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18.4: Dianas y genes de microARN - Biología

18.4: Dianas y genes de microARN - Biología


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Descubrimiento del gen de miARN

Los miRNA son reguladores postranscripcionales que se unen a los mRNA para silenciar un gen. El problema computacional aquí es cómo encontrar los genes que corresponden a estos miARN.

El primer problema es encontrar horquillas. Simplemente doblar el genoma produce aproximadamente 760.000 horquillas, pero solo hay entre 60 y 200 miARN verdaderos. Por tanto, necesitamos métodos que ayuden a mejorar la especificidad. Las características estructurales, incluida la energía de plegado, bucles (número, simetría), longitud y simetría de horquilla, subestructuras y emparejamientos, pueden considerarse, sin embargo, esto solo aumenta la especificidad en un factor de 40. Por lo tanto, la estructura por sí sola no puede predecir miARN. También se pueden considerar firmas evolutivas. MiRNA muestra propiedades de conservación características. Las horquillas constan de un bucle, dos brazos y regiones flanqueantes. En la mayoría de los ARN, el bucle es el mejor conservado debido al hecho de que se utiliza para la unión. En el miARN, sin embargo, los brazos están más conservados porque determinan dónde se unirá el complejo RISK. Esto aumenta la especificidad en un factor de 300. Tanto estas características estructurales como las propiedades de conservación se pueden combinar para predecir mejor los miARN potenciales.

Estas características se combinan mediante el aprendizaje automático, específicamente los bosques aleatorios. Esto produce muchos clasificadores débiles (árboles de decisión) en subconjuntos de positivos y negativos. Luego, cada árbol vota sobre la clasificación final de un miARN dado. El uso de esta técnica nos permite alcanzar la sensibilidad deseada (aumentada en 4.500 veces).

Validación de los miARN descubiertos

Los miARN descubiertos se pueden validar comparándolos con miARN conocidos. Un ejemplo dado en clase muestra que el 81% de los miARN descubiertos ya se sabía que existían, lo que demuestra que estos métodos funcionan bien. Los miARN putativos aún no se han probado, sin embargo, esto puede ser difícil de hacer, ya que la prueba se realiza mediante clonación.

La especificidad de la región es otro método para validar miARN. En el fondo, las horquillas se distribuyen de manera bastante uniforme entre intrones, exones, regiones intergénicas y repeticiones y transposones. El aumento de la confianza en las predicciones hace que casi todos los miARN caigan en intrones y regiones intergénicas, como se esperaba. Estas predicciones también coinciden con las lecturas de secuenciación.

Esto también produjo algunas propiedades genómicas típicas de los miARN. Tienen preferencia por la hebra transcrita. Esto les permite llevar a cuestas el intrón del gen real y, por lo tanto, no requieren una transcripción separada. También se agrupan con miARN conocidos y predichos. Esto indica que pertenecen a la misma familia y tienen un origen común.

Identificación del extremo 5 'de MiRNA

Las primeras siete bases determinan dónde se une un miARN, por lo que es importante saber exactamente dónde ocurre la escisión. Si este punto de hendidura está equivocado incluso en dos bases, se predecirá que el miARN se una a un gen completamente diferente. Estos puntos de hendidura se pueden descubrir computacionalmente mediante la búsqueda de 7-mers altamente conservados que podrían ser objetivos. Estos 7-meros también se correlacionan con la falta de anti-objetivos en genes expresados ​​de forma ubicua. Usando estas características, características estructurales y características de conservación, es posible adoptar un enfoque de aprendizaje automático (SVM) para predecir el sitio de hendidura. Algunos miARN no tienen una única posición de puntuación alta y también muestran un procesamiento impreciso en la célula. Si la secuencia de estrellas tiene una puntuación alta, también tiende a expresarse más en la célula.

Motivos funcionales en regiones de codificación

Cada tipo de motivo tiene firmas distintas. El ADN es simétrico de cadena, el ARN es específico de cadena e invariante en el marco, y la proteína es específica de cadena y sesgada en el marco. Esta invariancia de trama se puede utilizar como firma. Luego, cada cuadro se puede evaluar por separado. Los motivos debidos a los sesgos de uso de los di-codones se conservan en un solo desplazamiento de cuadro, mientras que los motivos debidos a la regulación a nivel de ARN se conservan en los tres desplazamientos de cuadro. Esto permite la capacidad de distinguir presiones superpuestas.


Objetivos de microARN en Drosophila

Los recientes descubrimientos de microARN (miARN) y la caracterización de los primeros objetivos de sus productos génicos en Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster han sentado las bases para el esclarecimiento de una nueva red de control regulatorio. A continuación, presentamos un método novedoso de tres pasos para la predicción del genoma completo de genes diana de miARN, validado mediante ejemplos conocidos. Aplicamos el método para descubrir cientos de genes diana potenciales en D. melanogaster. Para cada miARN, los genes diana se seleccionan en base a (a) patrón de complementariedad de secuencia usando un algoritmo de alineación local ponderado por posición, (b) cálculo de energía de la formación de dúplex ARN-ARN y (c) conservación de sitios diana en genomas relacionados. Aplicación al D. melanogaster, D pseudoobscura y Anopheles gambiae genomas de esta manera, identifica varios cientos de genes diana potencialmente regulados por uno o más miARN conocidos.

Estos objetivos potenciales se enriquecen con genes que se expresan en etapas de desarrollo específicas y están involucrados en la especificación del destino celular, la morfogénesis y la coordinación de los procesos de desarrollo, así como la función del sistema nervioso en el organismo maduro. Los objetivos de alto rango están doblemente enriquecidos en factores de transcripción e incluyen genes que ya se sabe que están bajo regulación de traducción. Nuestros resultados reafirman la tesis de que los miARN juegan un papel importante en el establecimiento de patrones espaciales y temporales complejos de actividad genética necesarios para la progresión ordenada del desarrollo y apuntan a roles adicionales en la función del organismo maduro.

La combinatoria emergente de los sitios diana de miARN en los 3 'UTR de los ARN mensajeros recuerdan la regulación transcripcional en las regiones promotoras del ADN, con relaciones de uno a muchos y de muchos a uno entre el regulador y el destino regulado. Normalmente, más de un miARN regula un mensaje, lo que indica un control cooperativo de la traducción. Por el contrario, un miARN puede tener varios objetivos, lo que refleja la multiplicidad de objetivos.

Como guía para los experimentos dirigidos, proporcionamos información detallada en línea [1] sobre genes diana y sitios de unión para cada miARN y sobre miARN para cada gen, clasificados por probabilidad de coincidencia. La herramienta de predicción de objetivos se puede aplicar a cualquier par similar de genomas con secuencias de miARN identificadas.


Abuso de MDMA en relación con la variación de microARN en el área tegmental ventral del cerebro humano y el núcleo accumbens

La 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) es una de las drogas ilegales más extendidas, que ha sido consumida especialmente por jóvenes en el grupo de edad de 15 a 34 años. Los microARN (miARN) son ARN pequeños, no codificantes y sintetizados endógenamente que regulan postranscripcionalmente la expresión de sus genes diana mediante la inhibición de la traducción o degradación de proteínas. Los miARN están cada vez más implicados en las expresiones y funciones de genes relacionados con fármacos. En particular, no hay informes de variación de miARN en el cerebro humano en el abuso de MDMA. A continuación, presentamos un estudio de perfil de miARN, el primero de este tipo, según nuestro conocimiento, en los cerebros humanos post-mortem de una muestra de personas con abuso de MDMA, junto con controles no dependientes de drogas. El perfil de miARN del núcleo accumbens (NAc) y las áreas tegmentales ventrales (VTA) se realizó mediante análisis de microarrays. Posteriormente, se seleccionaron dos biomarcadores putativos de miARN candidatos de acuerdo con la expresión diferencial regional significativa (miR-1202 y miR-7975), utilizando PCR cuantitativa de transcripción inversa (qRT-PCR). Demostramos que el nivel de expresión de miR-7975 fue significativamente menor en las regiones VTA de los 30 usuarios de MDMA, en comparación con las 30 muestras de control. Otro miR-1202 significativamente desregulado se reguló a la baja en las regiones NAc de 30 muestras de MDMA en comparación con las muestras de control. La alteración de estos miARN puede potencialmente servir como nuevos biomarcadores para el abuso de MDMA y justifica una mayor investigación en muestras independientes y más grandes de pacientes.

Palabras clave: 3 4-metilendioximetanfetamina MicroARN Investigación de microarrays Núcleo Accumbens Área Tegmental Ventral.

Cifras

Ilustración de mapa de calor de miARN desregulados ...

Ilustración de mapa de calor de miARN desregulados en VTA con muestras de MDMA frente a control de VTA ...

Niveles de expresión relativa de miR-1202 ...

Niveles de expresión relativa de miR-1202 en 30 NAc con muestras de MDMA en comparación con ...


Parte 2: Colas en la regulación de microARN y más

00: 00: 15.02 Hola. Soy Narry Kim del Centro de Investigación de ARN
00: 00: 18.11 en IBS.
00: 00: 20.16 También trabajo en la Universidad Nacional de Seúl.
00: 00: 24.18 En la última parte de mi presentación,
00: 00: 26.23 te hablé sobre
00: 00: 29.27 cómo se generan y regulan los microARN.
00: 00: 32.16 En esta charla, te hablaré sobre
00: 00: 36.26 un tipo de modificación de ARN llamada cola,
00: 00: 40.15 que controla la biogénesis de microARN
00: 00: 43.24 y otros tipos de ARN, incluidos los ARN mensajeros.
00: 00: 49.26 Entonces, más de 100 tipos de modificaciones de ARN
00: 00: 54.20 se han descrito hasta ahora.
00: 00: 56.11 La modificación del ARN puede estar en la base o en los residuos de ribosa.
00: 01: 03.10 Además, los nucleótidos
00: 01: 06.19 se puede agregar o eliminar del ARN.
00: 01: 09.14 Mi laboratorio se ha interesado particularmente
00: 01: 13.04 en la parte 3 'del ARN, que llamamos colas.
00: 01: 17.29 En esta presentación,
00: 01: 20.18 Les voy a mostrar algunos de los datos del laboratorio.
00: 01: 27.07 que demuestra que, a veces,
00: 01: 29.23 una cola en realidad puede cambiar el destino del ARN.
00: 01: 33.12 Entonces, esta línea del estudio
00: 01: 38.20 comenzó cuando estábamos estudiando la vía del microARN.
00: 01: 42.00 Como les expliqué en la primera parte de la charla,
00: 01: 46.06 La biogénesis de miARN implica
00: 01: 49.02 Pol II, Drosha, Exportin 5, Dicer y Argonaute.
00: 01: 53.28 Y se piensa en miARN maduros.
00: 01: 58.02 se pensaba que eran una sola especie.
00: 02: 03.07 Pero, de hecho, si miras los datos de secuenciación profunda.
00: 02: 07.25 aquí, a la izquierda,
00: 02: 11.01 los números indican la abundancia relativa de las especies de miARN.
00: 02: 16.01 aparte de la secuencia de referencia más abundante,
00: 02: 19.19 también puede encontrar isoformas adicionales.
00: 02: 23.07 Más notablemente, algunas isoformas tienen
00: 02: 28.29 secuencias A sin plantilla o secuencias U
00: 02: 33.07 al final del miARN.
00: 02: 35.29 En animales, As y Nosotros
00: 02: 39.27 son los nucleótidos sin plantilla más comunes
00: 02: 44.04 en el extremo 3 'del ARN.
00: 02: 46.14 En las plantas, U es la más prominente,
00: 02: 50.10 como lo describió originalmente el laboratorio de Xuemei Chen.
00: 02: 55.06 Entonces, ¿de dónde vienen estos nucleótidos sin plantilla?
00: 03: 00.23 Resultó que la uridilación tiene lugar,
00: 03: 04.26 principalmente, antes del procesamiento de Dicer en pre-miRNA,
00: 03: 09.15 mientras que ocurre la adenilación
00: 03: 14.20 después del procesamiento de Dicer, en ARN de 22 nucleótidos.
00: 03: 20.14 Entonces, estas reacciones se llevan a cabo
00: 03: 25.07 por un grupo de polimerasas poli (A) no canónicas,
00: 03: 28.23 también conocidas como uridilil transferasas terminales.
00: 03: 33.02 De las 7 poli (A) polimerasas no canónicas, o TUTasas,
00: 03: 39.09 TUT4 y TUT7,
00: 03: 43.25 que tienen organizaciones de dominio similares,
00: 03: 47.21 tienen funciones redundantes en la uridilación de pre-let7.
00: 03: 55.05 ¿Qué pasa con la adenilación?
00: 03: 57.04 Se demostró que TUTase2, o GLD2,
00: 04: 01.22 o Wispy en moscas,
00: 04: 04.19 son responsables de la adenilación.
00: 04: 07.21 Pero antes de comenzar a explicar el reglamento
00: 04: 11.05 por cola,
00: 04: 13.13 Quiero dejar en claro que las frecuencias de cola
00: 04: 16.08 son generalmente bastante bajos en la mayoría de los tipos de células
00: 04: 18.27 para la mayoría de los miARN.
00: 04: 21.24 Entonces, quiero que tengas una impresión
00: 04: 25.08 que las colas siempre son importantes para todos los miARN.
00: 04: 30.22 Sin embargo, la frecuencia de cola
00: 04: 34.27 varía según las especies de miARN y los tipos de células.
00: 04: 38.13 Y las colas pueden proporcionar una base molecular
00: 04: 43.03 para la regulación de algunos miARN
00: 04: 46.02 en etapas específicas de desarrollo.
00: 04: 49.18 Entonces, para darte un par de ejemplos
00: 04: 53.24 de la regulación mediada por relaves.
00: 04: 56.15 el primero es la uridilación de pre-let-7.
00: 05: 00.28 En realidad, hay al menos dos modos de uridilación de pre-let-7.
00: 05: 05.12 El primero es la monuridilación
00: 05: 09.21 - esto está mediado por TUT7 y TUT4,
00: 05: 13.25 y la monouridilación en realidad promueve el procesamiento de Dicer,
00: 05: 18.28 entonces, en este contexto TUTases
00: 05: 24.09 promover la biogénesis de let-7,
00: 05: 27.12 sirviendo como factor de biogénesis.
00: 05: 29.14 Pero entonces, este es el caso de las células somáticas diferenciadas,
00: 05: 34.03 pero en células embrionarias y cáncer,
00: 05: 36.28 se expresa una proteína de unión a ARN llamada Lin28,
00: 05: 44.21 y se une a pre-let-7
00: 05: 47.08 e interactúa con TUTases
00: 05: 50.18 para inducir oligouridilación.
00: 05: 53.09 Entonces, ahora, la larga cola en U
00: 05: 56.15 inhibe el procesamiento de Dicer,
00: 05: 59.09 y promueve aún más la descomposición del ARN.
00: 06: 03.19 Entonces, en esta situación,
00: 06: 09.07 TUTasas, las mismas enzimas,
00: 06: 11.11 pueden servir como reguladores negativos.
00: 06: 13.21 Entonces, hay una dualidad funcional en la uridilación,
00: 06: 17.22 dependiendo de la longitud de las colas uridiladas
00: 06: 22.05 y el contexto de ARN y tipos de células.
00: 06: 28.29 Al hacer esto, Lin28 y TUTases
00: 06: 35.07 puede proporcionar un cambio molecular en el desarrollo
00: 06: 37.22 y transiciones patológicas,
00: 06: 40.05 como en el cáncer.
00: 06: 41.28 El segundo ejemplo es
00: 06: 46.21 adenilación de miARN maduros.
00: 06: 48.27 En esta transferencia Northern de huevos y embriones de Drosophila,
00: 06: 55.03 puedes encontrar algunas poblaciones de miARN heterogéneas,
00: 06: 59.26 que indica adenilación de miARN maduros.
00: 07: 04.00 Estas isoformas adeniladas
00: 07: 07.15 desaparecen cuando el embrión se mueve a
00: 07: 11.07 su etapa de desarrollo.
00: 07: 14.00 Más tarde, resultó que el mismo patrón se observa en otras especies animales,
00: 07: 23.03 como en erizo de mar y ratón,
00: 07: 27.14 sugiriendo que este es un mecanismo conservado.
00: 07: 31.05 Más tarde descubrimos que una enzima llamada Wispy,
00: 07: 35.11 una polimerasa poli (A) no canónica,
00: 07: 38.22 se expresa específicamente en huevos
00: 07: 41.06 e induce la adenilación de miARN.
00: 07: 44.20 Este es un mutante del gen Wispy
00: 07: 47.06 y, aquí, los miARN se acumulan como una forma no modificada.
00: 07: 55.18 Entonces, encontramos que los miARN
00: 07: 58.14 se controlan dinámicamente durante la ovogénesis tardía
00: 08: 02.01 y embriogénesis temprana.
00: 08: 04.23 Los miARN maternos se depositan
00: 08: 07.18 y luego se degradan rápidamente durante el desarrollo,
00: 08: 12.04 mientras que los miARN cigóticos
00: 08: 16.03 son inducidos a partir del genoma cigótico
00: 08: 18.11 para reemplazar a la población.
00: 08: 21.11 El mecanismo subyacente a esta regulación
00: 08: 24.12 está regulado por Wispy,
00: 08: 27.20 que adenila el miARN para inducir una rápida descomposición.
00: 08: 34.08 Entonces, adenilación mediada por Wispy
00: 08: 37.07 puede contribuir a la eliminación de miARN maternos
00: 08: 41.06 durante este interesante y dinámico período de transición del desarrollo.
00: 08: 48.05 Entonces, les he explicado hasta ahora,
00: 08: 50.24 en sistemas animales,
00: 08: 53.07 hay uridilación y adenilación
00: 08: 56.11 que controlan el destino de cierto grupo de miARN
00: 09: 00.15 en tipos de células específicos
00: 09: 02.25 y condiciones de desarrollo.
00: 09: 05.08 Entonces, avanzando hacia otros caminos.
00: 09: 15.13 También se sabe que los ARNm tienen colas, colas canónicas de poli (A),
00: 09: 19.01 pero teníamos curiosidad por saber si hay
00: 09: 27.09 cualquier otro tipo de colas no canónicas en los ARNm.
00: 09: 29.27 También teníamos curiosidad por saber si podíamos investigar
00: 09: 34.11 la función de estas colas
00: 09: 37.24 midiendo la longitud de la cola de poli (A) en la escala genómica
00: 09: 40.28 y en alta resolución.
00: 09: 43.16 Los otros métodos, como Northern blot y microarray,
00: 09: 47.29 han sido desarrollados,
00: 09: 50.10 pero la resolución y la escala no eran lo suficientemente buenas
00: 09: 53.29 para mirar el transcriptoma de manera efectiva.
00: 10: 00.01 Entonces, desarrollamos una técnica llamada TAIL-seq,
00: 10: 05.14 que es secuenciar el terminal 3 '.
00: 10: 08.03 Solo para explicarle brevemente el protocolo,
00: 10: 11.27 ARN totales se enriquecieron con ARNm
00: 10: 17.00 por fraccionamiento por tamaño y agotamiento del ARN ribosómico.
00: 10: 22.16 Esto se ligó al adaptador de 3 '
00: 10: 25.09 que contiene residuos de biotina
00: 10: 28.26 para que, después de una digestión parcial,
00: 10: 31.06 podemos tirar hacia abajo el fragmento más 3 '
00: 10: 34.21 usando perlas de estreptavidina.
00: 10: 38.23 Luego se ligó el fragmento
00: 10: 42.12 a un adaptador de 5 'y luego amplificado por RT-PCR,
00: 10: 49.03 y llevamos a cabo la secuenciación de extremos emparejados
00: 10: 52.05 para obtener 51 nucleótidos de la lectura 1
00: 10: 58.23 y 251 nucleótidos de la lectura 2.
00: 11: 02.00 La lectura 1 se utiliza para mapear el ARN,
00: 11: 06.18 para obtener la identidad de la transcripción,
00: 11: 09.29 y la lectura 2 se utiliza para determinar
00: 11: 13.25 las secuencias de la cola.
00: 11: 16.13 Con este método, podríamos determinar con precisión
00: 11: 22.21 las secuencias muy, muy finales de los ARN,
00: 11: 25.19 pero un desafío que tuvimos fue,
00: 11: 29.01 debido a la naturaleza homopolimérica de las colas poli (A),
00: 11: 32.23 si te adentras en la cola,
00: 11: 36.07 la calidad de la secuencia se vuelve realmente mala,
00:11: 40.25 así que fue muy difícil acertar con las secuencias.
00: 11: 44.23 Para superar el problema,
00: 11: 47.00 recopilamos las señales fluorescentes
00: 11: 50.01 directamente de la reacción de secuenciación
00: 11: 52.27 y miré las imágenes del secuenciador,
00: 11: 56.17 noté que hay una transición
00: 12: 00.07 entre secuencias poli (A)
00: 12: 03.20 y secuencias no poli (A).
00: 12: 05.25 Y podríamos convertir la información
00: 12: 08.22 para calcular la señal T relativa,
00: 12: 11.18 y nos dio la habilidad
00: 12: 17.06 para determinar el estado de la secuencia
00: 12: 21.03 para codificar la longitud de la cola de poli (A).
00: 12: 25.04 Entonces, pudimos medir, con precisión,
00: 12: 29.17 la longitud de la cola poli (A) de los ARNm.
00: 12: 33.24 Entonces, esto fue bastante útil,
00: 12: 35.23 y déjame mostrarte algunos ejemplos de lecturas de TAIL-seq.
00: 12: 39.17 Estas son las lecturas aleatorias que coinciden con el ARNm de p53.
00: 12: 45.07 Como dije, esta es una secuenciación de pares de extremos,
00: 12: 49.08 así que desde la Lectura 1, que se muestra en azul,
00: 12: 52.25 se utilizan para obtener la identidad de la transcripción,
00: 12: 58.19 y luego la lectura 2 se usa para
00: 13: 02.29 aprende sobre las secuencias de la cola.
00: 13: 06.12 De este conjunto de datos,
00: 13: 09.01 podríamos determinar con precisión
00: 13: 13.08 la longitud de la cola poli (A) del ARNm.
00: 13: 15.19 Además, por supuesto, podríamos mirar
00: 13: 20.14 el extremo 3 'del ARN
00: 13: 23.16 para encontrar algunas modificaciones de terminal interesantes,
00: 13: 26.00 como la uridilación e incluso la guanilación.
00: 13: 31.07 Entonces, TAIL-seq es muy útil
00: 13: 34.23 en el estudio de la regulación de las colas poli (A).
00: 13: 38.09 Aquí se muestra un ejemplo
00: 13: 42.15 - son los datos de TAIL-seq del lisado celular total
00: 13: 45.19 e inmunoprecipitado de PABP.
00: 13: 48.15 PABPC1 es una proteína de unión poli (A).
00: 13: 52.03 En el eje x tienes la longitud de la cola poli (A)
00: 13: 56.06 y en el eje y puede ver la fracción de lecturas.
00: 14: 00.20 Este es un experimento duplicado
00: 14: 03.18 y puede ver esa entrada - o lisado celular total -
00: 14: 08.26 da un resultado muy reproducible.
00: 14: 12.19 Y de esta distribución
00: 14: 18.05 puede aprender que la longitud media de poli (A)
00: 14: 22.26 es típicamente entre 60-100 nucleótidos
00: 14: 26.10 en ARN mensajeros de mamíferos,
00: 14: 28.27 que es más corto de lo que se había anticipado.
00: 14: 33.23 También puede aprender que PABP, como era de esperar,
00: 14: 42.26 se une preferentemente a largas colas de poli (A).
00: 14: 46.05 Se sabe que PABP abarca 25 nucleótidos,
00: 14: 50.23 entonces, en promedio, una cola de poli (A)
00: 14: 54.11 puede acomodar solo 2-4 moléculas de PABP.
00: 14: 58.06 También puedes usar esta técnica
00: 15: 05.04 para estudiar la modificación del extremo 3 'del ARNm.
00: 15: 08.16 Por ejemplo, puede estudiar la uridilación del ARNm.
00: 15: 12.19 En realidad, nos sorprendió bastante ver
00: 15: 16.04 tal distribución generalizada de la uridilación
00: 15: 20.02 en ARNm de mamíferos.
00: 15: 21.27 Esto sugiere que,
00: 15: 25.14 quizás, la uridilación es una parte integral del ciclo de vida del ARNm,
00: 15: 30.21 y aunque la uridilación del ARNm
00: 15: 33.28 se observó en algunos ARNm individuales
00: 15: 36.16 de hongos y plantas antes,
00: 15: 41.04 este estudio indica colectivamente que
00: 15: 47.10 este proceso puede conservarse en eucariotas.
00: 15: 51.17 Para averiguar la función de la uridilación,
00: 15: 56.05 buscamos las enzimas responsables de la uridilación
00: 16: 01.01 y encontró que las TUTasas 4 y 7 median la uridilación del ARNm.
00: 16: 07.25 Si derribas TUTase 4 y 7 en celdas HeLa
00: 16: 14.27 y realizar un experimento TAIL-seq,
00: 16: 19.14 la frecuencia de uridilación se reduce sustancialmente,
00: 16: 22.29 en particular las colas de oligo-U.
00:16: 27.12 Entonces, ¿cuál es la consecuencia funcional de estas enzimas?
00: 16: 34.06 Para averiguarlo, derribamos TUTase 4 y 7
00: 16: 38.26 y trató las células con actinomicina D
00: 16: 44.01 y llevó a cabo un experimento de secuencia de ARN
00: 16: 48.03 para medir la estabilidad de los ARNm.
00: 16: 49.27 Y encontramos que,
00: 16: 53.13 en comparación con el control,
00: 16: 56.04 en TUT4 y 7 celdas agotadas,
00: 16: 59.09 las vidas medias de los ARNm aumentaron globalmente,
00: 17: 02.17 que indica que TUTase 4 y 7 facilitan la descomposición del ARNm.
00:17: 13.04 Entonces, nuestro estudio nos dijo que
00: 17: 16.21 colas de oligo-U sirven como una marca de desintegración para los ARNm,
00: 17: 21.13 así como para pre-miARN.
00: 17: 24.08 Para explicarle cómo los ARN mensajeros
00: 17: 27.28 se degradan en células de mamíferos,
00: 17: 31.19 el ARNm activo tiene una cola larga de poli (A)
00: 17: 36.04 que está unido a la proteína de unión poli (A),
00: 17: 39.12 pero después de la adenilación
00: 17: 43.20 la cola de poli (A) se acorta.
00: 17: 46.18 Cuando está por debajo de unos 25 nucleótidos,
00: 17: 49.20 PABP ya no puede unirse a este ARNm,
00:17: 54.14 y esto conduce al reclutamiento de factores de desintegración.
00: 18: 03.00 Se sabe que esto puede suceder en una orientación de 5 'a 3'
00: 18: 07.07 y orientación 3'-a-5 '.
00: 18: 11.03 Nuestro estudio muestra que esto se puede facilitar
00: 18: 16.07 cuando TUTase 4 y 7
00: 18: 20.00 reconoce que el ARNm adenilado
00: 18: 23.06 y uridila la cola,
00: 18: 25.15 que recluta los factores de descomposición más rápidamente.
00: 18: 33.12 Entonces, ese era el papel de la uridilación
00: 18: 38.14 en el contexto de la ruta del ARNm.
00: 18: 42.10 Entonces, para terminar esta charla,
00: 18: 44.27 hemos encontrado que
00: 18: 49.20 Las colas pueden proporcionar capas importantes de regulación genética.
00: 18: 54.01 Y las colas pueden venir en más de un sabor
00: 18: 59.14 - no solo las colas canónicas de poli (A),
00: 19: 02.13 pero también colas A no canónicas, colas U o colas G.
00: 19: 09.18 Y hemos demostrado que las colas A no canónicas
00:19: 15.07 puede desestabilizar los microARN maternos.
00: 19: 18.10 Y las colas en U se pueden utilizar de varias formas.
00: 19: 23.08 Cola Oligo-U, en particular,
00: 19: 25.25 sirve como una marca de decaimiento general
00: 19: 28.29 tanto para las vías de microARN como para las vías de ARNm.
00: 19: 33.23 Con eso, me gustaría agradecer
00: 19: 36.29 todos los miembros anteriores y actuales de mi laboratorio,
00: 19: 40.22 pero me gustaría señalar especialmente
00: 19: 45.25 Inha Heo, Chirlmin Joo y Minju Ha
00: 19: 48.00 para el estudio de uridilación de microARN
00: 19: 50.25 y Mihye Lee y Yeon Choi
00: 19: 53.24 para el estudio de adenilación de microARN.
00:19: 56.17 Y se estudió la cola de ARNm
00: 20: 00.15 principalmente por Hyeshik Chang, Jaechul Lim y Minju Ha.
00: 20: 03.21 También agradezco la ayuda de nuestros colaboradores,
00: 20: 07.02 especialmente el laboratorio de Dinshaw Partel
00: 20: 11.04 y la financiación del Instituto de Ciencias Básicas.
00: 20: 16.01 Muchas gracias por su atención.

  • Parte 1: Biogénesis y regulación de microARN

Biogénesis de miARN

La biogénesis de miARN comienza con el procesamiento de las transcripciones de la ARN polimerasa II / III post o co-transcripcionalmente (14). Aproximadamente la mitad de todos los miARN identificados actualmente son intragénicos y se procesan principalmente a partir de intrones y relativamente pocos exones de genes que codifican proteínas, mientras que el resto son intergénicos, se transcriben independientemente de un gen del huésped y están regulados por sus propios promotores (13, 24). A veces, los miARN se transcriben como una transcripción larga llamada grupos, que pueden tener regiones de semillas similares y, en ese caso, se consideran una familia (25). La biogénesis de miARN se clasifica en vías canónicas y no canónicas (Figura 1).

Figura 1. Biogénesis de microARN y mecanismo de acción. La biogénesis de miARN canónico comienza con la generación del transcrito pri-miARN. El complejo de microprocesador, compuesto por Drosha y la Región Crítica del Síndrome de DiGeorge 8 (DGCR8), escinde el pri-miRNA para producir el precursor-miRNA (pre-miRNA). El pre-miARN se exporta al citoplasma de una manera dependiente de Exportin5 / RanGTP y se procesa para producir el dúplex de miARN maduro. Finalmente, las cadenas 5p o 3p del dúplex de miARN maduro se cargan en la familia de proteínas Argonaute (AGO) para formar un complejo de silenciamiento inducido por miARN (miRISC). En las vías no canónicas, el complejo microprocesador escinde inicialmente el ARN en horquilla pequeño (ARNhc) y se exporta al citoplasma a través de Exportin5 / RanGTP. Se procesan más a través de la escisión dependiente de AGO2, pero independiente de Dicer. Mirtrons y 7-metilguanina rematado (m 7 G) -pre-miARN dependen de Dicer para completar su maduración citoplasmática, pero difieren en su transporte nucleocitoplasmático. Los mirrones se exportan a través de Exportin5 / RanGTP, mientras que m 7 G-pre-miRNA se exportan a través de Exportin1. Todas las vías conducen en última instancia a un complejo miRISC funcional. En la mayoría de los casos, miRISC se une a los ARNm diana para inducir la inhibición de la traducción, muy probablemente al interferir con el complejo eIF4F. A continuación, las proteínas de la familia GW182 unidas a Argonaute reclutan las poli (A) -deadenilasas PAN2 / 3 y CCR4-NOT. PAN2 / 3 inicia la desadenilación mientras que el complejo CCR4-NOT completa el proceso, lo que lleva a la eliminación de la capa de m 7 G en el ARNm diana por el complejo de desencadenamiento. El ARNm decapitado puede sufrir 5 & # x02032 & # x022123 & # x02032 degradación a través de la exoribonucleasa XRN1. Modificado de Hayder et al. (26).

La vía canónica de la biogénesis de miARN

La vía de la biogénesis canónica es la vía dominante por la que se procesan los miARN. En esta vía, los pri-miRNAs se transcriben a partir de sus genes y luego se procesan en pre-miRNAs por el complejo microprocesador, que consiste en una proteína de unión al ARN de la Región Crítica 8 del Síndrome de DiGeorge (DGCR8) y una enzima ribonucleasa III, Drosha (27). DGCR8 reconoce un GGAC N6-metiladenilado y otros motivos dentro del pri-miRNA (28), mientras que Drosha escinde el dúplex pri-miRNA en la base de la estructura de horquilla característica del pri-miRNA. Esto da como resultado la formación de un saliente de 2 nt 3 & # x02032 en el pre-miARN (29). Una vez que se generan los pre-miRNA, se exportan al citoplasma mediante un complejo exportin 5 (XPO5) / RanGTP y luego se procesan con la endonucleasa Dicer de RNase III (27, 30). Este procesamiento implica la eliminación del bucle terminal, lo que da como resultado un dúplex de miARN maduro (31). La direccionalidad de la hebra de miARN determina el nombre de la forma madura de miARN. La hebra 5p surge del extremo 5 & # x02032 de la horquilla pre-miRNA mientras que la hebra 3p se origina en el extremo 3 & # x02032. Ambas cadenas derivadas del dúplex de miARN maduro se pueden cargar en la familia de proteínas Argonaute (AGO) (AGO1-4 en humanos) de una manera dependiente de ATP (32). Para cualquier miARN dado, la proporción de hebra 5p o 3p cargada con AGO varía mucho según el tipo de célula o el entorno celular, desde proporciones casi iguales hasta predominantemente una u otra (33). La selección de la cadena 5p o 3p se basa en parte en la estabilidad termodinámica en los extremos 5 & # x02032 del dúplex de miARN o una 5 & # x02032 U en la posición 1 del nucleótido (34). Generalmente, la hebra con menor estabilidad 5 & # x02032 o uracilo 5 & # x02032 se carga preferentemente en AGO y se considera la hebra guía. El hilo descargado se denomina hilo pasajero, que se desenrollará del hilo guía a través de varios mecanismos en función del grado de complementariedad. Las hebras pasajeras de miARN que no contienen desajustes son escindidas por AGO2 y degradadas por la maquinaria celular que puede producir un fuerte sesgo de hebra. De lo contrario, los dúplex de miARN con desajustes centrales o miARN no cargado con AGO2 se desenrollan y degradan pasivamente (14).

Vías de biogénesis de miARN no canónicas

Hasta la fecha, se han dilucidado múltiples vías de biogénesis de miARN no canónicas (Figura 1). Estas vías utilizan diferentes combinaciones de las proteínas implicadas en la vía canónica, principalmente Drosha, Dicer, exportin 5 y AGO2. En general, la biogénesis de miARN no canónica se puede agrupar en rutas independientes de Drosha / DGCR8 e independientes de Dicer. Los pre-miARN producidos por la vía independiente de Drosha / DGCR8 se parecen a los sustratos de Dicer. Un ejemplo de tales pre-miRNA son los mirtrones, que se producen a partir de los intrones del mRNA durante el empalme (35, 36). Otro ejemplo es el pre-miARN rematado con 7-metilguanosina (m 7 G). Estos ARN nacientes se exportan directamente al citoplasma a través de exportin 1 sin la necesidad de escisión de Drosha. Hay un fuerte sesgo de la hebra 3p probablemente debido a que la capa m 7 G evita la carga de la hebra 5p en Argonaute (37). Por otro lado, los miARN independientes de Dicer son procesados ​​por Drosha a partir de transcripciones endógenas de ARN en horquilla corta (shRNA) (38). Estos pre-miARN requieren AGO2 para completar su maduración dentro del citoplasma porque tienen una longitud insuficiente para ser sustratos de Dicer (38). Esto, a su vez, promueve la carga de todo el pre-miARN en el corte dependiente de AGO2 y AGO2 de la hebra 3p. El recorte 3 & # x02032-5 & # x02032 de la hebra 5p completa su maduración (39).


18.4: Dianas y genes de microARN - Biología

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Buscar por nombre de miARN
Búsqueda por objetivo genético

miRDB es una base de datos en línea para la predicción de objetivos de miARN y anotaciones funcionales. Todos los objetivos en miRDB fueron predichos por una herramienta bioinformática, MirTarget, que se desarrolló analizando miles de interacciones miRNA-objetivo de experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Se han identificado características comunes asociadas con la unión de miRNA y la regulación negativa de objetivos y se han utilizado para predecir objetivos de miRNA con métodos de aprendizaje automático. Los hospedadores de miRDB predijeron los objetivos de miARN en cinco especies: humanos, ratones, ratas, perros y pollos. Los usuarios también pueden proporcionar sus propias secuencias para la predicción de objetivos personalizados utilizando el algoritmo de predicción actualizado. Además, a través de análisis computacionales combinados y minería de literatura, se identificaron miARN funcionalmente activos en humanos y ratones. Estos miARN, así como las anotaciones funcionales asociadas, se presentan en la colección FuncMir en miRDB. As a recent update, miRDB presents the expression profiles of hundreds of cell lines and the user may limit their search for miRNA targets that are expressed in a cell line of interest. To facilitate the prediction of miRNA functions, miRDB presents a new web interface for integrative analysis of target prediction and Gene Ontology data.


18.4: MicroRNA Genes and Targets - Biology

The study of a class of small non-coding RNA molecules, named microRNAs (miRNAs), has advanced our understanding of many of the fundamental processes of cancer biology and the molecular mechanisms underlying tumor initiation and progression. MiRNA research has become more and more attractive as evidence is emerging that miRNAs likely play important regulatory roles virtually in all essential bioprocesses. Looking at this field over the past decade it becomes evident that our understanding of miRNAs remains rather incomplete. As research continues to reveal the mechanisms underlying cancer therapy efficacy, it is clear that miRNAs contribute to responses to drug therapy and are themselves modified by drug therapy. One important area for miRNA research is to understand the functions of miRNAs and the relevant signaling pathways in the initiation, progression and drug-resistance of tumors to be able to design novel, effective targeted therapeutics that directly target pathologically essential miRNAs and/or their target genes. Another area of increasing importance is the use of miRNA signatures in the diagnosis and prognosis of various types of cancers. As the study of non-coding RNAs is increasingly more popular and important, it is without doubt that the next several years of miRNA research will provide more fascinating results.


Laboratory Methods in Epigenetics

Yu Liu , . Qianjin Lu , in Epigenetics and Dermatology , 2015

2.5.3.2 Gain-of-Function and Loss-of-Function Experiments

Specific miRNA function can be explored by up- and downregulating specific miRNA levels. Gain-of-function experiments are performed by transfecting a plasmid containing a constitutive promoter (e.g., cytomegalovirus (CMV)) to overexpress a pri-miRNA or a pre-miRNA sequence. Viral vectors can also be used, or the pre-miRNA itself can be transfected. Usually, the associated companies offer the pre-miRNA precursor molecule, a miRNA mimic that is chemically synthesized as a modified double-stranded oligonucleotide [84] . At the same time, miRNA functional analysis can also be examined by using synthetic miRNA inhibitors.


Abstracto

RNA is involved in the regulation of multiple cellular processes, often by forming sequence-specific base pairs with cellular RNA or DNA targets that must be identified among the large number of nucleic acids in a cell. Several RNA-based regulatory systems in eukaryotes, bacteria and archaea, including microRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs), CRISPR RNAs (crRNAs) and small RNAs (sRNAs) that are dependent on the RNA chaperone protein Hfq, achieve specificity using similar strategies. Central to their function is the presentation of short 'seed sequences' within a ribonucleoprotein complex to facilitate the search for and recognition of targets.


COMMENTARY

Background Information

Background on miRNA biogenesis and function

miRNAs are non-coding RNAs of ∼20 to 24 nt that regulate post-transcriptional gene expression of targets (reviewed in Yu, Jia, & Chen, 2017 ). As shown in Figure 9, miRNA biogenesis begins with transcription of a MIR gene by RNA polymerase II to produce a primary miRNA (pri-miRNA), consisting of a stem-loop region flanked by unstructured arms. In sequential steps, dicer-like 1 RNase (DCL1) excises the stem-loop to form the miRNA precursor (pre-miRNA), then generates a duplex comprising the miRNA and its opposing strand, classically termed microRNA (miRNA). Once in the cytoplasm, the RNA-induced silencing complex (RISC) is established upon association of the miRNA with Argonaute 1 (AGO1). Plant miRNAs tend to have high sequence complementarity with targets and act primarily through target mRNA cleavage rather than translational inhibition, the latter being more common in animals. Although the high sequence complementarity of miRNA/target pairs observed in plants is conducive to RNA cleavage, this is not always the case, as miRNA-mediated translational inhibition has been shown in plants for highly complementary miRNA/target pairs.

Intent of the article

The outcome of this article is a candidate set of biologically relevant miRNA/target pairs, along with validations of differential expression and target cleavage. This information may be sought for the purpose of basic research, i.e., to uncover a novel layer of gene expression regulation for the pathway under study. Indeed, plant miRNAs are implicated in numerous abiotic and biotic stress responses, as well as maintenance of normal growth and development (Noman et al., 2017 ). Alternatively, one may wish to leverage these results in a more applied manner. For example, the use of miRNAs to manipulate transcript abundance is a popular strategy for crop genetic engineering, with several reports demonstrating its successful application in agronomic trait improvement (Djami-Tchatchou, Sanan-Mishra, Ntushelo, & Dubery, 2017 ).

This article is intended for researchers studying non-model plants. These species tend to lack public genomic resources, most notably a reference genome or transcriptome. Ideally, miRNA prediction is performed at the genomic level, with several prediction algorithms operating solely on the genome sequence (Rajendiran, Chatterjee, & Pan, 2018 ). We provide a strategy that considers the unique challenges associated with large-scale bioinformatic analysis of a non-model plant. Specifically, assembly and annotation of a reference transcriptome is easier, faster, and less expensive than that of a genome. The former also requires less specialized knowledge, due in large part to the availability of integrated, user-friendly tools aimed at biologists with limited bioinformatic experience. It is important to note that the use of genome or transcriptome references from related plant species is not recommended. This is because plant miRNAs tend to be highly species-specific, and unlike animals, miRNA precursors are generally not conserved across plants (Bartel, 2004 ). For plant miRNAs that are conserved, this usually occurs at the level of the mature miRNA (Bartel, 2004 ). Even so, we advise against miRNA prediction based solely on sequence comparison against mature miRNAs of related species, as the identification of a suitable miRNA precursor is an important feature used to reduce false positive predictions. Therefore, the approach of this article is to create and use resources that are specific to the plant under study.

Strengths and limitations of the procedure

Due to the tendency of plant miRNAs to be species-specific, an advantage of our procedure is that miRNAs are predicted using a transcriptomic reference generated for the species under study. Additionally, the integration of both miRNA and target differential expression in the procedure described in this article provides a filter to identify the most biologically relevant interactions for downstream analysis. This approach assumes that miRNAs and targets whose expression levels change in response to the treatment variable are more likely to be important mediators of the response than those pairs whose expression levels do not change significantly. This is a reasonable assumption given that the expression of an miRNA and its mRNA target tend to be correlated, an attribute that has been exploited successfully by us and others to discover relevant miRNA/target pairs in plants (Ji et al., 2018 Ma et al., 2018 Neller et al., 2018 Ye, Wang, & Wang, 2016 ). Therefore, an investigation of differentially expressed miRNAs without considering target expression only reveals half of the story. Our use of paired small RNA and mRNA samples in this procedure enables downstream application of correlation methods to further refine miRNA/target relationships.

Restriction of the analysis to targets that are differentially expressed has a limitation in that it may filter out miRNAs acting through translational inhibition rather than transcript cleavage. However, since this mechanism of action is not observed frequently in plants, the limitation is not critical unless the reader is specifically interested in miRNAs that operate in this manner. Furthermore, the two modes of miRNA action may be difficult to distinguish in plants, as miRNA-induced cleavage occurs on targets undergoing active translation (reviewed in Yu et al., 2017 ). Another limitation of our procedure is that validation by the modified RLM-RACE used in this article only provides information on the presence of cleaved targets, not their relative abundance, and it may be unsuccessful in the case of low-abundance miRNAs or targets, where less cleavage product is available for detection. A high-throughput equivalent to this procedure is degradome sequencing (Lin, Chen, & Lu, 2019 ). By incorporating RNA-seq, this method enables detection of all cleaved targets in a sample and their relative abundance. It is less economical and requires extensive data analysis, but the combination of small RNA-seq and degradome-seq is highly informative see Ji et al. ( 2018 ) for a recent implementation of this strategy.

Comparison of the bioinformatic workflow with current methods

The workflow presented in this article is based on our experience with available software options. We have prioritized qualities of open access, user friendliness, in-depth documentation, and smooth integration. Some components of our workflow are more advanced than others. For the tasks of de novo transcriptome assembly and annotation, we highly recommend Trinity and its companion software Trinotate and TransDecoder. Additionally, we suggest the use of scripts packaged with Trinity to facilitate differential expression and GO enrichment analyses. Each of these tasks requires an advanced level of expertise that can overwhelm a novice user, resulting in incorrect application of methods. For this reason, we view the integration and guidance provided by Trinity developers as highly advantageous. However, other options do exist for de novo transcriptome assembly. For a plant-focused summary of these tools and other resources, see Geniza and Jaiswal ( 2017 ). Additionally, refer to Honaas et al. ( 2016 ) for a comparative analysis of transcriptomes generated from different assemblers for the model plants rice and Arabidopsis. It is also possible to bypass de novo transcriptome assembly completely by performing Iso-seq, a relatively new implementation of long-read technology that has been used in plants (An, Cao, Li, Humbeck, & Wang, 2018 ). Regardless of the chosen strategy, note that Trinotate and TransDecoder can be used for annotating any transcriptome as long as the required inputs are provided.

Other aspects of the workflow are more amenable to user customization. For example, there are numerous options available for miRNA prediction and target identification (reviewed in Rajendiran et al., 2018 ). Recently, supervised machine learning was used to predict miRNAs in a reference-free manner (Vitsios et al., 2017 ). Although promising, this approach was more successful in predicting miRNAs for animals than plants. Furthermore, it is unlikely to outperform reference-based prediction for a non-model plant, as the user must provide training data consisting of known miRNAs or instead use the ‘universal plant’ model. Other options for user customization of our workflow are at the level of transcript quantification and differential expression analysis. We used the alignment-based method RSEM for transcript quantification, but alignment-free methods such as Kallisto and Salmon are also popular due to their improved speed. Although alignment-free and alignment-based methods are comparable in accuracy for standard investigations like protein-coding mRNA quantification, note that alignment-based methods perform better when quantifying small or low-abundance RNAs (Wu, Yao, Ho, Lambowitz, & Wilke, 2018 ). The reader may also wish to investigate alternatives for differential expression analysis, with popular options including DESeq2 and Voom/Limma. The Trinity accessory scripts used in our workflow support these various programs/packages for transcript quantification and differential expression analysis, thereby accommodating differences in experimental design and user preference. For a comparison of RNA-seq mapping methods (both alignment-free and alignment-based) and differential expression tools, see Costa-Silva, Domingues, and Lopes ( 2017 ).

Extended bioinformatic analysis

With the paired small RNA and mRNA samples as used in our workflow, the investigator is equipped to perform advanced correlation analysis for obtaining greater insight into miRNA/target interactions. In our study, we computed the Pearson correlation coefficient (PCC) for the expression of each miRNA and its target(s) and imposed a PCC cut-off to filter the set of candidate pairs. The PCC ranges from −1 to +1, indicating perfect negative and positive linear association, respectively. There is a tendency in literature to retain only negatively correlated miRNA/target pairs. This derives from the rationale that a cleavage-inducing miRNA acting on its target in absence of other influences leads to reduced target expression due to RNA degradation. However, we and others have observed and validated positively correlated miRNA/target pairs. This dynamic can arise from miRNA-mediated spatial restriction of the target (Kawashima et al., 2009 Kidner & Martienssen, 2004 Levine, McHale, & Levine, 2007 Nikovics et al., 2006 ). It may also indicate that the miRNA functions in a ‘buffering’ capacity, minimizing changes in target expression caused by other interacting factors (Wu, Shen, & Tang, 2009 ). For these reasons, we do not recommend restricting analysis to negatively correlated miRNA/target pairs. If readers are interested in generating an advanced miRNA/target interaction network, we direct them to reviews on the various mathematical models and integrated approaches used (Carroll, Goodall, & Liu, 2014 Muniategui, Pey, Planes, & Rubio, 2013 ). For simple visualization of predicted miRNA/target interactions, we recommend import of results from this workflow into Cytoscape (Shannon et al., 2003 ).

Wet-lab procedures

RNA extraction

High-quality RNA is essential for both RNA-seq and the validations used in this article. It consists of RNA that is primarily free of degradation by cellular nucleases and lacks contamination by genomic DNA. Extraction of RNA begins by grinding the tissue sample and solubilizing its contents. Solubilization buffers containing guanidinium compounds protect against nucleases and aid in breakdown of the cell membrane (Chomczynski, 1993 ). Following solubilization, the user can continue with a reagent-based extraction, such as with RNAzol, or switch to purification with silica columns. RNAzol is advantageous as it enables convenient isolation of the small RNA fraction and contains additives to reduce genomic DNA contamination. Alternatively, silica-based purification allows much faster RNA isolation and on-column DNase treatment to remove genomic DNA however, a major drawback of this technology is its often-poor yield.

RLM-RACE

5′ RACE was originally developed to map the +1 transcription start site of mRNAs (Sambrook & Russell, 2006 ). In this application, the mRNA was reverse transcribed with an oligo d(T) primer, then terminal deoxytransferase (TdT) was used to add multiple nucleotides to the 3′ end of the cDNA (known as ‘tailing’) to produce an adapter sequence. RLM-RACE forgoes tailing and instead ligates a 5′ RNA adapter directly to an mRNA pool that has been phosphatase-treated and decapped to select for full-length mRNAs. This is ideal for the original application of the method but not for validating miRNA-induced cleavage events, since the targeted mRNA is sliced. To modify this procedure for detecting cleaved products, we omitted the selection of full-length mRNAs, resulting in any exposed 5′ phosphate in the mRNA pool becoming ligated to the RNA adapter. Subsequent amplification with PCR and cloning with Gibson assembly allows the identification of 5′ cut sites of specific mRNA targets.

RLM-RACE is superior to 5′ RACE for detecting miRNA-induced cleavage. T4 RNA ligase is efficient at adding an RNA adapter to the 5′ end of mRNA, while TdT used to tail the cDNA in 5′ RACE can add nucleotides to ssDNA, dsDNA, and, at a lower efficiency, RNA, meaning there is less specificity for the cDNA of cleaved mRNA. Additionally, RLM-RACE avoids potential artifacts caused by the reverse transcriptase stalling during cDNA synthesis. As described above, degradome-seq is a high-throughput equivalent to the modified RLM-RACE used in this article, enabling relative quantification of all cleaved targets. To quantify miRNA-directed repression regardless of whether it derives from transcript cleavage or translational inhibition, a transient dual luciferase assay has been optimized for use in Nicotiana benthamiana (Moyle et al., 2017 ).

QRT-PCR and stem-loop qRT-PCR

qRT-PCR is a common and rapid method for relative RNA quantification. The transcript of interest is quantified in both the treated and untreated sample, with the change in expression normalized to that of an internal control transcript in each sample to account for differences in amount of starting RNA. Internal controls are often referred to as ‘housekeeping’ genes for their stable expression across various treatments. In this article, we use qRT-PCR and stem-loop qRT-PCR to validate expression of target mRNAs and miRNAs, respectively. Design of primers for standard qRT-PCR is relatively straightforward: the two primers should produce a product of 150 to 200 bp. To identify and reduce the impact of genomic DNA contamination in the RNA sample, primers should span an intronic region if one is known to exist. Stem-loop qRT-PCR, developed by Chen et al. ( 2005 ), uses a stem-loop primer complementary to the last six bases on the 3′ end of the miRNA. This increases the length and melting point of the PCR product to make it compatible with standard cycling. Therefore, specificity of the PCR reaction is conferred mainly by the forward primer, which spans most of the miRNA sequence.

We use SYBR Green to measure fluorescence during qPCR, but specificity can be increased by substituting sequence-specific hydrolysis probes such as TaqMan (Applied Biosystems) or Universal ProbeLibrary (UPL, Roche Diagnostics). The probes anneal to single-stranded DNA and emit fluorescence only upon DNA polymerase-induced cleavage, which results from 5′ to 3′ exonuclease activity of the polymerase as it extends the primer. Use of these probes reduces background fluorescence due to primer dimers and increases specificity, as the probe binds between primer annealing sites. UPL probes provide increased specificity by incorporating locked nucleic acids, which are modified nucleotides with ribose rings stabilized in an ideal conformation for Watson-Crick base pairing. For a protocol utilizing UPL stem-loop qRT-PCR to quantify low-abundance plant miRNAs, see Varkonyi-Gasic, Wu, Wood, Walton, and Hellens ( 2007 ). Although beneficial, the high cost of hydrolysis probes likely excludes them from use in initial screening validations, but their incorporation may be worthwhile for characterization of a few key miRNAs.

Critical Parameters

High-quality RNA is an essential input for both RNA-seq and the validations performed in this article. General plant health is an important contributor to RNA quality, with lack of light or nutrients resulting in lesser-quality RNA. If the treatment under study is intended to elicit a stress response, the strength and duration of treatment must be optimized to avoid impacting overall RNA quality. When harvesting plants, tissue should be flash-frozen in liquid nitrogen and processed immediately. Use of pre-chilled tools and tubes prevents frozen tissue from melting, thereby limiting nuclease activity. If liquid nitrogen is unavailable, tissue can be preserved in saturated ammonium sulfate solution, such as RNAlater (Ambion). Note that the lysate is stable upon solubilization in RNAzol and can be stored long-term at −20°C. Once extracted, RNA is susceptible to degradation, by nucleases and resulting from hydrolysis under basic conditions. Both factors can be controlled by resuspending RNA pellets in RNA storage buffer, which contains DTT to inactivate ribonucleases and citrate buffer to reduce pH and chelate metal ions.

Sufficient computational power and memory are required to perform RNA-seq analysis. Raw data and output files must be stored, and the workflow must be able to complete in a reasonable timeframe. We performed all analysis for the full-scale job using a personal server with 64 Gb RAM and a 4 Tb hard drive. If suitable infrastructure is not available, public options for researchers include Galaxy and CyVerse (originally iPlant Collaborative Merchant et al., 2016 ) for both high-performance computing and data storage. We introduce the user to Galaxy in this article.

Certain aspects of the RNA-seq experimental design and bioinformatic workflow are essential to include. If differential expression analysis is performed, both biological replicates and strand-specific reads must be incorporated. The former allow for an assessment of sample variability, while the latter ensures accurate transcript quantification. Note that many peer-reviewed journals now require a minimum of three biological replicates for inclusion of RNA-seq differential expression analysis. It is also essential to quality control the raw reads prior to analysis. Contaminating adapter sequences create artifacts in both the assembled transcriptome and small RNA sequences, and low-quality bases introduce sequence errors. Both issues interfere with transcriptome assembly, differential expression analysis, and miRNA prediction.

Factors affecting success of wet-lab validations are also important to consider. Low-abundance miRNAs (<10 CPM) and targets (<100 TPM) are difficult to detect. Cleaved mRNA is quickly degraded in the cell, so a low initial abundance further inhibits detection by RLM-RACE. Similarly, low abundance results in undetectable or variable Ct values during qRT-PCR. Another critical factor for a successful qRT-PCR experiment is the selection of appropriate internal controls. A preliminary test should be performed to ensure that expression is stable for the treatment under study. Two popular programs that aid in the selection of internal controls are NormFinder (Aanes et al., 2014 ) and geNorm (Vandesompele et al., 2002 ). These programs use pairwise comparisons of expression data to rank the stability of reference genes. Both are available as Microsoft Excel plugins, which allows analysis without extensive bioinformatics knowledge. However, these programs are unable to process large transcriptome datasets with ease. We reduced the list of input reference genes by calculating the mean, standard deviation, and relative standard deviation of abundance for each transcript across all samples using Excel. Relative standard deviation is calculated by multiplying standard deviation by 100 and dividing by the mean. Transcripts were sorted first by lowest relative standard deviation and then by highest mean expression level. Such transcripts would vary little in level across different treatments and would be of sufficient abundance to detect reliably. The reduced gene list was used as input for NormFinder. The final list of candidate reference genes was verified with qRT-PCR across the different treatments tested.


Ver el vídeo: Biogenesis of miRNAs and mode of action (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Bajas

    Creo que permitirás el error. Escríbeme en PM, discutiremos.

  2. Matteo

    Perdón por intervenir, pero no podrías dar un poco más de información.

  3. Danaus

    Una persona nunca se da cuenta de todas sus capacidades mientras está encadenada al suelo. Debemos despegar y conquistar los cielos.

  4. Rosswald

    En todo personal enviar hoy?

  5. Tojajind

    ¡Las publicaciones interesantes son definitivamente tu estilo!

  6. Dizuru

    ¿Qué en tal caso hacer?



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