diferentes configuraciones que se pueden aplicar durante la generación de archivos FASTQ, consulte las guías de usuario del software a continuación.


Ahora nos adentramos en un preprocesamiento real. Usaremos fastq-mcf para recortar el adaptador de nuestras lecturas y hacer un filtrado de calidad. Necesitamos recortar el adaptador, porque si un fragmento es lo suficientemente corto, secuenciaremos todo el fragmento hasta el adaptador. Obviamente, la secuencia del adaptador no se encuentra en el genoma y puede evitar que la lectura se alinee correctamente. Para hacer el recorte, necesitamos generar un archivo adaptador.

El primer paso es obtener la secuencia del adaptador. Podemos obtener esto del manual, pero las secuencias de un PDF pueden recoger caracteres extraños, por lo que es mejor obtener las secuencias del adaptador de la Hoja de muestra de Primer.

Podemos descargar y mostrar la hoja de muestra usando curl:

Queremos las secuencias de adaptadores de la hoja de muestra:

Ahora tenemos que hacer que el archivo del adaptador esté en formato FASTA.

Vaya a scratch / bioinf_intro / myinfo

Haga clic en el menú "Archivo" de jupyter y seleccione "Abrir".

Cuando se abra la nueva ventana / pestaña del navegador, haga clic en la pestaña "Archivos" si aún no está activa.

Haga clic en el símbolo de "inicio" para ir al directorio de nivel superior, luego haga clic en "myinfo"

En el menú "Nuevo", seleccione "Archivo de texto".

En este archivo de texto, pegue las líneas del adaptador de arriba.

También queremos incluir el complemento inverso del adaptador, en caso de que la contaminación del adaptador según la secuencia sea el complemento inverso de lo que se proporciona. La forma más sencilla de hacerlo es utilizar https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html para generar el complemento inverso y, a continuación, ponerle un nombre como "Adapter_RC".

Ahora limpie asegurándose de que ...

Cada secuencia está en su propia línea

Cada secuencia tiene un nombre en la línea anterior.

El nombre de la secuencia está precedido por "& gt"

Deben eliminarse todas las comas y espacios, y los caracteres que no son de secuencia deben eliminarse de las líneas de secuencia. Ahora debería verse así:

Haga clic en "untitled.txt" para cambiar el nombre del archivo a "neb_e7600_adapters.fasta"


Secuenciación Paired-End frente a secuenciación de lectura única

Comprender las diferencias clave entre estos tipos de lectura de secuenciación

¿Qué es la secuenciación de extremos emparejados?

La secuenciación de extremos emparejados permite a los usuarios secuenciar ambos extremos de un fragmento y generar datos de secuencia alineables de alta calidad. La secuenciación de extremos emparejados facilita la detección de reordenamientos genómicos y elementos de secuencia repetitiva, así como fusiones de genes y transcripciones novedosas.

Además de producir el doble de lecturas por el mismo tiempo y esfuerzo en la preparación de la biblioteca, las secuencias alineadas como pares de lectura permiten una alineación de lectura más precisa y la capacidad de detectar variantes de inserción-deleción (indel), lo cual no es posible con lectura única datos. 1 Todos los sistemas de secuenciación de próxima generación (NGS) de Illumina son capaces de secuenciación de extremo emparejado.

¿Qué es la secuenciación de extremos emparejados?

Aspectos destacados de la secuenciación de extremos emparejados

  • Bibliotecas simples de extremo emparejado: El flujo de trabajo simple permite la generación de rangos únicos de tamaños de plaquita
  • Uso eficiente de la muestra: Requiere la misma cantidad de ADN que la secuenciación de ADN genómico o ADNc de lectura única
  • Amplia gama de aplicaciones: No requiere metilación de ADN ni digestión por restricción, se puede utilizar para secuenciación de bisulfito.
  • Análisis de datos simple: Permite ensamblajes de secuencia de alta calidad con bibliotecas de inserción corta. Una simple modificación del proceso estándar de preparación de bibliotecas de lectura única facilita la lectura de las hebras de plantilla directa e inversa de cada grupo durante una lectura de extremo emparejado. Ambas lecturas contienen información posicional de largo alcance, lo que permite una alineación muy precisa de las lecturas.
Introducción a la secuenciación de Illumina

Esta descripción general describe los principales avances en la tecnología de secuenciación, los métodos clave, los conceptos básicos de la química de secuenciación de Illumina y más.

Secuenciación de ADN de extremos emparejados

Las lecturas de secuenciación de ADN de extremos emparejados proporcionan una alineación de alta calidad en las regiones de ADN que contienen secuencias repetitivas y producen contigs largos para de novo secuenciación llenando los vacíos en la secuencia de consenso. La secuenciación de ADN de extremos emparejados también detecta reordenamientos comunes del ADN, como inserciones, deleciones e inversiones.

Métodos de secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN se puede aplicar a regiones pequeñas y específicas o al genoma completo a través de una variedad de métodos.

Longitud de lectura de secuenciación

La elección de la longitud de lectura de secuenciación correcta depende del tipo de muestra, la aplicación y los requisitos de cobertura. Aprenda a calcular la longitud de lectura correcta para su ejecución de secuenciación.

Secuenciación de ARN de extremos emparejados

La secuenciación de ARN de extremos emparejados (RNA-Seq) permite aplicaciones de descubrimiento como la detección de fusiones de genes en el cáncer y la caracterización de nuevas isoformas de empalme. 2

Para RNA-Seq de extremo emparejado, use los siguientes kits con un protocolo de fragmentación alternativo, seguido de la generación y secuenciación de clúster de extremo emparejado estándar de Illumina.

Para la preparación de la biblioteca de ARNm-Seq, utilice:
Para la preparación de la biblioteca de ARN total trenzado, use:
Descripción general de RNA-Seq

Este método ofrece una vista de alta resolución de las regiones codificantes y no codificantes del transcriptoma para una comprensión más profunda de la biología.

NGS está revelando el misterioso mundo de los microbios

Los investigadores están utilizando 16sRNA para investigar los genomas de los microbios y mejorar nuestra comprensión de la salud humana, las enfermedades y la evolución microbiana.

Secuenciación de lectura única

La secuenciación de lectura única implica secuenciar el ADN de un solo extremo y es la forma más sencilla de utilizar la secuenciación de Illumina. Esta solución ofrece grandes volúmenes de datos de alta calidad, de forma rápida y económica. La secuenciación de lectura única puede ser una buena opción para ciertos métodos, como la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina o RNA-Seq pequeña (ChIP-Seq).

Preparación de la biblioteca

Las soluciones de preparación de bibliotecas integrales e innovadoras son una parte clave del flujo de trabajo de secuenciación de Illumina.

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Referencias
  1. Nakazato T, Ohta T, Bono H. Minería funcional basada en diseño experimental y caracterización de datos de secuenciación de alto rendimiento en el archivo de lectura de secuencia. Más uno. 20138 (10): e77910.
  2. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: una herramienta revolucionaria para la transcriptómica. Nat Rev Genet. 200910:57–63.

Tecnologías innovadoras

En Illumina, nuestro objetivo es aplicar tecnologías innovadoras al análisis de la variación y función genética, haciendo posible estudios que ni siquiera eran imaginables hace tan solo unos años. Para nosotros es fundamental ofrecer soluciones innovadoras, flexibles y escalables para satisfacer las necesidades de nuestros clientes. Como empresa global que otorga un gran valor a las interacciones colaborativas, la entrega rápida de soluciones y la prestación del más alto nivel de calidad, nos esforzamos por afrontar este desafío. Las tecnologías innovadoras de secuenciación y matriz de Illumina están impulsando avances revolucionarios en la investigación de las ciencias de la vida, la genómica traslacional y del consumidor y el diagnóstico molecular.

Para uso exclusivo en investigación. No para uso en procedimientos de diagnóstico (excepto cuando se indique específicamente).


Cómo verificar si un archivo fastq tiene lecturas finales únicas o emparejadas - Biología

NGmerge: fusionar lecturas de extremo emparejado y eliminar adaptadores de secuenciación

Gaspar JM. BMC Bioinformática. 2018 Dic 2019 (1): 536. [PubMed] [BMC] [PDF]

NGmerge opera en lecturas de secuencia de alto rendimiento de extremo emparejado en dos modos distintos (Fig. 1).

En el modo de puntada predeterminado, NGmerge combina lecturas de extremos emparejados que se superponen en una sola lectura que abarca la longitud completa del fragmento de ADN original (Fig. 1A). Los extremos de la lectura combinada están definidos por los extremos 5 'de las lecturas originales. Las lecturas que fallan en el proceso de unión (debido a una falta de superposición suficiente o errores de secuenciación excesivos) se colocan en archivos de salida secundarios, si el usuario los requiere.

El modo alternativo de extracción del adaptador devuelve las lecturas originales como pares, eliminando los 3 'salientes de aquellas lecturas cuya alineación cosida válida tiene esta característica (Fig. 1B). Las lecturas cuyas alineaciones no tengan dichos voladizos (o no se alineen en absoluto) también se imprimirán en los archivos de salida, sin modificar.

Figura 1. Modos de análisis de NGmerge. Los diagramas muestran las lecturas de los extremos emparejados (R1, R2) derivadas de la secuenciación de fragmentos de ADN (recuadros blancos) con adaptadores de secuenciación (recuadros grises) en cada extremo.

  • sample_R1.fastq.gz, sample_R2.fastq.gz (archivos de secuencia paired-end para una muestra)
  • NGmerge (descargado y compilado como se describe a continuación)

Para producir lecturas cosidas (Fig. 1A): sample_merged.fastq.gz

Para producir lecturas sin adaptadores (Fig. 1B): sample_noadapters_1.fastq.gz y sample_noadapters_2.fastq.gz

El software se puede descargar desde GitHub. (¡y ya estás aquí! ¡felicidades!)

Se proporciona un Makefile para la compilación con GCC, y también se requieren zlib y OpenMP. El programa ha sido probado después de la compilación con GCC 6.3.0, zlib 1.2.8 y OpenMP 4.0.

Para compilar, ejecute make en la carpeta en la que se descargó el software. Debería producirse el ejecutable NGmerge.

En cualquier modo de análisis (Fig. 1), NGmerge evalúa todas las posibles alineaciones sin espacios de un par de lecturas al intentar encontrar una óptima. Las determinaciones de qué alineaciones se consideran, y luego qué alineación (si alguna) es válida y óptima, se realizan de acuerdo con varios parámetros: -m, -p, -d, -e y -s.

NGmerge comienza alineando un par de lecturas (R1, R2) de manera que se cumpla el parámetro de superposición mínima (-m, por defecto 20 pb). Luego verifica cada posible alineación de las lecturas hasta que se superponen sin salientes de 3 '(Fig. 2A). Si se selecciona la opción -d (o en el modo de extracción del adaptador [-a, que establece automáticamente -d]), NGmerge evalúa adicionalmente las alineaciones en cola de milano (con voladizos de 3 '), hasta la longitud mínima establecida por el parámetro -e ( Figura 2B).

Figura 2. Alineaciones consideradas por NGmerge. A: Las alineaciones predeterminadas van desde aquellas con la longitud mínima de superposición (establecida por -m), hasta superposiciones completas sin voladizos. B: Cuando se selecciona la opción -d, NGmerge también evalúa las alineaciones en cola de milano.

Para cada alineación, NGmerge calcula el desajuste de fracciones (el número de desajustes entre las lecturas de R1 y R2, dividido por la longitud de superposición). Las alineaciones con valores calculados que no superen el umbral establecido por el parámetro -p (predeterminado 0,10) se consideran válidas. Si se encuentran múltiples alineaciones válidas, se selecciona la que tenga el menor desajuste de fracciones como alineación óptima. En casos excepcionales en los que varias alineaciones tienen discordancias de fracciones idénticas, se prefiere la más larga de forma predeterminada (a menos que se establezca -s). En todos estos cálculos, las bases ambiguas (N) no se consideran coincidencias ni desajustes.

A continuación se proporcionan más descripciones de estos parámetros.

NGmerge analiza las lecturas de extremos emparejados no alineados en formato FASTQ. Los archivos de entrada se pueden comprimir con gzip. Se pueden especificar varios conjuntos de archivos de entrada, separados por comas (o separados por espacios, entre comillas).

Los archivos de entrada deben enumerar las lecturas en el mismo orden. El programa requiere que los encabezados de las lecturas emparejadas coincidan, al menos hasta el primer carácter de espacio.

Un archivo de entrada de lecturas intercaladas se puede analizar sin especificar un archivo -2. Además, es posible leer desde stdin usando -, p. Ej. -1 -.

Dado que las lecturas combinadas están definidas por los extremos 5 'de las alineaciones de las lecturas emparejadas (Fig. 1A), se debe tener cuidado con el recorte de calidad de las lecturas en esos extremos. Por ejemplo, cuando se usa un programa como qualTrim, se debe especificar -3 para garantizar que el recorte de calidad se produzca solo en los extremos 3 ', antes de usar NGmerge.

El archivo de salida principal en el modo de puntada es el archivo de lecturas combinadas, en formato FASTQ. Es posible escribir en stdout con -o - (ver también -y, más abajo).

Cuando se especifique, todas las lecturas que fallaron en el procedimiento de combinación se escribirán en los archivos de salida, tal como aparecían en las entradas originales.

De forma predeterminada, todos los archivos de salida de FASTQ se comprimirán con gzip si y solo si los archivos de entrada lo están (con varios conjuntos de archivos de entrada, las salidas se comprimirán si cualquiera de los primeros conjuntos de entradas lo está). Especificar -z garantizará que las salidas estén comprimidas con gzip, mientras que -y garantizará que no lo estén, independientemente de los formatos de las entradas. Tenga en cuenta que todas las salidas comprimidas con gzip tendrán automáticamente '.gz' anexado a sus nombres de archivo, si es necesario.

En el modo de puntada, esto se aplica solo a la salida opcional de -f (arriba). En lugar de dos salidas, se producirá una única salida intercalada (y no se agregará el sufijo '.fastq' al nombre del archivo).

Este archivo de registro enumera lo siguiente para cada par de lectura en los archivos de entrada:

Leer leer encabezado, sin incluir @
OverlapLen longitud total de la superposición de lectura, incluidas Ns NA si las lecturas no se fusionaron (y las columnas restantes se dejan en blanco)
CosidoLen longitud total de la lectura combinada
Discordancia fracción de bases no coincidentes (recuento de discrepancias dividido por la longitud de superposición [sin incluir Ns]) debe ser menor o igual al valor -p (ver más abajo)

Este archivo de registro enumera lo siguiente para cada par de lectura cuya alineación válida óptima tiene voladizos de 3 ':

Leer leer encabezado, sin incluir @
Adaptador_R1 3 'de voladizo de lectura de R1 - si no hay voladizo
Adaptador_R2 3 'voladizo de lectura de R2 - si no hay voladizo

Las columnas están etiquetadas como 'Adaptador' porque, si las lecturas no se recortaron en sus extremos 5 ', estas secuencias adicionales deberían ser adaptadores. Si las secuencias que aparecen en las columnas 'Adaptador' no son consistentes, pueden ser falsos positivos y se debe considerar disminuir -p o aumentar -e.

Para cada par de lecturas que se fusionaron con éxito, este archivo de registro enumera las alineaciones de las secuencias de lecturas y los puntajes de calidad, junto con la secuencia combinada resultante y los puntajes de calidad. Por ejemplo:

Ésta es la longitud mínima de superposición (en pb) para alineaciones válidas de un par de lecturas (ver Fig. 2A). Tenga en cuenta que las bases ambiguas (N) no cuentan para esta longitud mínima.

Este parámetro determina qué tan estricta es la evaluación de una alineación. El valor debe estar en el intervalo [0, 1), y los valores más bajos equivalen a un mayor rigor. Especificar -p 0 significa que solo las alineaciones perfectas (sin desajustes) son válidas; el valor predeterminado de 0.10 significa que una alineación válida puede tener como máximo un 10% de desajustes (calculado como el número de desajustes dividido por la longitud de superposición [sin contar Ns]) ).

Cuando se selecciona esta opción, se evaluarán las alineaciones en las que el extremo 3 'de una lectura se extiende más allá del extremo 5' de su par, hasta una longitud mínima (ver Fig. 2B). Por defecto, tales alineaciones ni siquiera se consideran. Dado que la lectura combinada está definida por las lecturas originales en los extremos '5', los voladizos de 3 'se eliminan automáticamente. Estos voladizos, que suelen ser adaptadores, se pueden imprimir en un archivo de registro separado (consulte -c, más arriba).

Esta es la longitud mínima de superposición (en pb) para alineaciones con voladizos de 3 '(ver Fig. 2B). Este valor debe establecerse en la longitud del fragmento de ADN más corto absoluto que pueda haber sido secuenciado. El uso de un valor demasiado bajo puede generar falsos positivos, especialmente si las lecturas contienen secuencias repetitivas.

Dadas múltiples alineaciones válidas con puntajes de discordancia de fracciones idénticas, NGmerge seleccionará la lectura cosida más larga de forma predeterminada. Con -s, se preferirá la lectura cosida más corta.

Opciones de perfil de puntuación de calidad

De forma predeterminada, NGmerge utiliza perfiles codificados de forma rígida al determinar los puntajes de calidad de las bases superpuestas. Hay perfiles separados para los casos en los que la base R1 y la base R2 coinciden, y para cuando no coinciden. Quienes no deseen utilizar estos perfiles tienen dos opciones alternativas:

Con esta opción, NGmerge utilizará los perfiles de puntuación de calidad en el archivo proporcionado. El archivo debe enumerar dos matrices de valores separados por comas o tabulaciones que siguen las líneas de encabezado #match y #mismatch. Se debe seguir la plantilla del archivo qual_profile.txt dado, que imita los perfiles codificados de NGmerge con el rango de puntuación de calidad de [0, 40].

Con esta opción, NGmerge utilizará un método similar al del programa fastq-join. En los casos en los que la base R1 y la base R2 coinciden, se utiliza la puntuación de calidad más alta para la base fusionada. Cuando no coinciden, el puntaje de calidad de la base fusionada se calcula como la diferencia entre los dos puntajes de calidad.

Esta opción debe especificarse para que NGmerge se ejecute en modo de eliminación del adaptador. Como se indica, establece automáticamente la opción -d para verificar si hay alineaciones en cola de milano.

El formateo de los archivos de entrada se describe arriba.

En el modo de eliminación del adaptador, todas las lecturas se imprimen en los archivos de salida. Las únicas modificaciones son el recorte de los voladizos 3 'de las lecturas cuyas alineaciones tienen tales voladizos.

Con esta opción, en lugar de dos salidas, se producirá una única salida intercalada (y no se agregará el sufijo '.fastq' al nombre del archivo).

Estas opciones se describen arriba.

Este archivo de registro se describe arriba.

En el modo de extracción del adaptador, los siguientes archivos no poder producido:

Estos parámetros se describen arriba.

Como se señaló anteriormente, la opción -d se establece automáticamente en el modo de extracción del adaptador.

Para reducir el tiempo de cálculo, se puede ejecutar NGmerge en varios núcleos a través de esta opción. Tenga en cuenta que la compresión y descompresión de gzip no están paralelizadas, por lo que los ahorros computacionales no son lineales.

Estos dos parámetros establecen el rango de puntuaciones de calidad para los archivos FASTQ de entrada. Los valores predeterminados coinciden con el formato Sanger, con puntuaciones de calidad en el rango [0, 40] que abarcan valores ASCII [33, 73].

En lugar de imprimir alineaciones completas, el archivo de registro especificado por -j enumerará los detalles de las discrepancias: el encabezado de lectura, la posición y la puntuación base y de calidad para las lecturas R1 y R2. Esto es útil para calcular tasas de error separadas para coincidencias y discrepancias.

  • NGmerge no puede comprimir con gzip varios archivos de salida que son stdout. Por ejemplo, lo siguiente producirá un error:
    • -o - -a sin -i
    • -f - sin -a y sin -i


    Cómo ordenar archivos fastq para alinear las lecturas finales emparejadas usando BWA.

    Estoy tratando de alinear las lecturas finales emparejadas usando BWA, pero dado que los archivos fastq no están & # x27t ordenados, se queja de que & quot; las lecturas emparejadas tienen nombres diferentes & quot. Así: & quotM01628: 49: 000000000-D06TG: 1: 1102: 25364: 18377 & quot, & quotM01628: 49: 000000000-D06TG: 1: 1101: 16377: 1698 & quot

    ¿Existe una herramienta conveniente para ordenar o tengo que crear un script para hacer esto?

    Una lectura de muestra se ve así:

    Sí, ya miré los principales resultados de búsqueda antes de publicar la pregunta. Desafortunadamente, no lo clasificó correctamente y esa es la razón por la que me preguntaba si había una herramienta o un método alternativo para esto.

    ¿Están sus lecturas en archivos fastq intercalados o en archivos fastq divididos? Si las lecturas están intercaladas, hay algunas respuestas en Google que desentrelazarán sus archivos por usted. Si las lecturas ya están divididas en un archivo mate1 y mate2, con un poco de Python o Perl puede ordenar fácilmente los archivos correctamente con acceso a suficiente memoria RAM. Probablemente no sea el método más eficiente, pero si desea algo que pueda escribir muy rápidamente y solo necesite usar para obtener sus resultados, este será el truco.

    Cree una lista de lecturas utilizando BioPython SeqRecords

    Ordene las listas por identificaciones de lectura 3a) Itere a través de ambas listas, extrayendo 1 lectura de cada lista. 3b) Compare los ID de lectura (no olvide el / 1 y / 2 o el identificador único para las lecturas mate1 y mate2) 3c) Si se encuentra una coincidencia, escriba la lectura mate1 en su archivo mate1 ordenado y la lectura mate2 su archivo mate2 ordenado. (Es mejor tener listas mate1_paired y mate2_paired que use como búferes. Luego, escriba en su archivo cada vez que obtenga 10k o 50k lecturas en los búferes que vaciará después de escribir y comenzará a llenar nuevamente. Vuelva al paso 3a. 3d) Si no se encuentra ninguna coincidencia, tome el id de lectura inferior y añádalo al búfer de id de lectura singleton para escribir en el archivo de lectura singleton. 3e) Extraiga una nueva lectura de la lista de lectura de la que proviene la lectura singleton y repita los pasos 3b-3e hasta encontrar una coincidencia

    Cuando haya terminado, tendrá los archivos mate1_sorted.fq y mate2_sorted.fq que ahora deberían estar perfectamente ordenados entre sí. También tiene un archivo singleton.fq que contiene lecturas que perdieron su par en algún momento entre la secuenciación y el paso de mapeo.

    Dicho esto, no use BWA para mapear lecturas a menos que no tenga otra opción. El desarrollador es bien conocido por su trabajo en el mapeo de lectura corta, el programa en sí nunca te da lo que realmente quieres. Analizar los datos de BWA es una de las cosas más tediosas que he tenido que hacer con los datos de NGS. Recomiendo encarecidamente usarlo solo si las herramientas que está utilizando ya están configuradas para trabajar con la salida de BWA directamente. De lo contrario, busque en BBMAP sus necesidades de mapeo de lectura breve. Se enamorará de la flexibilidad de las opciones y formatos de entrada y salida. Las estadísticas que puedes pedirle que genere como parte de la carrera son increíbles y solo hace lo que quieres.


    Trimmomatic

    Trimmomatic es una herramienta popular para recortar secuencias de adaptadores de lecturas de Illumina. El manual de Trimmomatic describe cómo instalar esta aplicación, cómo ejecutarla y describe todos los parámetros de línea de comando requeridos y opcionales. Si decide utilizar Trimmomatic para recortar secuencias de adaptadores de lecturas de Illumina, un comando mínimo que solo realiza recortes de adaptadores puede verse así:

    • La mayoría de las ejecuciones de secuenciación utilizan lecturas de extremo emparejado, por lo que especificamos & # 8220PE & # 8221 en la línea de comando.
    • Para acelerar la aplicación, especificamos el número de subprocesos a utilizar, hasta el número máximo de subprocesos de procesador disponibles.
    • Siempre hay dos archivos FASTQ en una ejecución paired-end: un archivo para las lecturas directas y un archivo para las lecturas inversas. Especificamos ambos archivos en la lista de parámetros.
    • Para cada archivo leído, especificamos el nombre de un archivo de salida emparejado y un archivo de salida no emparejado.
    • Las secuencias del adaptador están contenidas en un archivo con formato FASTA. El parámetro ILLUMINACLIP especifica el nombre de este archivo. Este parámetro también requiere tres campos adicionales: seedMismatches, palindromeClipThreshold, simpleClipThreshold. Consulte el manual para obtener más información sobre cómo configurar estos tres campos.

    En nuestro ejemplo, utilizando el kit de preparación de la biblioteca Nextera XT, el archivo & # 8220adapters.fasta & # 8221 se vería así:

    Este es un archivo con formato FASTA estándar. El primer registro contiene el carácter de intercalación a la derecha seguido de una cadena arbitraria. El segundo registro contiene la secuencia del adaptador. Este archivo puede contener múltiples secuencias de adaptadores usando un formato de archivo multi-FASTA. Los archivos de salida de Trimmomatic mostrarán qué lecturas (si las hay) se recortaron.


    Solo se necesitan dos cambios menores para ejecutar fastq-mcf en datos emparejados, necesitamos decirle que también cargue el archivo de lectura 2, y también cómo llamar a la salida recortada de este archivo.

    1. neb_adapters.fasta
    2. r1.8A_pilot.fq.gz
    3. r2.8A_pilot.fq.gz: NUEVO para datos emparejados
    4. -q 20
    5. -x 0,5
    6. -o r1.8A_pilot.trim.fastq.gz
    7. -o r2.8A_pilot.trim.fastq.gz: NUEVO para datos emparejados

    Nota: Ahora que, dado que ahora incluimos las lecturas inversas, ahora se observa contaminación con el adaptador universal


    Darencard / extract_fastq_bam.md

    A veces, los datos de FASTQ se alinean con una referencia y se almacenan como un archivo BAM, en lugar de los archivos de lectura normales de FASTQ. Esto está bien, porque es posible volver a crear archivos FASTQ sin procesar basados ​​en el archivo BAM. A continuación se describe este proceso. Se requieren el útil software samtools y bedtools.

    De cada bam, necesitamos extraer:

    1. lee eso mapeado correctamente como pares
    2. lecturas que no se mapearon correctamente como pares (ambas no se mapearon o una no se mapeó)

    Para el # 1, el siguiente comando funcionará. Esto fue tomado de esta página web.

    El filtro -f y -F utiliza indicadores en la columna 2 del archivo BAM. Estos no siempre son intuitivos y no los describiré más aquí, pero puede usar esta útil herramienta para comprender mejor. También tenga en cuenta que el indicador -u crea una salida BAM sin comprimir en lugar de una salida BAM comprimida predeterminada, por lo que los archivos serán más grandes. Esto ayuda a una lectura más rápida en los pasos posteriores, pero no es necesario incluirlo si desea ahorrar espacio en el disco. samtools es súper rápido de cualquier manera.

    Resolver el n. ° 2 es más complicado, ya que hay tres formas en que una lectura podría no haberse mapeado como un par adecuado. UNA. La primera lectura se asignó, pero la lectura emparejada no. B. La primera lectura no se asignó, pero la lectura emparejada sí. C. Ninguno de los dos pares de lecturas se asignó en absoluto. Nuevamente, las banderas se usarán para filtrar el archivo BAM original. Esta información se encontró en esta página web.

    Como era de esperar, debe fusionar los tres archivos que contienen al menos un par sin asignar.

    A continuación, estos archivos BAM deben reordenarse para que estén ordenados por ID de lectura en lugar de por ubicación en la referencia.

    En este momento, es una buena idea comprobar que tiene el número correcto de lecturas y que no hay redundancia. Puede resumir el archivo BAM original para tener una idea de dónde comenzó.

    Observe el número total de lecturas de entrada que se encuentra en la primera línea. Desea asegurarse de que el número de lecturas asignadas y sin asignar sume este número. Es fácil de verificar usando los siguientes comandos.

    Tenga en cuenta que una lectura emparejada se cuenta como dos lecturas aquí. If you sum these two numbers, they should equal the number you noted above, as they do here.

    If all is good, you can now extract the FASTQ reads into two paired read files, as follows.

    And then it also makes sense to combine both the first and paired reads together from the mapped and unmapped files.

    These two files should now have the same number of reads that are exactly as you would have received them if they had come directly from the sequencer as FASTQ.

    Please also note that all of the commands above can be piped together in bash using | , which will save on disk space and time. So it is best to combine commands where possible.


    NextSeq 500

    The NextSeq 500 is different from the other Illumina sequencers in two important ways that impact the FASTQ files it generates.

    The NextSeq 500 has 4 lanes. Each lane gets the same sample or pool, but they are imaged by different cameras. Therefore, the data is tagged with lane numbers 1 to 4. However, the data in each file is for the same sample and represents distinct set of fragments for the sample. We generally keep these files separate, but not always.

    The NextSeq 500 sequences the second read of a dual-indexed library in the reverse direction from the other sequencers. We reverse complement the second barcode in the file name, but not in the FASTQ deflines.

    So for example, a barcode pair TAAGGCGA and TAGATCGC would be sequenced as TAAGGCGA and GCGATCTA . The defline for a read would contain TAAGGCGA-GCGATCTA but we would rename the FASTQ file to TAAGGCGATAGATCGC .


    Ver el vídeo: Bioinformática - Clase 7 - Formato FASTA y Alineamiento de Secuencias (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Bedver

    Es interesante. ¿No me preguntará dónde puedo encontrar más información sobre esta pregunta?

  2. Burghere

    ¡No te enfades! ¡Más diversión!

  3. Charleston

    Estas equivocado. Puedo probarlo. Escribe en PM, hablaremos.

  4. Tormod

    Qué palabras ... fenomenal

  5. Royce

    Ahora todo está claro, muchas gracias por su ayuda en este asunto. ¿Como puedo agradecerte?

  6. Banbhan

    El punto de vista competente, cognitivamente.

  7. Escanor

    Todavía recuerdas el siglo XVIII



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