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Adición de la vía de propionil-CoA a E. coli

Adición de la vía de propionil-CoA a E. coli


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Así que estoy tratando de simular la producción de ácido 3-hidroxipropiónico con E. coli a través de la vía propionil-CoA. Sin embargo, no estoy muy seguro de cómo va la producción en el camino. Tengo la siguiente imagen:

Si lo entiendo correctamente, la ruta es: Acetil-Coa -> Propionato -> Propionil-CoA ->… -> 3-HP Al agregar estas reacciones en Cobra, ¿los coeficientes estequiométricos son siempre solo 1?


Fuente de la figura: Luo H, Zhou D, Liu X, Nie Z, Quiroga- Sánchez DL, Chang Y (2016) Producción de ácido 3-hidroxipropiónico a través de la vía propionil-CoA usando recombinante Escherichia coli Son. PLoS ONE 11 (5): e0156286. doi: 10.1371 / diario. teléfono.0156286


Si lo entiendo correctamente, la ruta va: Acetil-CoA -> Propionato -> Proprionil-CoA ->… -> 3-HP

No exactamente. La primera reacción es: $ propionato + acetil textrm-CoA rightarrow propionyl textrm-CoA + acetato $ El grupo CoA se transfiere de acetato a propionato. Las siguientes reacciones son una oxidación a acriloil-CoA y una hidratación posterior a 3-HP-CoA. Por último, el grupo CoA se transfiere de nuevo al acetato.

El propionato es una molécula de 3 carbonos y también lo es 3-HP. Entonces, los coeficientes estequiométricos de 1 parecen lógicos.


Propionil-CoA: succinato CoA transferasa

& ltp> La puntuación de la anotación proporciona una medida heurística del contenido de la anotación de una entrada o proteoma de UniProtKB. Esta puntuación & ltstrong> no puede & lt / strong> utilizarse como una medida de la precisión de la anotación, ya que no podemos definir la 'anotación correcta' para una proteína determinada. & Ltp> & lta href = '/ help / annotation_score' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> - Evidencia experimental a nivel de proteína i & ltp> Esto indica el tipo de evidencia que respalda la existencia de la proteína. Tenga en cuenta que la evidencia de 'existencia de proteínas' no brinda información sobre la precisión o corrección de las secuencias mostradas. & Ltp> & lta href = '/ help / protein_existence' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p>

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Abstracto

Hemos informado previamente en vivo biosíntesis de poliésteres que contienen 2-hidroxiácido, incluido el ácido poliláctico (PLA), poli (3-hidroxibutirato)co-lactato) [P (3HB-co-LA)] y poli (3-hidroxibutirato-co-2-hidroxibutirato-co-lactato) [P (3HB-co-2HB-co-LA)] empleando modificados metabólicamente Escherichia coli cepas por la introducción de evolucionado Clostridium propionicum propionil-CoA transferasa (PctCp) y Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polihidroxialcanoato (PHA) sintasa 1 (PhaC1PD6–19). En este estudio, diseñamos aún más en vivo Sistema de biosíntesis de PLA en E. coli para sintetizar PHA que contiene 2HB, en el que se utilizó propionil-CoA como precursor del 2-cetobutirato que se convirtió en 2HB-CoA por las acciones secuenciales de Lactococcus lactis (d) -2-hidroxibutirato deshidrogenasa (PanE) y PctCp y luego 2HB-CoA fue polimerizado por PhaC1PD6–19. El recombinante E. coli XL1-azul que expresa el phaC1437 gen, el pct540 gen, y el Ralstonia eutropha prpE gen junto con el cristal gen podría cultivarse a 0,66 g / L y producir con éxito P (70% en moles de 3HB-co-18% en moles de 2HB-co-12% en moles de LA) hasta un contenido de PHA del 66% en peso a partir de 20 g / L de glucosa, 2 g / L de 3HB y 1 g / L de propionato de sodio. Eliminación de la prpC gen en el cromosoma de E. coli XL1-blue podría aumentar la fracción molar de 2HB en el copolímero, pero el contenido de PHA disminuyó.

La estrategia de ingeniería metabólica informada aquí sugiere que la propionil-CoA puede usarse con éxito como precursor para proporcionar PHA sintasa con 2HB-CoA para la producción de PHA que contienen monómero 2HB.


El poli (3-hidroxipropionato) [poli (3HP)] es un monómero prometedor de la familia de polihidroxialcanoatos (PHA) de propiedades materiales similares a otros PHA de cadena corta (SCL) como el poli (3-hidroxibutirato) [poli (3HB)]. Es un poliéster bien caracterizado, biodegradable, biocompatible y tiene excelentes propiedades mecánicas como alta flexibilidad, alta resistencia a la tracción y alta rigidez, pero más estable que el ácido poliláctico (Andree & # x00DFen et al., 2010, 2014b). La biosíntesis de homopolímeros de poli (3HP) saltó a la fama en 2010, utilizando glicerol como fuente de carbono en una fermentación de dos pasos por lotes alimentados y demostró ser un plástico alternativo prometedor derivado de la petroquímica.

En medio siglo, el glicerol, un subproducto de la producción de biodiesel, se ha convertido en una fuente común de carbono para varias investigaciones biotecnológicas en el mundo. Debido a la contaminación ambiental asociada con la industria petroquímica que da como resultado el cambio climático y las reservas fósiles sobreexplotadas, es necesario utilizar enfoques biológicos a través de la ingeniería metabólica para producir muchos productos químicos a partir de fuentes no renovables utilizando materias primas baratas y abundantes (Keasling, 2010).

La efectividad y el éxito de la producción biológica de una plataforma química como el ácido 3-hidroxipropoico (3-HP) dependen del desarrollo de fábricas de células microbianas, lo que impulsa investigaciones vigorosas y extensas realizadas en diversos campos, como la biosíntesis, la amplificación de genes, la ingeniería de enzimas, diseño del circuito genético, edición del genoma, bioinformática, evolución adaptativa de laboratorio, multiómica usando huéspedes adecuados y rutas biosintéticas de microorganismos a través del proceso llamado & # x201CDesign-Build-Test-Learn (DBTL) & # x201D ciclos (Li et al., 2012 Abatemarco et al., 2013 Cheong et al., 2015 Wu et al., 2016). Además, para comercializar estos procesos a través de rutas biosintéticas efectivas para lograr productos económicamente viables, los biosensores deben construirse en una ruta metabólica adecuada, optimizada para producir resultados deseables (Liu et al., 2015a).

Con el fin de aumentar los rendimientos de PHA a través de la biotecnología sintética y la ingeniería metabólica, se han utilizado biosensores de metabolitos para detectar y monitorear un metabolito objetivo. en vivo por cribado de alto rendimiento (HTS) (Eggeling et al., 2015). Aunque los artículos de revisión anteriores han discutido algunas vías biosintéticas, materiales y características químicas del poli (3HP) (Andree & # x00DFen et al., 2014b Chang et al., 2018), sin embargo, esta revisión analiza ampliamente y actualizadas las vías metabólicas que pueden utilizarse para producir poli (3HP) a partir de glicerol y glucosa. El documento también se centra en el anfitrión de producción, el uso de biosensores de malonil-CoA para optimizar el rendimiento, la evaluación del ciclo de vida para la producción de poli (3HP) utilizando aceite de maíz como fuente de carbono y las propiedades físicas y químicas. Finalmente, destacaremos algunas aplicaciones del poli (3HP).

Los polihidroxialcanoatos son clases de poliésteres intracelulares lineales de almacenamiento de bacterias alifáticas de alto peso molecular, que son termoplásticos biocompatibles y biodegradables en dióxido de carbono y agua por muchos microorganismos (Zhang et al., 2018). Las propiedades físicas o materiales de los PHA son similares a las de los plásticos derivados del petróleo, pero exhiben algunas características diferentes que van desde la fragilidad hasta la flexibilidad y elasticidad, como se muestra en la Tabla 1 (Muhammadi et al., 2015). La exposición de los polímeros PHA de características como elasticidad, flexibilidad, biodegradabilidad y renovabilidad depende en gran medida de estos factores, a saber (1) sus vías de producción de biosíntesis (Masood et al., 2014), (2) composición monomérica (Luzi et al. , 2019) y (3) estructura química (Bugnicourt et al., 2014).

Tabla 1. Comparación de las propiedades termodinámicas del poli (3-HP) en comparación con otros copolímeros de PHAs.

Además, la producción de PHA actualmente no es económica en comparación con la de plásticos sintéticos. Para que la producción de PHA bacterianos sea rentable, se deben abordar algunos factores críticos, como el cribado y la selección de cepas bacterianas potenciales (Kumar et al., 2016, 2020), vías de síntesis, herramientas y tecnologías avanzadas (Mo & # x017Cejko- Ciesielska y Mostek, 2019), fuente de carbono y nitrógeno (Zahari et al., 2014) y procesos rentables aguas abajo (Koller y Braunegg, 2018). La aplicación intencionada de las PHA también es un factor crucial que determina su importancia y economía (Chen et al., 2017 Cao et al., 2019).

Muchos investigadores han canalizado su interés en la producción de PHA recientemente debido a las fuentes de carbono de bajo costo como sustrato y al peligroso problema asociado con la eliminación de desechos plásticos de un solo uso (Chen y Patel, 2012).

Anteriormente, la polimerización por apertura de anillo (ROP) de & # x03B2-propiolactona y la condensación de éster 3-HP eran los procesos químicos para sintetizar poli (3HP). No ha habido evidencia de un organismo natural capaz de sintetizarlo (Wang et al., 2012, 2013 Heinrich et al., 2013).

Sin embargo, el poli (3HP) no era comercialmente factible de producir en grandes cantidades porque la & # x03B2-propiolactona como sustrato tiene propiedades cancerígenas (Dunn, 2012 Dunn et al., 2016). 3-HP, que tiene baja cristalinidad, es un precursor ideal que forma un constituyente para varios copolímeros como poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato) [poli (3HB-co-3HP)] o poli (3-hidroxipropionato- co-4-hidroxibutirato) [Poli (3HP-co-4HB)] (Zhou et al., 2011 Wang et al., 2013).

El ácido 3-hidroxipropoico, el acrilato y el 1,3-propanodiol (1,3-PDO) se utilizaban previamente como precursores dependientes para la biosíntesis de poli (3HP) y copolímero que contiene 3-HP (Gao et al., 2014). Sin embargo, estos precursores costosos y la vitamina B12 aumento del costo de producción de poli (3HP), lo que lo hace económicamente inviable.

Se construyeron rutas artificiales para la biosíntesis de poli (3HP) a partir de fuentes de carbono económicas como glucosa y glicerol sin la adición de precursores para remediar los desafíos que surgen de los altos costos de producción (Andree & # x00DFen et al., 2010). Sin embargo, solo 13 mg / L de poli (3HP) fue producido por recombinante Escherichia coli cepa usando glucosa como sustrato. Andree & # x00DFen et al. (2010) produjeron 1,42 mg / L de poli (3HP) por conversión de glicerol utilizando un recombinante E. coli cepa portadora de glicerol deshidratasa de Clostridium buytricum DhaB1Cb, propionaldehído deshidrogenasa de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium LT2 (PduPSe), y el gen PHA sintasa de Ralstonia eutropha HI6 (PhaC1Re) en un proceso de fermentación por lotes de dos pasos (Andree & # x00DFen et al., 2010).


RESULTADOS

Identificación del gen putativo mesaconil-CoA hidratasa.

Trabajos previos sobre la nueva vía de asimilación del acetato en R. sphaeroides identificó un gen esencial que codifica una enzima del (R) -enoil-CoA hidratasa de la familia (2). Se encontraron genes similares en otras bacterias que tienen en común con R. sphaeroides la ausencia de un ciclo de glioxilato funcional para la asimilación del acetato. Sin embargo, la identidad de secuencia general de estas proteínas con el miembro caracterizado de esta denominada familia MaoC o FkbR2, ​​una R-3-hidroxiacil-CoA deshidratasa específica de Aeromonas caviae (18), está solo en el rango de 20 & # x00025. Además, la masa molecular esperada de la enzima codificada es de aproximadamente 38 kDa, que es mayor que las masas de las enoil-CoA hidratasas normales (14 a 28 kDa). Se encontró un gen similar en C. aurantiacus junto al gen que codifica la l-malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa. Los productos genéticos de C. aurantiacus y R. sphaeroides tenía 58 & # x00025 secuencias de aminoácidos idénticas. Mostraron dos dominios de hidratasa, que exhibieron solo una identidad de 25 & # x00025 en el nivel de aminoácidos. Normalmente, las enoil-CoA hidratasas contienen solo uno de esos dominios. Esto sugiere la duplicación de genes y también explica el tamaño más grande de las subunidades en comparación con otras hidratasas enoil-CoA.

Clonación y expresión.

El putativo 1.06-kb Cloroflexo gen mesaconil-CoA hidratasa codificado para una proteína de 38 kDa (352 aminoácidos), y el gen de 1.02 kb Rhodobacter gen codificado para una proteína de 37 kDa (343 aminoácidos). Los genes de ambas bacterias se amplificaron y los productos de PCR esperados se clonaron en el vector de expresión pET16b, lo que resultó en la codificación de His N-terminal.10-proteínas marcadas con masas moleculares alteradas de aproximadamente 40 kDa. Ambos plásmidos se transformaron en E. coli DH5 & # x003b1 y luego transformado en E. coli BL-21 (DE3) para expresión. Como control, también se transformó el vector de expresión sin inserto. Ambos genes se expresaron de forma heteróloga y las enzimas eran solubles, como se deduce de una banda de proteína inducida alrededor de 40 kDa en SDS-PAGE de la fracción celular soluble (Fig. & # X200B (Fig. 22).

PAGE desnaturalizante (12.5 & # x00025) de varios pasos de purificación de mesaconil-CoA hidratasa expresada heterólogamente de C. aurantiacus y R. sphaeroides de extractos de 3 g E. coli células. Carriles 1 y 7, estándares de masa molecular carriles 2 a 4, Cloroflexo carril de enzima 2, extracto (100,000 & # x000d7 gramo sobrenadante) de inducido E. coli células (proteína 45 & # x003bcg) carril 3, fracción de precipitación térmica (proteína 20 & # x003bcg) carril 4, fracción de cromatografía de afinidad (proteína 8 & # x003bcg) carriles 5 y 6, Rhodobacter carril de enzima 5, extracto (100,000 & # x000d7 gramo sobrenadante) de inducido E. coli células (proteína 30 & # x003bcg) carril 6, fracción de cromatografía de afinidad (proteína 8 & # x003bcg). El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R-250.

Ensayo enzimático espectrofotométrico.

La l-malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa recombinante de C. aurantiacus se utilizó en un ensayo espectrofotométrico acoplado para convertir enzimáticamente propionil-CoA y glioxilato en & # x003b2-metilmalil-CoA, el sustrato de la mesaconil-CoA hidratasa / & # x003b2-metilmalil-CoA deshidratasa postulada. La transformación adicional de & # x003b2-metilmalil-CoA en otros tioésteres de coenzima A se probó con E. coli extractos que contienen mesaconil-CoA hidratasa supuesta sobreproducida. Ambos extractos, que contenían el Cloroflexo o la Rhodobacter producto génico, catalizó una reacción que se asoció con un aumento de la absorbancia por encima de 260 nm, con un máximo en torno a 284 nm. Debido a que la absorción de proteínas interfería en esta longitud de onda, usamos 290 nm para seguir la reacción espectrofotométricamente (Fig. & # X200B (Fig. 3). 3). La reacción dependió de propionil-CoA, glioxilato y 1 -malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa. Por el contrario, los extractos de tipo salvaje E. coli o de E. coli que llevaban el plásmido sin un inserto estaban inactivos.

Espectros UV de la coenzima A ( .._.. ), propionil-CoA (& # x02014), & # x003b2-metilmalyl-CoA (& # x02014), y el producto de la reacción de la hidratasa, mesaconil-CoA ( & # x02026 & # x02026. ). Los espectros se registraron en 40 mM K2HPO4/ tampón de ácido fórmico, pH 4,2, y se normalizaron a la misma absorción a 260 nm.

Confirmación de la actividad enzimática transformadora de & # x003b2-metilmalil-CoA.

El análisis por HPLC reveló que se consumió casi por completo la & # x003b2-metilmalil-CoA y se formó un nuevo producto (Figura & # x200B (Figura 4). 4). En equilibrio, la relación entre las concentraciones de & # x003b2-metilmalil-CoA y el producto era cercana a 1:10. El producto todavía tenía la característica máxima de absorbancia de nucleótidos de adenina de 260 nm de CoA, propionil-CoA o & # x003b2-metilmalil-CoA. Sin embargo, tenía un hombro de absorbancia adicional a longitudes de onda más largas (Fig. & # X200B (Fig.3). 3). El coeficiente de absorción molar estimado de 290 nm de este producto (probablemente mesaconil-CoA) fue de 2,350 M & # x022121 cm & # x022121, el del sustrato & # x003b2-metilmalyl-CoA fue de 200 M & # x022121 cm & # x022121 , y el de propionil-CoA fue de aproximadamente 200 M & # x022121 cm & # x022121. Esta estimación se basa en el supuesto de que los coeficientes de absorción molar a 260 nm (& # x0025b260) del sustrato y el producto son muy similares a los de los ésteres de CoA normales, como el acetil-CoA (16.400 M & # x022121 cm & # x022121 a modo de comparación, el & # x0025b260 de CoA es 16.800 M & # x022121 cm & # x022121) (11). El & # x00394 & # x0025b290 (mesaconil-CoA menos & # x003b2-metilmalil-CoA) de 2150 M & # x022121 cm & # x022121 se utilizó para cuantificar el consumo de & # x003b2-metilmalil-CoA y la reacción de formación de producto en el ensayo espectrofotométrico.

Separación por HPLC de [14 C] mesaconil-CoA como el producto de la mesaconil-CoA hidratasa de [14 C] & # x003b2-metilmalil-CoA y [14 C] propionil-CoA. [14 C] & # x003b2-metilmalil-CoA se forma enzimáticamente a partir de [14 C] propionil-CoA y glioxilato con l-malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa recombinante. Se detectaron CoA y sus derivados a 260 nm. Los ácidos libres de los correspondientes tioésteres de CoA se eluyeron entre 2 y 5 min. (A) Antes de la adición de glioxilato a la mezcla de ensayo. (B) Diez minutos después de la adición de glioxilato. (C) Formación de mesaconil-CoA después de otros 10 minutos de incubación con mesaconil-CoA hidratasa recombinante. Las sensibilidades de la detección de 14 C por recuento de centelleo en fase sólida en las diferentes ejecuciones fueron las mismas y, por lo tanto, las señales se pueden comparar directamente. Para conocer las condiciones, consulte Materiales y métodos.

Actividad enzimática en extracto celular de C. aurantiacus.

Usando cantidades excesivas de L-malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa recombinante de C. aurantiacus, concentraciones saturadas de [14 C] propionil-CoA, y un exceso de glioxilato, la actividad específica del sistema enzimático que produjo mesaconil-CoA marcada a partir de propionil-CoA marcada en extracto celular de C. aurantiacus podría estimarse (55 & # x000b0C). La actividad enzimática específica en extractos de células cultivadas autotróficamente ascendió a 20 a 30 nmol min & # x022121 mg de proteína & # x022121, dependiendo del lote de células. La actividad enzimática específica fue de 10 a 15 veces menor en células cultivadas heterotróficamente.

Purificación de enzimas recombinantes.

La mayor parte de la proteína sobreproducida en E. coli estaba en la fracción de células solubles, y la purificación se inició a partir de los 100.000 & # x000d7 gramo flotante. Para el recombinante Cloroflexo enzima, E. coli El extracto se calentó durante 10 min a 70 ° C, la enzima de este termófilo moderado permaneció activa y en el sobrenadante (Figura & # x200B (Figura 2). 2). El sobrenadante (o extracto celular en el caso del recombinante Rhodobacter enzima) luego se cromatografió en una columna de afinidad de alto rendimiento de Ni-Sepharose. Desde 3 g E. coli células (peso húmedo), 6,4 mg de Cloroflexo enzima con un rendimiento de 87 & # x00025 o 4 mg de Rhodobacter Se obtuvo enzima con un rendimiento de 52 & # x00025 (Tabla & # x200B (Tabla 11).

TABLA 1.

Purificación de mesaconil-CoA hidratasa recombinante etiquetada con His de C. aurantiacus y R. sphaeroides de 3 g de E. coli células a

Paso de purificaciónActividad enzimática total (& # x003bcmol min & # x022121)Proteína total (mg)Sp act (& # x003bcmol min & # x022121 mg de proteína & # x022121)Recuperación (& # x00025)Purificación (pliegue)
Extracto celular& # x02212 /10,500& # x02212106& # x02212 /99& # x02212 /100& # x02212 /1
Precipitación de calor9.300 / & # x0221216,5 / & # x02212560 / & # x02212100 / & # x022121 & # x02212
Ni-Sepharose de alto rendimiento8,100/5,5006.4/4.01,300/1,40087/522.3/14.0

Propiedades de las mesaconil-CoA hidratasas.

La actividad específica del Cloroflexo enzima a 55 & # x000b0C fue de 1300 & # x003bcmol min & # x022121 mg & # x022121, y la del Rhodobacter enzima a 30 & # x000b0C fue de 1.400 & # x003bcmol min & # x022121 mg & # x022121. El recambio enzimático por enzima dimérica basado en actividades específicas para el Cloroflexo enzima era 1.700 s & # x022121, y eso para el Rhodobacter enzima fue de 1.900 s & # x022121. Ambas enzimas exhibieron una actividad óptima a pH 7,5 y una actividad media máxima a pH 6,5 y 8,5 (datos no mostrados). Los espectros UV de las enzimas mostraron absorciones solo a 280 nm. SDS-PAGE reveló que las enzimas estaban compuestas por subunidades de aproximadamente 40 kDa. La filtración en gel indicó una masa molecular de las enzimas nativas de aproximadamente 80 kDa, lo que sugiere una estructura homodimérica.

Aislamiento y elucidación de la estructura del producto de la transformación de & # x003b2-metilmalil-CoA marcado con 13C como mesaconil-CoA.

El producto enriquecido con 13 C de la conversión de [1,2, 3-13 C] propionil-CoA y glioxilato por l -malil-CoA / & # x003b2-metilmalil-CoA liasa recombinante y mesaconil-CoA hidratasa recombinante de C. aurantiacus o R. sphaeroides fue analizado por HPLC-MS. El producto tenía una masa molecular virtual de 877,9 Da, determinada por ESI-MS (modo de iones negativos). Esto corresponde a una masa molecular de 878,9 Da, que está cerca del valor esperado de 878,6 Da para mesaconil-CoA.

El producto se aisló por HPLC y se analizó mediante espectroscopía de RMN unidimensional y bidimensional. La mesaconil-CoA se caracterizó mediante señales de RMN de protones a 0,87 ppm (s, 3H, 10 & # x02033 CH3), 1,10 (s, 3H, 11 & # x02033 CH3), 2,26 (ddd, J & # x0003d 130,0 Hz, 5,8 Hz, 1,5 Hz, 3H, & # x0002aCH3 [mesaconilo]), 2,46 (m, 2H, H6 & # x02033), 3,13 (q, J & # x0003d 6,5 Hz, 2H, H9 & # x02033), 3,40 (t, J & # x0003d 6,4 Hz, 2H, H8 & # x02033), 3,51 (t, J & # x0003d 6,8 ​​Hz, 2H, H5 & # x02033), 3,64 (m, 1H, H1 & # x02033A), 4,06 (m, 1H, H1 & # x02033B), 4,11 (s, 1H, H3 & # x02033), 4,32 (s, br, 2H, H5 y # x02032), 4.51 (s, a, 1H, H4 y # x02032), 4.91 (m, 1H, H2 y # x02032), 5.01 (s, a, 1H, H3 y # x02032), 6.16 (d, J & # x0003d 5,8 Hz, 1H, H1 & # x02032), 6,70 (& # x0201ct, & # x0201d br, J & # x0003d 8,0 Hz, 1H [mesaconilo]), 8,24 (s, 1H, H2), 8,61 (s, 1H, H8). Los carbonos enriquecidos con 13 C (C1, C2 y & # x003b1-metilo) de mesaconil-CoA dieron señales a 14,3 ppm (dd, J & # x0003d 42,6 Hz, 2,3 Hz), 149,4 (dd, J & # x0003d 55,5 Hz, 42,6 Hz) y 195,3 (dd, J & # x0003d 55,5 Hz, 2,3 Hz), lo que indica la incorporación de la cadena de carbono enriquecida con 13 C de propionilo intacta. La señal correspondiente en la RMN de protón a 2,26 ppm del grupo metilo enriquecido en 13 C (RMN 13 C, 14,3 ppm) se identificó mediante un experimento de coherencia cuántica única heteronuclear en gradiente. Además, la señal a 6,70 ppm (RMN de protón, & # x003b2-CH) mostró un pico cruzado a las tres señales a 14,3, 149,4 y 195,3 ppm (RMN 13C) en el experimento de correlación de enlaces múltiples heteronucleares, verificando la estructura mesaconil-CoA. La CH2 grupo a 3,13 ppm (RMN de protón) dio un pico cruzado con el carbonilo-C enriquecido con 13 C a 195,3 ppm (RMN 13 C) en el experimento de correlación de enlaces múltiples heteronucleares, verificando que el residuo de CoA estaba unido en C-1 de mesaconil-CoA.


Abstracto

los Escherichia coli El genoma codifica siete parálogos de la superfamilia de la crotonasa (enoil CoA hidratasa). Cuatro de estos tienen funciones desconocidas o inciertas, su existencia era desconocida antes de la finalización de la E. coli proyecto de secuenciación del genoma. El gen que codifica uno de estos, YgfG, se encuentra en un operón de cuatro genes que codifica homólogos de metilmalonil CoA mutasas (Sbm) y acil CoA transferasas (YgfH), así como una supuesta proteína quinasa (YgfD / ArgK). Hemos determinado que YgfG es metilmalonil CoA descarboxilasa, YgfH es propionil CoA: succinato CoA transferasa y Sbm es metilmalonil CoA mutasa. Estas reacciones son suficientes para formar un ciclo metabólico mediante el cual E. coli puede catalizar la descarboxilación de succinato a propionato, aunque se desconoce el contexto metabólico de este ciclo. La identificación de YgfG como metilmalonil CoA descarboxilasa amplía el rango de reacciones catalizadas por miembros de la superfamilia de las crotonasas.

Esta investigación fue apoyada por la Universität Karlsruhe, la Deutsche Forschungsgemeinschaft y el Fonds der Chemischen Industrie (a J.R.) y NIH Grants GM-40570 y GM-52594 (a J.A.G.).

Dirigir correspondencia a este autor. Teléfono: 217-333-3945. Fax: 217-265-0385. Correo electrónico: [email & # 160protected]


Conclusiones y perspectivas de futuro

La comercialización de métodos de producción de combustibles gaseosos de origen biológico es fundamental para respaldar los desafíos globales de realizar suministros de energía renovable y reducir la huella de carbono y otros contaminantes. Se necesitan más investigaciones para desarrollar la producción de alcanos sintonizables en todo el espectro de hidrocarburos de cadena corta a muy larga, convirtiendo eficazmente los microorganismos en los "campos petrolíferos del futuro". Esto satisfará la demanda de mezclar o incluso reemplazar la actual dependencia de los combustibles derivados del petróleo y los precursores sintéticos.

La transición de la investigación de "prueba de principio" a una comercialización exitosa requiere una comprensión detallada de los factores tecnoeconómicos asociados con el escalado de los procesos biológicos. Un estudio reciente sobre el potencial comercial de la producción de gas alcano fermentativo identificó parámetros clave que necesitaban optimización para permitir una producción rentable de combustible, y propuso mitigaciones para superar estas barreras [6]. Estas mitigaciones incluyeron la transición hacia microorganismos industriales robustos que requieren costos de capital y de funcionamiento drásticamente reducidos, abastecimiento de fuentes de energía renovables y de bajo costo, y aumento de los títulos de producción de gas. Esto último es particularmente importante para la producción de alcanos biológicos, ya que se cree que la etapa terminal de deformilación / descarboxilación dependiente de ADO / CvFAP es la etapa limitante de la velocidad.

La identificación de las barreras importantes para el éxito comercial puede ayudar a centrar la investigación adicional, por ejemplo, para mejorar las eficiencias biocatalíticas in vivo, mediante la aplicación de estrategias de evolución o rediseño de enzimas para aumentar las velocidades de reacción, la estabilidad y la expresión dentro de un chasis elegido. El advenimiento de las técnicas de biología sintética permite una optimización más profunda del desarrollo de procesos más allá del rediseño enzimático tradicional. Pueden obtenerse mejoras en la productividad optimizando las partes reguladoras del ADN [74], tanto a nivel transcripcional como traslacional [75, 76], mediante la ingeniería metabólica de vías de suministro auxiliares para aliviar los cuellos de botella y la eliminación o regulación a la baja de reacciones secundarias competitivas. Estas son áreas importantes de optimización de procesos realizadas a través de la bioingeniería, pero la optimización general del proceso será esencial más allá de la necesidad de mejorar las fábricas de células microbianas para la producción de gas bio-alcanos.

La reducción sin precedentes de la actividad económica mundial y la movilidad durante principios de 2020 debido a la pandemia de Covid 19 ha reducido la demanda mundial de energía en un 3,8% con respecto al mismo período de 2019 [77]. A pesar de esto, el suministro de combustibles fósiles sigue siendo limitado y no renovable, con una demanda aún en niveles altos. Por lo tanto, el desarrollo de la bio-fabricación (en última instancia) sostenible de hidrocarburos gaseosos es oportuno, y el éxito se mide por la capacidad de competir en precio y abundancia con las rutas de síntesis comerciales y no renovables existentes.


Materiales y métodos

Cepas y medios

Medios y condiciones de crecimiento para E. coli fueron descritos previamente por Sambrook y Russell (2001) aquellos para Y. lipolytica fueron descritos previamente por Barth y Gaillardin (1997). Se prepararon medio rico (YPD) y medio de glucosa mínima (YNB) como se describe en otra parte (Milckova et al., 2004). El YNB contenía 0,17% (p / v) de base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos y sulfato de amonio, YNBww), 0,5% (p / v) de NH4Cl, 50 mM KH2correos4-N / A2HPO4 (pH 6,8) y glucosa al 2% (p / v). Para complementar las auxotrofías de cepas, se añadieron 0,1 g / L de uracilo o leucina según fuera necesario. Para seleccionar la resistencia a la higromicina, se añadieron 250 & # x003BCg / ml de higromicina al YPD. Los medios sólidos se prepararon añadiendo agar al 1,5% (p / v).

Construcción de plásmidos y cepas (E. coli y Y. lipolytica)

Usamos técnicas genéticas moleculares estándar (Sambrook y Russell, 2001). Las enzimas de restricción se obtuvieron de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.). La amplificación por PCR se realizó en un termociclador Eppendorf 2720 con ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs) o ADN polimerasas GoTaq (Progema, WI, EE. UU.). Los fragmentos de PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR (Macherey-Nagel, Duren, Alemania) y los plásmidos se purificaron con un kit Plasmid Miniprep (Macherey-Nagel).

Los plásmidos utilizados en este estudio se construyeron utilizando el ensamblaje Golden Gate, como se describe en Celinska et al. (2017). Los genes en el módulo A, T y H se obtuvieron mediante PCR utilizando el ADN genómico de Y. lipolytica W29. Los sitios de reconocimiento interno de BsaI se eliminaron mediante PCR utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1. Los plásmidos para cada módulo incluían la secuencia Zeta, la URA3 ex marcador, y casetes de expresión génica que contienen el TEF1 promotor y LIP2 terminador.

Para el complejo PDH citosólico, todos los genes fueron sintetizados y clonados en el plásmido pUC57 por GenScript Biotech (Nueva Jersey, EE. UU.). Citosólico PDX1 se clonó en el plásmido de expresión (JME2563) usando los sitios de restricción BamHI y AvrII. Los otros cuatro genes se clonaron en dos plásmidos (JME4774 y JME4775) usando ensamblaje Golden Gate.

Para interrumpir PHD1, los casetes se construyeron para incluir un promotor (pPHD1), un marcador (URA3 o LEU2) y un terminador (TPHD1), que permitió eliminar el gen ORF mediante recombinación homóloga, como se describe en Papanikolaou et al. (2013).

Se prepararon casetes de alteración y expresión génica mediante digestión con NotI y se transformaron en Y. lipolytica cepas que utilizan el método del acetato de litio, como se describió anteriormente (Barth y Gaillardin, 1997). La integración de genes y la disrupción se verificaron mediante PCR de colonias utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1. El plásmido replicativo que alberga el Cre Se utilizó el gen (JME547 Tabla 1) para el rescate de marcadores (Fickers et al., 2003). Después de la transformación con el Cre plásmido de expresión, la pérdida del gen marcador se verificó en YNB con / sin uracilo. Se comprobó la pérdida del plásmido replicativo usando placas de réplica en YPD con / sin higromicina después de cultivar en YPD durante 24 h. Para construir la cepa prototrófica, un LEU2 se transformó el fragmento del plásmido JMP2563. Todas las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.

tabla 1. Los plásmidos y cepas utilizados en este estudio.

Condiciones de cultivo para los experimentos de biosíntesis de lípidos

Los experimentos de biosíntesis de lípidos se realizaron en medio mínimo y los cultivos se prepararon de la siguiente manera: se estableció un precultivo inicial inoculando 10 mL de medio YPD en matraces Erlenmeyer de 50 mL. Luego, el precultivo se incubó durante la noche a 28 ° C y 180 rpm. La suspensión celular resultante se lavó con agua destilada estéril y se usó para inocular 50 ml de medio mínimo YNBD6 que contenía base nitrogenada de levadura al 0,17% (p / v) (sin aminoácidos ni sulfato de amonio, YNBww, Difco), 0,15% (p / v) ) NH4Cl, 50 mM KH2correos4-N / A2HPO4 tampón (pH 6,8) y glucosa al 6% (p / v). Este medio se había colocado en matraces Erlenmeyer de 250 mL. A continuación, los cultivos se incubaron a 28 ° C y 180 rpm.

Determinación de lípidos

Los lípidos se extrajeron de 10 a 20 mg de células liofilizadas y se convirtieron en ésteres metílicos de FA (FAME) utilizando el procedimiento descrito por Browse et al. (1986). A continuación, los FAME se analizaron mediante cromatografía de gases (GC), que se llevó a cabo con un instrumento Varian 3900 equipado con un detector de ionización de llama y una columna Varian FactorFour vf-23ms, donde la especificación de sangrado a 260 & # x000B0C es 3 pA (30 m , 0,25 mm, 0,25 & # x003BCm). Los FAME se identificaron mediante comparaciones con estándares comerciales (FAME32, Supelco) y se cuantificaron utilizando el método estándar interno, que implica la adición de 100 & # x003BCg de ácido dodecanoico comercial (Sigma-Aldrich). Los FA comerciales de cadena impar (Odd Carbon Straight Chains Kit que contiene 9 FA, OC9, Supelco) se convirtieron en sus FAME utilizando el mismo método empleado con las muestras de levadura. Luego se identificaron usando GC y se compararon con los FA de cadena impar de las muestras de levadura.

Para determinar el peso de células secas (DCW), se tomaron 2 mL del cultivo de los matraces, se lavaron y se liofilizaron en un tubo prepesado. Las diferencias en masa correspondieron a los mg de células encontrados en 2 mL de cultivo.


Abstracto

los Escherichia coli El genoma codifica siete parálogos de la superfamilia de la crotonasa (enoil CoA hidratasa). Cuatro de estos tienen funciones desconocidas o inciertas, su existencia era desconocida antes de la finalización de la E. coli proyecto de secuenciación del genoma. El gen que codifica uno de estos, YgfG, se encuentra en un operón de cuatro genes que codifica homólogos de metilmalonil CoA mutasas (Sbm) y acil CoA transferasas (YgfH), así como una supuesta proteína quinasa (YgfD / ArgK). Hemos determinado que YgfG es metilmalonil CoA descarboxilasa, YgfH es propionil CoA: succinato CoA transferasa y Sbm es metilmalonil CoA mutasa. Estas reacciones son suficientes para formar un ciclo metabólico mediante el cual E. coli puede catalizar la descarboxilación de succinato a propionato, aunque se desconoce el contexto metabólico de este ciclo. La identificación de YgfG como metilmalonil CoA descarboxilasa amplía el rango de reacciones catalizadas por miembros de la superfamilia de las crotonasas.

Esta investigación fue apoyada por la Universität Karlsruhe, la Deutsche Forschungsgemeinschaft y el Fonds der Chemischen Industrie (a J.R.) y NIH Grants GM-40570 y GM-52594 (a J.A.G.).

Dirigir correspondencia a este autor. Teléfono: 217-333-3945. Fax: 217-265-0385. Correo electrónico: [email & # 160protected]


Discusión

Several examples of unusual type I modular PKS extender units have been reported over the past half-decade. In all cases, these are assembled via a common final biosynthetic step, involving reductive carboxylation of an α, β-unsaturated CoA thioester by a CCRC homologue. The data reported here reveal an alternative mechanism for assembly of unusual type I modular PKS extender units. This employs a unique YCC β-subunit (MccB) that, in partnership with the primary metabolic YCC α-subunit, is able to directly carboxylate medium chain acyl-CoA thioesters. X-ray crystallographic analysis revealed the structural basis for substrate recognition by MccB, allowing a homologue likely involved in the biosynthesis of butylmalonyl-CoA and other unusual extender units incorporated into the primycin complex of clinically-used antibiotics to be identified.

These findings inspired the precursor-directed biosynthesis of novel azide- and alkyne-containing stambomycin analogues. Several biosynthetic engineering approaches have recently been utilized to introduce alkyne-terminated extender units containing 5–8 carbons into erythromycin and antimycin analogues 26,27,28 . Feeding of 8-nonynoic acid to S. ambofaciens resulted in the production of a stambomycin analogue containing a 9-carbon alkyne-terminated extender unit in comparable quantities to the natural products. Thus, MccB, the AT domain from module 12 of the stambomycin PKS and the medium chain acyl-CoA synthetase encoded by samR0482 are useful additions to the synthetic biology toolkit for bio-orthogonal tagging of polyketides.


Métodos

Microbial strains and media

Table 1 lists the various strains and plasmids used in this study. los E. coli LS5218 strain [fadR, atoC(Con)], which constitutively expresses the enzymes of fatty acid β-oxidation pathway, allows expression of various pathway genes cloned into pTrc99a and pBBR1MCS2 vectors upon induction with isopropyl-β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) [38]. The IPTG was added when the cells had reached an optical density at a wavelength of 600 nm (OD600) of 0.6. The PHA-producing strain LZ05 with deletion of the genes ptsG, tesB y yciA was described previously [23]. los E. coli DH5α strain served as the host strain for subsequent construction and propagation of various PHA-producing plasmids. During the recombinant plasmid construction, strains were cultivated in Luria–Bertani (LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl). For gene knockout, SOB medium (20 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 0.5 g/L NaCl, 10 mM MgCl2 and 2.5 mM KCl) was utilized.

Construcción de plásmido

For the even-chain monomer supply, the construction of plasmid pQQ05 has been previously described [23]. Briefly, the genes yqeF, fadB, phaJ1Pensilvania, ter y phaC2Pensilvania were all cloned and ligated into the corresponding sites of pTrc99a which were cut with the same restriction enzymes stepwise to generate plasmid pQQ05.

The construction of odd-chain monomer generation pathway was as follows. The codon-optimized prpP gene was cloned into the pBBR1MCS2 vector between the Kpnyo y BamHI sites to construct the plasmid of pZQ01. Later, in order to form the plasmid pBBR1MCS2-acs, namely pZQ02, the acs gene amplified via polymerase chain reaction (PCR) using E. coli MG1655 genomic DNA (gDNA) as template was also inserted into the pBBR1MCS2. los prpE y pct fragments amplified from R. eutropha H16 gDNA with primers prpE-F/prpE-R and pct-F/pct-R were separately ligated into the pBBR1MCS2 to yield the plasmids pZQ03 and pZQ04. Subsequently, co-expression of two genes prpP y acs, prpP y prpE, prpP y pct in the pBBR1MCS2 was utilized to form the plasmids pZQ05, pZQ06 and pZQ07, respectively. All of the genes were under the control of the lac promoter with separated ribosomal binding site located upstream of each gene to facilitate the translation. los R. eutropha H16 template used for these PCR reactions was isolated using the TIANamp Bacterial DNA Kit (TIANGEN BIOTECH, China). The primers used to amplify different fragments for cloning reactions are listed in Additional file 1: Table S1.

In all cases, PCR was performed using an S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). PrimeSTAR HS DNA polymerase was purchased from Takara (Tokyo, Japan), restriction endonucleases were from Fermentas/Thermo Scientific (Pittsburgh, USA), and T4 DNA ligase was from New England Biolabs (Ipswich, USA). Propagated plasmids were prepared by TIANGEN Plasmid Mini Extraction Kit (TIANGEN BIOTECH, China), and restriction enzyme-digested products were purified using an E.Z.N.A.™ Gel Extraction Kit (Omega, USA). DNA sequencing of all constructed plasmids were performed by Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China). All of the constructed plasmids were transformed into the strain LZ05 and the optimum double plasmids were then transformed into the strain LZ08 according to standard procedures [39].

Gene knockout

El gen pflB which encodes pyruvate formate lyase was knocked out by the one-step inactivation method as described previously [40] and poxB encoding pyruvate oxidase was knocked out by linearized DNA fragments with extending homologous sequence [41]. First, the linerized DNA fragments with the FLP recognition target sites and 39 bp homologous sequences were obtained via PCR using pKD4 (Km R ) as a template and pflB-F/pflB-R as primers. After the DNA gel extraction, the purified PCR product was electroporated into the host cells which carried the plasmid pKD46, and then E. coli LZ05 was induced by 0.3% (w/v) l -arabinose to express the λ Red system. The positive transformants were selected and identified by colony PCR using the primers pflB-test-F/pflB-test-R. Regarding the poxB deletion, primers poxB-F/poxB-R and chromosomal DNA of the strain QZ1111 were applied to amplify the linearized DNA fragments for poxB. The deletion procedure of poxB gene was as follows. After DpnI digestion, the PCR products were then purified and electroporated into the competent strain E. coli LZ05 containing the plasmid pKD46. Transformant cells were selected in solid LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, and 1.5% agar powder) containing chloramphenicol (Cm R ). Candidate clones were screened by PCR employing primers poxB-F/poxB-R. The PCR products were ultimately sequenced in Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China) if necessary. After removing pKD46, the corresponding Km R or Cm R cassette was removed with the helper plasmid pCP20. The plasmids pKD46 and pCP20 were eliminated by overnight cultivation at 42 °C. Finally, the strain LZ08 with the above two gene inactivation was generated.

Cultivation condition

The medium of shake flask study contains 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 30 mM NH4Cl, 5 mM (NH4)2ASI QUE4, 1.48 mM Na2HPO4, and 100 μM FeSO4 supplemented with 125 mM MOPS.

For all shake flask experiments, single colony was inoculated into 5 mL LB broth and grown at 37 °C overnight. 0.5 mL pre-culture was inoculated to 300 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL LB and cultivated for 8 to 10 h and then 1% (v/v) seed inoculum for shake flask cultivation was incubated in 50 mL fermentation medium. When all liquid fermentation medium (50 mL) was incubated in 300 mL conical flasks at 37 °C with an agitation of 250 rpm to an optical density at 600 nm (OD600) of 0.6–0.8, 1 mM IPTG was added to the culture broth as an inducer. After induction, 30 g/L glucose was supplied as the sole carbon source at the appropriate time and then fermented for 72 h at 30 °C with shaking at 250 rpm. When necessary, ampicillin (100 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) or chloramphenicol (25 μg/mL) was added to the medium to maintain the stability of the plasmids. After cultivation, cells were gathered by centrifugation at 12,000 rpm for 15 min, washed with water twice and treated with ethanol once and then lyophilized.

PHA production analysis

The content and monomer compositions of intracellular accumulated PHA were analyzed by gas chromatography (GC) as described previously [42]. PHA content was defined as the percent ratio of PHA concentration to CDW. Liquid culture was centrifuged to obtain the supernatant and cellular biomass. 15 mg lyophilized cells were subjected to methanolysis in the presence of 1 mL of chloroform and 1 mL of 3% (v/v) sulfuric acid in methanol for 1 h at 100 °C. The samples were cooled to room temperature and then 1 mL of distilled water was added in order to extract the cell debris that is soluble in the aqueous phase. 10 mg/mL pentadecanoic acid in ethanol was added as an internal standard. The mixture was vortexed and centrifuged at 12,000 rpm for 10 min. After the layer separation, the organic (chloroform) phase (500 μL) was transferred to another new vial and analyzed using a Shimadzu GC2010 gas chromatograph (Kyoto, Japan) equipped with an AOC-20i auto-injector and a RestekRxi ® -5 column. PHA standard samples were dissolved in chloroform and also analyzed according to the method above by GC. The temperature program used was as follows: 80 °C hold for 1 min, ramp from 60 to 230 °C at 10 °C per min and a final hold at 230 °C for 10 min [23].

Cell growth, glucose consumption and acetate assimilation analyses

Cell growth was monitored by measuring OD600 utilizing a spectrophotometer (Shimazu, Japan). Glucose and acetate were quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) (Shimazu, Japan) which equipped with a refractive index detector (RID-10A) and an Ion Exclusion column (Bio-Rad, HPX-87H). The samples were first centrifuged at 12,000 rpm for 10 min, and then the supernatant was filtrated with a 0.22 μm filter membrane. 5 mM sulfuric acid was utilized as the mobile phase of HPLC with the flow rate of 0.6 mL/min and the utilized column temperature was 65 °C.

Análisis estadístico

All data examined were expressed as mean ± SD. Statistical analyses of the data were carried out using two-tailed Student’s t-test between two groups, and one-way ANOVA followed by the post hoc Tukey’s test for multiple groups. PAG & lt 0,05 se consideró significativo. The * denotes PAG < 0.05, the *** denotes PAG & lt 0,001.


Ver el vídeo: . Escherichia coli (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Nikonris

    No lo sé, no lo sé

  2. Dile

    Ciertamente. Todo lo anterior dijo la verdad. Discutamos esta pregunta. Aquí o en PM.

  3. Daizilkree

    la muy buena pregunta

  4. Meir

    Yo sobre tal todavía no escuché



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