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Precisión de la estimación del tamaño del genoma mediante citometría de flujo

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Estoy trabajando en un proyecto de genoma y estoy usando un en silico k-mer análisis para estimar el tamaño de nuestro genoma en función de las lecturas de Illumina disponibles. los kLa estimación basada en mer es consistente en una amplia gama de k valores, pero es sustancialmente menor que la estimación anterior basada en la citometría de flujo (descrita en Procedimientos experimentales de este artículo). ¿Qué tan precisas son las estimaciones del tamaño del genoma basadas en la citometría de flujo?


Cada día, a medida que crece la cantidad de datos genómicos y recursos bioinformáticos, los investigadores se enfrentan cada vez más al desafío de seleccionar el enfoque más apropiado para analizar sus datos. Además, la oportunidad de realizar análisis genómicos comparativos está creciendo rápidamente. Esto es especialmente cierto para los hongos debido a sus pequeños tamaños de genoma (es decir, media 1C = 44,2 Mb). Dadas estas oportunidades y con el objetivo de obtener conocimientos novedosos sobre la evolución de los mutualismos, nos enfocamos en comparar la calidad de conjuntos genómicos completos para cultivares de hormigas que crecen hongos (Hymenoptera: Formicidae: Attini) y un pariente de vida libre. Nuestros análisis revelan que las metodologías y las canalizaciones disponibles actualmente para analizar los datos de la secuencia del genoma completo necesitan refinarse. Mediante el uso de diferentes ensambladores del genoma, mostramos que el tamaño del ensamblaje del genoma depende del software que se utilice. Esto, a su vez, impacta en las predicciones del número de genes, y los números de genes más altos se correlacionan positivamente con el tamaño del ensamblaje del genoma. Además, la mayoría de los datos sobre el tamaño del genoma fúngico actualmente disponibles se basan en estimaciones derivadas de conjuntos de genoma completo generados a partir de datos del genoma de lectura corta, en lugar de la técnica más precisa de citometría de flujo. Aquí, estimamos los tamaños del genoma haploide de tres simbiontes de hongos hormiga mediante citometría de flujo utilizando el hongo Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. (1871) como patrón de calibración. Descubrimos que los tamaños de genomas publicados basados ​​en conjuntos de genomas son de 2,5 a 3 veces más grandes que nuestras estimaciones basadas en la citometría de flujo. Por lo tanto, recomendamos que se utilice la citometría de flujo para precalibrar las tuberías de ensamblaje del genoma, para evitar estimaciones incorrectas de los tamaños del genoma y garantizar ensamblajes robustos.

La secuenciación y los análisis del genoma aumentan a diario debido a la disminución de los costos; sin embargo, el análisis de los datos puede resultar difícil a veces debido a la gran disponibilidad de software que puede conducir a ensamblajes erróneos del genoma. En nuestro estudio, mostramos que un software diferente puede llevar a conclusiones diferentes para los mismos datos del genoma, es decir, cuando el ensamblaje del genoma es más largo, el número de genes que se pueden predecir a partir de ese ensamblaje también aumenta. Demostramos que midiendo con precisión el tamaño del genoma mediante citometría de flujo, los datos resultantes pueden ayudar como control de calidad para los ensamblajes del genoma.


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Análisis de los tamaños del genoma de las plantas mediante citometría de flujo: un estudio de caso que demuestra el rango dinámico y la linealidad de la medición

Los citómetros de flujo se diseñaron originalmente para operar con suspensiones de células, prototípicamente de células sanguíneas, y la mayoría de las aplicaciones todavía involucran muestras de este tipo. A pesar de que las células vegetales y sus protoplastos son generalmente más grandes que las células sanguíneas de los mamíferos, estas células aún pueden analizarse mediante citometría de flujo. En la mayoría de las etapas de crecimiento, las plantas superiores se componen de tejidos y órganos, conjuntos tridimensionales complejos de células unidas por paredes celulares. En consecuencia, antes del análisis, las plantas deben procesarse primero para producir suspensiones celulares que sean compatibles con la citometría de flujo. Un enfoque consiste en disolver las paredes celulares, utilizando enzimas que hidrolizan sus componentes de carbohidratos, para liberar protoplastos, que luego pueden analizarse fácilmente en el citómetro.

El segundo enfoque, que se detalla aquí con CytoFLEX, implica el análisis no de protoplastos, sino de suspensiones de núcleos liberados de tejidos y órganos vegetales mediante un sencillo procedimiento de picado (2). El procedimiento implica abrir las células dentro de los tejidos usando una hoja de afeitar estándar de doble filo. El homogeneizado se clarifica utilizando un filtro de malla de nailon a través del cual pasan los núcleos liberados. Luego, los núcleos se tiñen con fluorocromos específicos de ADN, lo que permite la determinación por citometría de flujo del contenido de ADN de los núcleos individuales. El interés en la medición de los tamaños del genoma de las plantas se deriva de la observación de que las plantas superiores, cuando se analizan entre especies, muestran una gama extraordinariamente grande de tamaños de genomas: un límite inferior actual de alrededor de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae hasta un límite superior de 304,40 pg. para Paris japonica (3). El último genoma es aproximadamente 50 veces más grande que el genoma humano, y el ADN de una sola célula de Paris japonica, cuando se estira, se extenderá aproximadamente 91 metros.

La citometría de flujo junto con el procedimiento de corte proporciona un medio simple para determinar el tamaño del genoma que es generalmente aplicable a todas las especies y la metodología se ha adoptado ampliamente en todo el mundo para abordar numerosos problemas en biología básica y aplicada, ecología y agricultura. Esto incluye aplicaciones en biotecnología, como monitorear la estabilidad genética después de la transformación y cultivo de tejidos, priorizar especies para la secuenciación del genoma completo, validar la integridad de conjuntos de genoma completo y proporcionar una planificación adecuada para procedimientos de ingeniería genética como la producción de bibliotecas de ADN. Las aplicaciones en agricultura que se benefician de la citometría de flujo incluyen la producción de líneas haploides y dihaploides usando cultivo de anteras / ovarios, seguido de la duplicación de colchicina, producción de líneas triploides estériles en semillas, producción de plantas que tienen niveles tetraploides y ploidía más altos, asociados con rasgos deseados tales como tamaño del fruto, control de calidad del estado de euploidía para lotes de semillas comerciales, identificación de individuos que tienen niveles novedosos de ploidía y que muestran modos de reproducción novedosos (incluida la apomixis), caracterización de la hibridación interespecífica basada en contenidos intermedios de ADN nuclear, clasificación de distribuciones de ploidía dentro de colecciones de germoplasma, determinación del sexo en plantas dioicas e identificación de híbridos formados entre especies silvestres y entre especies silvestres y cultivadas.

Las aplicaciones en anatomía vegetal, biología celular, fisiología y desarrollo que se benefician de la citometría de flujo incluyen el estudio de la regulación del ciclo de división celular y de la endorreduplicación en el desarrollo de las plantas, y los efectos del estrés abiótico y biótico en estos procesos. La citometría de flujo también ha llevado a investigaciones generalizadas sobre el concepto de nucleotipo, es decir, el efecto fenotípico de la cantidad de ADN nuclear, independientemente de su contenido informativo codificado, sobre el volumen nuclear, las proporciones del núcleo ocupado por cromosomas, las duraciones de mitosis y meiosis, tamaño de semilla y tiempo mínimo de generación. La citometría de flujo también es útil para la detección de mixoploidía y quimerismo. El análisis de la expresión génica en función del tipo de célula, utilizando núcleos clasificados por flujo, se reconoce cada vez más como un campo importante de investigación. En taxonomía y sistemática, la citometría de flujo es invaluable en el cribado de modos de reproducción, identificación de especiación y aislamiento reproductivo, descripción de la dinámica poblacional en zonas híbridas, descubrimiento de nuevos citotipos y de la estructura del citotipo en poblaciones a gran escala, detección y delimitación de plantas. especies para la biodiversidad y la conservación, estudios de los mecanismos de evolución del genoma de las plantas centrados en las causas y consecuencias de la variación del contenido del ADN nuclear, e información sobre la evolución procedente del estudio del contenido del ADN nuclear entre filogenias. Los análisis comparativos a gran escala del tamaño del genoma también se pueden utilizar para estudiar las correlaciones entre el tamaño del genoma y los factores ambientales, entre el tamaño del genoma y la masa de semillas, entre el tamaño del genoma y la riqueza de especies en diferentes grupos de plantas, con la sugerencia de que las especies que tienen genomas grandes pueden ser más susceptibles a la extinción, entre el tamaño del genoma y el potencial invasor, y entre el nicho ecológico y el tamaño mínimo del genoma (en particular las plantas carnívoras).

Como consecuencia del creciente nivel de interés en los análisis de citometría de flujo de este tipo, y el número cada vez mayor de especies para las que se publican datos, los repositorios de búsqueda han surgido como un recurso valioso para la asignación de contenido de ADN a los tamaños del genoma, a través de proporcionando relaciones de calibración, con el consenso que se aborda de una manera de fuentes múltiples. Uno de los más importantes de estos recursos es la base de datos de valor C de Kew, que está curada por expertos y proporciona valores de contenido de ADN nuclear en función del género y la especie, en forma de búsqueda a través de Internet (3). Los curadores también definen valores de contenido de ADN nuclear & ldquoGold-standard & rdquo, que se cree que son más precisos y reproducibles (3). En general, las estimaciones de citometría de flujo del contenido de ADN nuclear son comparables a los tamaños de los ensamblajes de la secuenciación del genoma completo, aunque la presencia de ADN cromosómico altamente repetitivo generalmente conduce a estimaciones de tamaño del genoma más bajas obtenidas de enfoques basados ​​en secuencias. Se han identificado y pueden evitarse varios factores que tienen el potencial de confundir la calibración citométrica de flujo. Por ejemplo, la unión y la fluorescencia resultante de algunos fluorocromos específicos de ADN es específica de pares de bases y, por lo tanto, no es una medida verdadera de la cantidad de ADN entre especies que tienen genomas nucleares con diferentes proporciones AT: GC.

En este protocolo, empleamos yoduro de propidio (PI) como el fluorocromo de ADN. En presencia de ribonucleasa para eliminar las contribuciones a la fluorescencia del ARN bicatenario, el PI intercala la doble hélice del ADN, produciendo una fluorescencia intensa con un máximo de excitación alrededor de 535 nm y un máximo de emisión a 617 nm. El perfil de emisión es relativamente amplio y tiene un ancho espectral máximo del 50% que abarca aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

Se utilizó PI para evaluar el contenido de ADN de cuatro especies: Arabidopsis thaliana (thale berro) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (maíz) y Capsicum annuum (pimiento). Los órganos utilizados para preparar las muestras de Arabidopsis y Capsicum ilustran el interesante fenómeno de endorreduplicación, en el que las células somáticas entran en sucesivas rondas de replicación del genoma (fase S) sin una mitosis intermedia (4). Este proceso endocíclico da como resultado poliploidía, que es común en las plantas (7).

Figura. La citometría de flujo mide eficazmente la endoreplicación en células vegetales. La imagen de la derecha muestra varios tipos de replicación de genes mitóticos durante el ciclo celular. Estos eventos dan como resultado tejidos poliploides. A la izquierda se muestra el flujo de trabajo para preparar tejidos vegetales mediante citometría de flujo, incluidos los datos que indican los resultados del endociclado mitótico.


2 MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Material vegetal

Un total de 127 accesiones etiquetadas como Festuca ovina de 20 países se obtuvieron de la Red de Información de Recursos de Germoplasma del USDA (GRIN) en 2016 (Tabla complementaria S1). Las semillas de cada accesión se sembraron en macetas de invernadero (tamaño de cuatro pulgadas) llenas de tierra BRK Promix (Premier Tech) en el Plant Growth Facility de la Universidad de Minnesota en St. Paul. Después de alcanzar la etapa de cuatro a cinco hojas, se seleccionaron al azar cinco plántulas por accesión y se trasplantaron a un recipiente individual de cono de una pulgada. Las plantas se cultivaron con 16 h de día y 8 h de noche con riego bidiario y fertilización semanal utilizando fertilizante Peat-lite 20-10-20 (J.R. Peters Inc.) con sulfato de amonio suplementario y hierro quelado más Mn (BASF). Los cinco genotipos de cada accesión se clonaron vegetativamente en seis réplicas de cada genotipo y se trasplantaron a un vivero de campo en la Estación Experimental Agrícola de Minnesota en St. Paul, MN. Festuca ovina "Quatro" y F. brevipila También se plantaron "balizas" en el campo como estándares.

2.2 Procedimiento de citometría de flujo

Para determinar el contenido de ADN nuclear de las accesiones, se llevó a cabo una citometría de flujo utilizando el método descrito por Arumuganathan y Earle (1991). Debido a que las semillas utilizadas en este estudio resultaron de la polinización abierta, evaluamos tres genotipos para cada accesión para obtener una representación de ploidía más precisa de la población. Cuando los tres genotipos seleccionados no estaban al mismo nivel de ploidía, se evaluó un cuarto genotipo. El nivel de ploidía de la accesión fue determinado por la ploidía de la mayoría de los genotipos (75%).

Fresco, maduro F. ovina Las muestras de hojas en el campo del vivero se recolectaron entre las 9:00 a.m. y las 11:00 a.m. y se recortaron a 1-2 cm y se utilizaron para citometría de flujo. El tejido de la hoja perenne de raigrás se recogió al mismo tiempo en el invernadero. Para cada muestra, la solución de tinción de citometría de flujo contenía 4,29 μl de yoduro de propidio, 0,71 ml de tampón de tinción CyStain UV Precise P y 2,14 μl de ARNasaA. Para preparar tejido vegetal, se cortó una muestra de hoja de 0,5 por 0,5 cm en pequeños trozos con una hoja de afeitar en 500 μl de tampón de extracción CyStain UV Precise P (Sysmex) y se pasó a través de un filtro de 50 μl (Sysmex). La solución de tinción se añadió al flujo a través para teñir los núcleos de cada muestra. Las muestras se almacenaron en hielo antes de cargar el citómetro de flujo. La citometría de flujo se llevó a cabo usando el instrumento BD LSRII H4760 (BD Biosciences) con detector láser PI usando 480V con un mínimo de 1,000 eventos en el recurso de citometría de flujo de la Universidad de Minnesota. Los datos se visualizaron y analizaron en el software BD Biosciences FACSDiva 8.0.1.

2.3 Estimación del contenido de ADN y determinación del nivel de ploidía

2.4 Medición y comparación del tamaño de la semilla

Para medir el tamaño de las semillas, seleccionamos semillas de accesiones con niveles de ploidía comunes para realizar la comparación del tamaño de las semillas (un total de 92 accesiones). También se incluyeron como referencias tetraploid Quatro y hexaploid Beacon. Las semillas se esparcieron en un escáner digital (escáner plano Epson perfection v6, Nagano, Japón) y se escanearon a 600 puntos por pulgada con un tamaño de 2169 por 7019 píxeles. Las imágenes se procesaron con un script Python personalizado (https://github.com/joanmanbar/seed_morphology) que transformó las imágenes originales para medir la longitud y el ancho de la semilla respectivamente como la longitud (en píxeles) de los ejes mayor y menor de un elipse ajustada, mientras que el área se calculó como el número de píxeles en la semilla. Se calculó el área de semillas para al menos 10 semillas para cada una de las 92 entradas. El área de la semilla se usó para analizar la correlación entre el nivel de ploidía y el tamaño de la semilla y se visualizó usando el paquete ggplot2 en R (Kahle & Wickham, 2013).


Abstracto

Frijol racimo (C. tetragonoloba) es un importante cultivo de hortalizas e industriales leguminosas con una gran diversidad genética pero escasa información genética, citológica y genómica. En el presente estudio, se utilizó un procedimiento optimizado de citometría de flujo para estimar el tamaño del genoma de tres especies de frijol racimo, representadas por C. tetragonoloba (cv. RGC-936) y dos parientes silvestres (C. serreta y C. senegalensis). Para una estimación precisa del contenido genómico, singlete G0/GRAMO1 Se determinaron y utilizaron poblaciones de múltiples tejidos, como hojas, hipocótilo y semillas maduras, junto con tres especies de plantas diferentes, a saber. Pisum sativum (como primario), Oryza sativa, y Glicina max (secundario), como estándares de referencia externos e internos. Tejido de semilla de la muestra de prueba y G. max proporcionó la mejor estimación del contenido de ADN nuclear en comparación con otras muestras de tejidos y patrones de referencia. El tamaño del genoma de C. tetragonoloba se determinó en 580,9 ± 0,02 Mbp (1C), mientras que el de C. serreta y C. senegalensis se estimó en 979,6 ± 0,02 Mbp (1C) y 943,4 ± 0,03 Mbp (1C), respectivamente. Por lo tanto, los parientes silvestres albergan casi el doble del contenido de genoma del frijol de racimo cultivado. Los resultados de este estudio enriquecerán la base de datos genómica de la familia de las leguminosas y pueden servir como punto de partida para estudios genómicos y evolutivos del frijol de racimo.


Análisis de los tamaños del genoma de las plantas mediante citometría de flujo: un estudio de caso que demuestra el rango dinámico y la linealidad de la medición

Los citómetros de flujo se diseñaron originalmente para operar con suspensiones de células, prototípicamente de células sanguíneas, y la mayoría de las aplicaciones todavía involucran muestras de este tipo. A pesar de que las células vegetales y sus protoplastos son generalmente más grandes que las células sanguíneas de los mamíferos, estas células aún pueden analizarse mediante citometría de flujo. En la mayoría de las etapas de crecimiento, las plantas superiores se componen de tejidos y órganos, conjuntos tridimensionales complejos de células unidas por paredes celulares. En consecuencia, antes del análisis, las plantas deben procesarse primero para producir suspensiones celulares que sean compatibles con la citometría de flujo. Un enfoque consiste en disolver las paredes celulares, utilizando enzimas que hidrolizan sus componentes de carbohidratos, para liberar protoplastos, que luego pueden analizarse fácilmente en el citómetro.

El segundo enfoque, que se detalla aquí con CytoFLEX, implica el análisis no de protoplastos, sino de suspensiones de núcleos liberados de tejidos y órganos vegetales mediante un sencillo procedimiento de picado (2). El procedimiento implica abrir las células dentro de los tejidos usando una hoja de afeitar estándar de doble filo. El homogeneizado se clarifica utilizando un filtro de malla de nailon a través del cual pasan los núcleos liberados. Luego, los núcleos se tiñen con fluorocromos específicos de ADN, lo que permite la determinación por citometría de flujo del contenido de ADN de los núcleos individuales. El interés en la medición de los tamaños del genoma de las plantas se deriva de la observación de que las plantas superiores, cuando se analizan entre especies, muestran una gama extraordinariamente grande de tamaños de genomas: un límite inferior actual de alrededor de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae hasta un límite superior de 304,40 pg. para Paris japonica (3). El último genoma es aproximadamente 50 veces más grande que el genoma humano, y el ADN de una sola célula de Paris japonica, cuando se estira, se extenderá aproximadamente 91 metros.

La citometría de flujo junto con el procedimiento de corte proporciona un medio simple para determinar el tamaño del genoma que es generalmente aplicable a todas las especies y la metodología se ha adoptado ampliamente en todo el mundo para abordar numerosos problemas en biología básica y aplicada, ecología y agricultura. Esto incluye aplicaciones en biotecnología, como monitorear la estabilidad genética después de la transformación y cultivo de tejidos, priorizar especies para la secuenciación del genoma completo, validar la integridad de conjuntos de genoma completo y proporcionar una planificación adecuada para procedimientos de ingeniería genética como la producción de bibliotecas de ADN. Las aplicaciones en agricultura que se benefician de la citometría de flujo incluyen la producción de líneas haploides y dihaploides usando cultivo de anteras / ovarios, seguido de la duplicación de colchicina, producción de líneas triploides estériles en semillas, producción de plantas que tienen niveles tetraploides y ploidía más altos, asociados con rasgos deseados tales como tamaño del fruto, control de calidad del estado de euploidía para lotes de semillas comerciales, identificación de individuos que tienen niveles novedosos de ploidía y que muestran modos de reproducción novedosos (incluida la apomixis), caracterización de la hibridación interespecífica basada en contenidos intermedios de ADN nuclear, clasificación de distribuciones de ploidía dentro de colecciones de germoplasma, determinación del sexo en plantas dioicas e identificación de híbridos formados entre especies silvestres y entre especies silvestres y cultivadas.

Las aplicaciones en anatomía vegetal, biología celular, fisiología y desarrollo que se benefician de la citometría de flujo incluyen el estudio de la regulación del ciclo de división celular y de la endorreduplicación en el desarrollo de las plantas, y los efectos del estrés abiótico y biótico en estos procesos. La citometría de flujo también ha llevado a investigaciones generalizadas sobre el concepto de nucleotipo, es decir, el efecto fenotípico de la cantidad de ADN nuclear, independientemente de su contenido informativo codificado, sobre el volumen nuclear, las proporciones del núcleo ocupado por cromosomas, las duraciones de mitosis y meiosis, tamaño de semilla y tiempo mínimo de generación. La citometría de flujo también es útil para la detección de mixoploidía y quimerismo. El análisis de la expresión génica en función del tipo de célula, utilizando núcleos clasificados por flujo, se reconoce cada vez más como un campo importante de investigación. En taxonomía y sistemática, la citometría de flujo es invaluable en el cribado de modos de reproducción, identificación de especiación y aislamiento reproductivo, descripción de la dinámica poblacional en zonas híbridas, descubrimiento de nuevos citotipos y de la estructura del citotipo en poblaciones a gran escala, detección y delimitación de plantas. especies para la biodiversidad y la conservación, estudios de los mecanismos de evolución del genoma de las plantas centrados en las causas y consecuencias de la variación del contenido del ADN nuclear, e información sobre la evolución procedente del estudio del contenido del ADN nuclear entre filogenias. Los análisis comparativos a gran escala del tamaño del genoma también se pueden utilizar para estudiar las correlaciones entre el tamaño del genoma y los factores ambientales, entre el tamaño del genoma y la masa de semillas, entre el tamaño del genoma y la riqueza de especies en diferentes grupos de plantas, con la sugerencia de que las especies que tienen genomas grandes pueden ser más susceptibles a la extinción, entre el tamaño del genoma y el potencial invasor, y entre el nicho ecológico y el tamaño mínimo del genoma (en particular las plantas carnívoras).

Como consecuencia del creciente nivel de interés en los análisis de citometría de flujo de este tipo, y el número cada vez mayor de especies para las que se publican datos, los repositorios de búsqueda han surgido como un recurso valioso para la asignación de contenido de ADN a los tamaños del genoma, a través de proporcionando relaciones de calibración, con el consenso que se aborda de una manera de fuentes múltiples. Uno de los más importantes de estos recursos es la base de datos de valor C de Kew, que está curada por expertos y proporciona valores de contenido de ADN nuclear en función del género y la especie, en forma de búsqueda a través de Internet (3). Los curadores también definen valores de contenido de ADN nuclear & ldquoGold-standard & rdquo, que se cree que son más precisos y reproducibles (3). En general, las estimaciones de citometría de flujo del contenido de ADN nuclear son comparables a los tamaños de los ensamblajes de la secuenciación del genoma completo, aunque la presencia de ADN cromosómico altamente repetitivo generalmente conduce a estimaciones de tamaño del genoma más bajas obtenidas de enfoques basados ​​en secuencias. Se han identificado y pueden evitarse varios factores que tienen el potencial de confundir la calibración citométrica de flujo. Por ejemplo, la unión y la fluorescencia resultante de algunos fluorocromos específicos de ADN es específica de pares de bases y, por lo tanto, no es una medida verdadera de la cantidad de ADN entre especies que tienen genomas nucleares con diferentes proporciones AT: GC.

En este protocolo, empleamos yoduro de propidio (PI) como el fluorocromo de ADN. En presencia de ribonucleasa para eliminar las contribuciones a la fluorescencia del ARN bicatenario, el PI intercala la doble hélice del ADN, produciendo una fluorescencia intensa con un máximo de excitación alrededor de 535 nm y un máximo de emisión a 617 nm. El perfil de emisión es relativamente amplio y tiene un ancho espectral máximo del 50% que abarca aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

Se utilizó PI para evaluar el contenido de ADN de cuatro especies: Arabidopsis thaliana (thale berro) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (maíz) y Capsicum annuum (pimiento). Los órganos utilizados para preparar las muestras de Arabidopsis y Capsicum ilustran el interesante fenómeno de endorreduplicación, en el que las células somáticas entran en sucesivas rondas de replicación del genoma (fase S) sin una mitosis intermedia (4). Este proceso endocíclico da como resultado poliploidía, que es común en las plantas (7).

Figura. La citometría de flujo mide eficazmente la endoreplicación en células vegetales. La imagen de la derecha muestra varios tipos de replicación de genes mitóticos durante el ciclo celular. Estos eventos dan como resultado tejidos poliploides. A la izquierda se muestra el flujo de trabajo para preparar tejidos vegetales mediante citometría de flujo, incluidos los datos que indican los resultados del endociclado mitótico.


Sobre la aplicación de la citometría de flujo en la determinación del tamaño genómico de las plantas de bambú

Doi: 10.11833 / j.issn.2095-0756.20200212
  • Fecha de recepción: 2020-03-18
  • Rev Recd Date: 2020-09-28
  • Disponible en linea: 2021-01-21
  • Fecha de publicación: 2021-01-21

Abstracto: Objetivo Esta investigación tiene como objetivo estudiar los efectos del tejido material y el método de tratamiento sobre el tamaño del genoma de las plantas de bambú con el fin último de mejorar la precisión de la determinación del tamaño del genoma de las plantas de bambú. Método Con las hojas y brotes de diferentes especies de bambú seleccionados como materiales, y el arroz utilizado como patrón de referencia mientras que el tiempo de tinción nuclear se establece para 9 gradientes diferentes, es decir 1, 3, 5, 7, 9, 12, 18, 24 y 30 minutos, se llevó a cabo una investigación de los sitios de tejidos y materiales de tinción de diferentes plantas de bambú con el empleo de citometría de flujo. Resultado (1) Con la misma especie de bambú, las hojas y los brotes eran similares en el pico de fluorescencia y el tamaño del genoma con un rango de diferencia de tamaño del genoma tan estrecho como 0.04

0,20 pág. (2) Las 12 especies de bambú son diferentes en su tiempo de tinción nuclear, con la intensidad de fluorescencia de Sinobambusa tootsik, Sinobambusa tootisik F. albo-striata, Pseudosasa japonica var. tsutsumiana, Pseudosasa japonica F. akebono, Indocalamus decorus, Sasaella glabra F. albo-striata y Chimonobambusa mamorea F. variegata alcanzando el máximo en 1 minuto, el de Bambusa multiplex y Phyllostachys sulphurea alcanzando el máximo en 3 minutos, el de Pseudosasa amabilis var. amabilis y Thyrsostachy ssiamensis alcanzando el máximo en 5 minutos, mientras que el de Phyllostachys sulphurea (hoja) alcanzando el máximo en 7 minutos. (3) La intensidad de fluorescencia de los 12 bambúes varía mucho de 1 a 30 minutos, todos excediendo el 5% excepto la hoja de P. amabilis var. amabilis, T. ssiamensis, B. multiplex y el rodaje de S. tootsik. De hecho, la intensidad de fluorescencia de P. japonica var. tsutsumiana y S. glabra F. albo-striata han alcanzado el 12,93% y el 12,88% respectivamente. (4) En cuanto al tamaño del genoma de 12 especies de bambú, 2 especies de bambú leñoso tropical de B. multiplex y T. ssiamensis cambió de (2.64 ± 0.54) pg a (2.69 ± 1.01) pg, sin embargo, la de las 10 especies de bambú leñoso templado cambió de (3.76 ± 1.51) pg a (5.73 ± 1.85) pg de las 10 especies de bambú templado, el genoma tamaño de Phyllostachys cambió de (3.76 ± 1.51) pg a (3.91 ± 0.95) pg, sin embargo, el del otro género de bambú cambió de (4.82 ± 0.54) pg a (5.73 ± 1.85) pg, que obviamente es más grande que Phyllostachys. Conclusión (1) Tanto las hojas como los brotes de bambú se pueden utilizar como materiales experimentales para determinar el tamaño de su genoma mediante citometría de flujo. El tiempo de tinción nuclear tiene cierto efecto sobre la determinación del tamaño del genoma del bambú con 3 a 5 minutos como tiempo de tinción óptimo. (2) El tamaño del genoma de las especies de bambú leñoso tropical es obviamente más pequeño que el de las especies de bambú leñoso templado, mientras que entre las especies de bambú leñoso templado, el tamaño del genoma de Phyllostachys es obviamente más pequeño que el de las otras especies de bambú del género. [Ch, 1 fig. 5 pestaña. 29 ref.]

流式细胞 术 是 指 利用 流式细胞 仪 对 悬浮 细胞 或 微粒 等 进行 分析 的 现代 分析 技术 , 该 技术 可 对 一些 特异 的 细胞 和 染色体 等 进行 分析 和 分 选 , 还可 对 动植物 基因 组 大小 及 倍性 水平 等 进行 测定 和 分析 [1-3]。 在 分析 植物 基因 组 大小 过程 中 , 与 传统 的 福尔 根 染色 技术 相比 , 流式细胞 术 具有 速度 快 、 准确性 高等 优点。 因此 目前 流 式细胞 术 在 植物 基因 组 大小 研究 中 发挥 了 重要 的 作用 , 约 265 种 菊 科 Asteraceae 植物 、 157 种 莎草 科 Cyperaceae 植物 及 191 种 毛茛 属Ranúnculo植物 的 基因 组 大小 已 通过 流式细胞 仪 被 测定 [2, 4 - 7] , 大量 植物 的C值 (指 单倍体 细胞核 的 ADN 含量) 数据库 已 建立 [8]。 基因 组 大小 信息 可 为 植物 系统 分类 、 基因 组 测序 及 重 测序 等 研究 提供 参考 , 因此 , 提高 植物 基因 组 大小 测量 精度 至关重要 [9 - 10]。 竹类 植物 是 重要 的 森林 资源 , 全世界 约 119 属 1 482 种 , 在 中国 的 的 约 37 属 500 余 种 , 变种 变 型 100 余 种 [11 - 13]。 在 竹类 植物 基因 组 学研究 中 , 目前 仅有 毛竹Phyllostachys edulis、 莪 莉 竹Olyra latifolia、 芸香 竹Raddia guianensis及 瓜 多 竹Guadua angustifolia等 竹 种 完成 了 全 基因 组 测序 工作 , 在 整个 竹类 中 所占 比例 还 不足 0,2% [10, 14 - 15]。 另外 , 在 竹类 植物 基因 组 大小 研究 中 , 目前 约 200 个 竹 种 的 基因 组大小 通过 流式细胞 仪 被 测定 , 但 由于 不同 研究者 所 用 实验 内参 、 仪器 类型 及 实验 方法 不同 , 部分 竹 种 在 测量 结果 间 存在 一定 差异 [16 - 19]。 流 式 样品 制作 主要 分为 细胞核 提取和 染色 2 个 步骤 , 因 不同 植物 细胞 内含 物 及 代谢 物 成分 不同 , 所 用 细胞核 提取 液 在 组成 上 存在 较大 差异。 研究者 们 往往 会 重点 关注 细胞核 提取 液 而 忽略 染色 时间 对 实验 结果影响。 因此 , 为了 进一步 提高 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 精度 , 本 研究 分析 了 样品 采集 部位 及 染色 时间 竹类 竹类 植物 基因 组 大小 测定 的 影响 , 并 在 此 基础 上 揭示 了 , 竹 竹 此 基础 上 揭示 了 , 竹 竹 基础 上 的 了 , 竹 竹 此 上 上 揭示 了 ,基因 组 大小 , 以 期 为 竹类 植物 系统 分类 及 基因 组 测序 等 提供 参考。

1.1.材料

以 已 测序 的 水稻Oryza sativa为 参照 。12 个 竹 种 清单 及 采样 信息 见 表 1。 流式细胞 仪 分析 的 植物 材料 要求 是 新鲜 幼嫩 的 组织 部位 , 不能 进行 冷冻 和 干燥 等 处理。 竹类 植物 叶片 和 笋 均可 满足 实验要求 , 而且 方便 采集 , 特别 是 竹笋 更 适合 长时间 保存。 唐 竹Sinobambusa tootsik、 茶 竿 竹Pseudosasa amabilis var. amabilis、 孝顺 竹Bambusa multiplex及 黄皮 刚 竹Phyllostachys sulphurea等 4 个 竹 种 同时 以 叶片 和 笋 为 材料 , 花叶 唐 竹Sinobambusa tootisik F. albo-striata、 黄皮 绿 筋 竹Phyllostachys sulphurea、 平安 竹Pseudosasa japonica var. tsutsumiana、 柳叶 细竹Thyrsostachy ssiamensis、 花叶 赤 竹Sasaella glabra F. albo-striata、 美丽 箬竹Indocalamus decorus、 曙 筋 矢 竹Pseudosasa japonica F. akebono及 红 秆 寒竹Chimonobambusa mamorea F. variegata等 8 个 竹 种 主要 是 从 国内外 一些 竹 种 园 收集 而来。 这些 竹 种 数量 , 目前 尚无 笋 , 因此 , 这 8 个 竹 种 均以 叶片 为 材料。

竹 种材料 来源经纬度竹 种材料 来源经纬度
孝顺 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E茶 竿 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
柳叶 细竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E平安 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
黄皮 刚 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E曙 筋 矢 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
黄皮 绿 筋 竹浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E花叶 赤 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E美丽 箬竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
花叶 唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E红 秆 寒竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E

Tabla 1. Descripción de la distribución geográfica de 12 especies de bambú.

1.2.方法

1.2.1.流式细胞 仪 样品 制备

对于 竹类 植物 叶片 样品 , 选取 顶端 尚未 展开 的 心 叶 或 紧邻 心 叶 已 完全 展开 的 嫩叶 ; 对于 竹笋 样品 , 选择 新鲜 无 病虫害 的 嫩 笋 , 实验 过程 中 剥去 笋 壳。 用 双面 刀片 取一段 面积 约 1 cm 2 或 厚度 约 1,0 mm 的 叶片 , 面积 约 0,25 cm 2 的 嫩 笋 置于 干净 的 培养皿 中 , 然后 向 中 加入 500 μL 细胞核 提取 液 (Cystain UV Precisa P Nuclei Extraction Buffer , PARTEC , 编号 5003) 润湿 样品 , 用 锋利 的 双面 刀片 迅速 将 样品 剁碎 , 将 培养皿 倾斜 静置 1

2 min , 使 细胞核 提取 充分 , 之后 向 培养皿 中 加入 2 mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) 染色液 (Tampón de tinción P precisa de cistaína UV, PARTEC , 编号 5003) 对 细胞核 进行 , , 然后 用30 目的 滤 头 将 样品 过滤 到 进 样 管 中 , 准备 上 机 测 样。

1.2.2.流式细胞 仪 样品 测定

根据 前期 多次 预 实验 结果 , 设置 样品 染色 为 为 1、3、5、7、9、12、18、24 和 30 min 共 9 个 梯度 , 利用 流式细胞 仪 (Analizador de ploidía Partec CyFlow) 对 样品 进行测定。 为了 确保 测量 结果 的 准确性 , 每次 实验 先 以 水稻 为 参照 , 分析 已 测序 毛竹 的 基因 组 大小 , 在 此 基础 上 再 对 其他 竹 种 基因 组 大小 进行 测量 和 分析。 为了 减少 , , ,种 设置 3 个 不同 重复 , 变异 系数 控制 在 5% 以内。

1.2.3.不同 竹 种 的 ADN 含量 分析

登录C值 数据库 网站 (http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html) , 查出 水稻 二倍体 基因 组 对应 的 DNA 含量 2C为 1.0 pg , 并 推算 待测 竹 种 的 2C值 : 待测 竹 种 2C 值 (pág) = (待测 竹 种 峰值 / 水稻 峰值) × 水稻 2C 值 (1.0 pg) , 水稻 单倍体 基因 组 大小 为 466 Mb [20]。 据此 可以 推算 出 相应 竹 种 基因 组 对应 的 碱基 数。

2.1.竹类 植物 叶片 和 笋 基因 组 大小 测量 结果 分析

利用 流式细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中 , 样品 形状 形状 是 判断 实验 结果 是否 的 重要 依据。 样品 处理 过程 中 细胞核 提取 质量 越好 , 相应 的 细胞 碎片 及 杂质 越 少 , 杂 峰 就会 少, 样品 峰 往往 表现 得 尖 而 细 , 测量 误差 也 较小 , 实验 结果 较为 可靠 ; 反之 , 样品 处理 过程 中 产生 的 细胞 碎片 越 多 , 对应 的 杂 峰 也会 随之 增多 峰形状 , 实验 结果 往往 不 可靠。 从 图 1 可以 看出 : 孝顺 竹 、 唐 竹 、 茶 竿 竹 及 黄皮 刚 竹 等 4 个 竹 种 叶片 和 笋 所 呈现 的 峰 在 形状 上 均 尖 而 细 , 背景 ,非常 少。 另外 , 同一 竹 种 的 叶片 和 笋 对应 的 峰 形 和 峰值 也 十分 相似 , 如 孝顺 竹 的 叶片 和 笋 均 表现 出 双峰 , 其中 左侧 较高 的 峰 为 2C细胞 所 对应 的 峰 , 右侧 较低 的 峰 为 4C细胞 所 对应 的 峰 , 且 相同 类型 细胞 对应 的 荧光 强度 值 也 几乎 一致 (图 1A1

Figura 1. Valor máximo del citómetro de flujo de algunas hojas y brotes de bambú

理论上 , 荧光 强度 值 达到 最大 , 说明 此时 细胞核 染色 最 充分 , 获得 的 基因 大小 与其 与其 真实 值 也 最接近 为了 更 科学 地 对 竹类 植物 叶片 和 笋 对应 的 基因 组 大小 进行 比较 分析 , 以 黄 黄皮 刚 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 唐 竹 4 个 竹 种 叶片 和 笋 的 最大 荧光 强度 值为 , , 计算 出 4 个 竹 种 叶片 和 笋 对应 的 基因 组 大小。 结果 表明 : 笋 种 :对应 的 基因 组 大小 并非 完全 吻合 , 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 黄皮 刚 竹叶 片 对应 的 2C值 分别 为 (5.03 ± 2.33) 、 (4.82 ± 0.54) 、 (2.64 ± 0.50) 和 (3.76 ± 1.51) pg , 而 笋 对应 的 2C值 分别 为 (4,99 ± 1,56) 、 (5,02 ± 1,99) 、 (2,72 ± 0,59) 和 (3,86 ± 2,31) pg , 其中 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 黄皮 刚 竹叶 片 2C值 略 小于 笋 对应 的 2C值 , 差值 分别 为 0.20、0.10 和 0.08 pg , 而 唐 竹叶 片 2C值 比 其 笋 略大 0.04 pg (表 2)。 虽然 4 个 竹 种 叶片 和 笋 所获 基因 组 大小 并不 完全 吻合 , 但是 差值 非常 小 , 在 误差 允许 范围 内。 因此 , 对 竹类 植物 而言其 叶片 和 笋 均可 作为 其 基因 组 大小 研究 的 材料。

物种材料 部位2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ±
标准 差 / Mb
水稻 叶片1.00±0.00860.00±0.00
唐 竹 叶片5.03±2.334 325.80±2.33
4.99±1.564 291.40±1.56
茶 竿 竹 叶片4.82±0.544 145.20±0.54
5.02±1.994 317.20±1.99
孝顺 竹 叶片2.64±0.542 270.40±0.54
2.72±0.592 339.20±0.59
黄皮 刚 竹叶片3.76±1.513 233.60±1.51
3.86±2.313 319.60±2.31

Tabla 2. Tamaño del genoma de hojas y brotes de 4 especies de bambú

2.2.染色 时间 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 影响

表 3 表明 : 12 个 竹 种 在 一定 时间 内 达到 最大 荧光 强度 值 后 , 随着 染色 时间 延长 , 荧光 强度 值 均有 不同 程度 的 减少 , 当 染色 时间 延长 到 30 min 时 大部分 竹 种 的 荧光强度 值 基本 减少 到 最小。 首先 , 同一 竹 种 的 叶片 和 笋 的 染色 长 及 荧光 强度 变化 也不 完全相同。 以 唐 竹 为例 , 叶片 染色 1 min 荧光 强度 即 达到 最大 之后 随着 染色 , , ,荧光 强度 值 不断 减少 , 当 染色 时间 延长 到 30 min 时 , 荧光 强度 值 减少 到 最小 , 约 减少 6.23% , 而 唐 竹笋 最大 荧光 强度 则 出现 在 3 min , 之后 随着 染色 时间 延长 , 荧光 强度 减少, 染色 30 min 时 , 其 荧光 强度 减少 到 119.75 ± 1.40 , 约 减少 2.67% (表 3 和 表 4)。 其次 , 12 个 竹 种 荧光 强度 在 0

物种部位不同 染色 时间 对应 的 荧光 强度 峰值
1357912182430 minutos
水稻 24.67±0.3824.42±0.4824.2±0.5224.16±0.4224.07±0.3623.94±0.3823.8±0.3423.47±0.2723.15±0.24
唐 竹 123.98±2.33123.32±2.68122.24±3.14121.48±3.27120.81±2.72119.83±2.84118.59±3.08117.32±2.55116.25±2.19
121.85±1.51123.04±1.56122.77±1.23122.11±1.51121.86±0.78120.82±0.35120.67±0.09119.75±1.40119.87±0.60
茶 竿 竹 118.13±1.24118.81±0.59118.97±0.54118.52±1.03117.99±0.92116.27±1.73115.82±2.62115.75±2.24115.31±2.43
123.39±1.90123.67±2.00123.75±2.00123.18±2.09122.57±1.57121.37±1.87119.56±2.31118.80±1.68118.85±1.24
孝顺 竹 64.07±0.4465.20±0.5464.92±0.5964.63±0.2264.88±0.4464.54±0.8363.85±0.8363.70±0.8663.35±0.74
67.22±0.5966.90±1.1565.60±1.9764.72±2.0763.71±2.9062.85±3.1764.79±1.6460.61±5.9059.81±6.10
黄皮 刚 竹 91.20±1.8392.27±1.6092.50±1.5292.70±1.3692.54±1.3691.98±1.9190.64±2.2790.11±1.9387.70±1.09
95.21±1.8395.35±2.3194.46±3.3292.72±3.2292.09±2.8191.10±2.2889.01±2.7488.30±2.0387.66±1.87
黄皮 绿 筋 竹95.84±1.1996.37±0.9595.66±1.2295.74±1.2395.10±1.5394.68±1.8593.47±1.8192.32±2.2591.27±3.96
平安 竹 134.17±0.93133.44±0.57132.43±1.18131.34±1.49130.17±1.63129.10±1.93125.12±4.50122.36±6.36116.82±8.22
花叶 唐 竹 126.61±1.96125.97±1.71125.58±2.88124.25±2.10123.76±1.86122.98±2.18120.92±2.30118.80±3.17117.99±2.33
花叶 赤 竹 132.17±1.58131.67±1.67131.36±1.46129.64±2.47127.77±3.32124.73±3.37122.08±3.05118.56±3.82115.14±3.52
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85141.20±1.47140.06±2.06139.30±2.20138.50±1.63137.64±1.84135.40±2.90133.01±2.20129.62±3.47
美丽 箬竹 133.08±1.14132.59±2.03130.98±3.10130.03±2.85127.63±2.80125.61±3.61121.71±4.26119.82±5.21116.67±6.85
柳叶 细竹 65.67±1.4765.88±0.8366.25±1.0166.23±0.6866.09±0.4066.14±0.4266.39±0.8365.12±1.4763.30±0.96
红 秆 寒竹 132.82±0.97132.29±1.73131.62±1.88131.36±2.02130.12±2.22130.10±2.21127.39±3.91126.18±3.35123.87±3.58

Tabla 3. Valor medio bajo diferentes tiempos de teñido de 12 especies de bambú

竹 种材料 部位最大 荧光 强度最小 荧光 强度荧光 强度 减少 值变化 比例 /%
唐 竹 123.98±2.33116.25±2.197.736.23
123.04±1.56119.75±1.403.292.67
茶 竿 竹 118.97±0.54115.31±2.433.653.07
123.75±2.00118.80±1.684.954.00
孝顺 竹 65.20±0.5463.35±0.741.852.84
67.22±0.5959.81±6.107.4111.02
黄皮 刚 竹 92.70±1.3687.70±1.095.005.39
95.35±2.3187.66±1.877.698.07
黄皮 绿 筋 竹96.37±0.9591.27±3.965.105.30
平安 竹 134.17±0.93116.82±8.2217.3512.93
花叶 唐 竹 126.61±1.96117.99±2.338.626.81
花叶 赤 竹 132.17±1.58115.14±3.5217.0312.88
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85129.62±3.4711.678.26
美丽 箬竹 133.08±1.14116.67±6.8516.4112.33
柳叶 细竹 66.39±0.8363.30±0.962.954.45
红 秆 寒竹 132.82±0.97123.87±3.588.956.74

Cuadro 4. Cambio de intensidad de fluorescencia de 12 bambúes

另外 , 不同 竹 种 甚至 同一 竹 种 不同 组织 部位 对 染色 时间 反应 也不 完全相同。 以 叶片 材料 为例 , 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 美丽 箬竹 、 花叶 赤 竹 红 秆寒竹 染色 1 min 即 达到 最大 荧光 强度 , 染色 时间 延长 到 3 min 时 , 荧光 强度 略有 衰减 , 但 减少 不明显 (表 3) ; 孝顺 竹 和 黄皮 绿 筋 竹 最大 荧光 强度 出现 在 3 min , 但与 1、5 min 对应 的 荧光 强度 相差 不明显 (表 3) ; 茶 竿 竹 和 柳叶 细竹 最大 荧光 强度 出现 在 5 min , 其中 茶 竿 竹 最大 荧光 强度 与其 3 min 时 的 荧光 强度 最接近 而 柳叶 细竹 最大 荧光 强度 与其 7 min 时 的 荧光 强度 最接近 , 只有 黄皮 刚 竹 最大 荧光 强度 出现 在 7 min , 但 与 5、9 min 对应 的 峰值 十分 接近 (表 3)。 以 笋 为 材料 时, 荧光 强度 随 染色体 时间 变化 情况 与 叶片 相似 , 其中 孝顺 竹 的 笋 最大 荧光 强度 出现 在 1 min , 唐 竹 和 黄皮 刚 竹 2 个 竹 种 笋 的 最大 荧光 强度 出现 在 3 min , 茶 竿 竹 荧光 ,出现 在 5 min (表 3)。 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 和 黄皮 刚 竹 4 个 竹 种 同时 以 叶片 和 笋 为 材料 , 但是 叶片 和 笋 对应 的 荧光 曲线 图 也不 完全相同 , 例如 黄皮刚 竹笋 的 最大 荧光 强度 出现 在 3 min , 叶片 最大 荧光 强度 却 出现 在 7 min (表 3)。 综上所述 , 无论 是 叶片 还是 竹笋 , 当 染色 时间 延长 到 3 min 时 , 75% 的 竹 种已 达到 最大 荧光 强度 值 , 延长 到 5 min 时 , 已有 91.67% 的 竹 种 达到 最大 荧光 强度 值。 因此 , 为 确保 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 准确性 , 竹类 植物 染色 时间 最好 控制 在7 min 以内 , 以 3

2.3. 12 个 不同 属 种 竹 种 的 基因 组 大小 分析

表 5 表明 : 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (2.64 ± 0.54) 和 (2.69 ± 1.01) pg , 明显 小于 其他 10 个 竹 种 ; 其次 为 刚 竹 属Phyllostachys的 黄皮 刚 竹 和 黄皮 绿 筋 竹 , 对应 的 2C值 分别 为 (3.76 ± 1.51) 和 (3.91 ± 0.95) pg , 明显 小于 其他 一些 属 的 竹 种 ; 再次 为 唐 竹 属Sinobambusa的 唐 竹 和 花叶 唐 竹 , 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,03 ± 2,33) 和 (5,13 ± 1,96) pg。 赤 竹 属Sasaella的 花叶 赤 竹 、 箬竹 属Indocalamus的 美丽 箬竹 及 寒竹 属Chimonobambusa的 红 秆 寒竹 3 个 竹 种 基因 组 大小 比较 相近 , 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,36 ± 1,58) 、 (5,39 ± 1,14) 和 (5,38 ± 0,97) pg。 茶 竿 竹 、 平安 竹 和 曙 筋 矢 在 分类上 虽然 为 同一 属 , 但 彼此 间 差异 较大 , 这 3 个 竹 种 的 基因 组 大小 分别 为 (4.82 ± 0.54) 、 (5.44 ± 0.93) 和 (5.73 ± 1.85) pg。

物种2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ± 标准 差 / Mb物种2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ± 标准 差 / Mb
水稻 1.00±0.00860.00±0.00茶 竿 竹 4.82±0.544 145.20±0.54
孝顺 竹 2.64±0.542 270.40±0.54平安 竹 5.44±0.934 678.40±0.93
柳叶 细竹 2.69±1.012 313.40±1.01曙 筋 矢 竹5.73±1.854 927.80±1.85
黄皮 刚 竹 3.76±1.513 233.60±1.51花叶 赤 竹5.36±1.584 609.60±1.58
黄皮 绿 筋 竹3.91±0.953 362.60±0.95美丽 箬竹5.39±1.144 635.40±1.14
唐 竹 5.03±2.334 325.80±2.33红 秆 寒竹5.38±0.974 626.80±0.97
花叶 唐 竹 5.13±1.964 411.80±1.96
说明 : 以 12 个 竹 种 叶片 对应 的 最大 荧光 强度 值为 依据 , 对其 基因 组 大小 进行 了 计算

Cuadro 5. Tamaño del genoma de 12 especies de bambú diferentes

KUMAR 等 [18] 研究 表明 : 分布 在 新加坡 的 孝顺 竹 基因 组 大小 为 (3,11 ± 0,02) pg , 而 ZHOU 等 [19] 研究 表明 : 分布 在 中国 的 孝顺 竹 基因 组 大小 为 (2,78 ± 0,02) pg。 本研究 中 孝顺 竹叶 片 和 笋 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (2.64 ± 0.54) 和 (2.72 ± 0.59) pg , 与 ZHOU 等 [19] 研究 结果 较为 接近 , 与 KUMAR 等 [18] 研究 结果 存在 一定 差异。 流式 细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中 , 细胞核 提取 液 种类 、 染色液 、 染色液 类型 及 染色 时间 等均 会对 基因 大小 测定 结果 结果 产生 一定 影响 [21 - 23] 。KUMAR 等 [18] 以 烟草Nicotiana tabacum为 对照 , 采用 碘化 丙 啶 (PI) 荧光 染料 对 细胞核 进行 染色 , 为了 去除 烟草 等 植物 细胞 中 一些 特殊 的 内含 物 , 细胞核 提取 液 中 加入 了 一定 量 的 聚乙烯 吡咯烷酮 (PVP)。 如果 PVP浓度 过 大 , 在 一定 程度 上 会 影响 细胞核 与 荧光 染料 的 结合 , 进而 影响 细胞核 染色 效果 [24]。 本 研究 ZHOU 等 [19] 的 实验 方法 相似 , 均以 水稻 为 对照 , DAPI 对 进行染色 , 这 可能 是 本 研究 结果 与 ZHOU 等 [19] 较为 接近 而 与 KUMAR 等 [18] 有 差异 的 主要原因。 另外 , 本 研究 中 红 秆 寒竹 和 茶 竿 竹 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,38 ± 0,97 ) 和 (4.82 ± 0.54) pg , 比 ZHOU 等 [19] 研究 的 2 个 竹 种 的 基因 组 略大。 这种 差异 可能 是 由于 染色 时间 不同 而 造成 的。 本 研究 表明 : 染色 时间 对 竹类 植物 基因 组大小 测定 结果 存在 一定 影响 , 且 不同 竹 种 对 染色 时间 要求 并不 完全相同 , 大部分 竹 的 的 细胞核 可以 被 快速 染色 , 如 红 秆 寒竹 、 美丽 箬竹 及 曙 筋 矢 竹 等 1 min 即可 达到最大 荧光 值 ; 还有 少量 竹 种 染色 较慢 , 如 茶 竿 竹 和 黄皮 刚 竹 等 需 5

7 min 才可 达到 最大 荧光 值 。ZHOU 等 [19] 对 竹类 植物 基因 组 大小 进行 分析 过程 中 , 所有 竹 种 均 采用 相同 的 染色 时间 , 这 可能 是 造成 这种 差异 的 主要原因。

利用 流式细胞 仪 分析 植物 基因 组 大小 过程 时 , 一般 需要 选择 基因 组 大小 已知 的 物种 做 对照 , 然后 根据 流式细胞 仪 测量 结果 对待 测 物种 基因 组 大小 进行 估算 [24 - 25]。 对照 物种 选择 一般 需遵循 以下 几个 原则 : ① 对照 物种 已 测序 , 且 基因 组 大小 与 待测 物种 基因 组 大小 间 存在 显 著 差异 , 以便 区分 对照 峰 和 样品 峰 ; ② 对照 样品 与 待测 样 具有 一定 的 生物学 性 ; ;对照 材料 方便 采集 且 易 大量 获取。 目前 , 虽然 、 、 莪 莉 竹 、 芸香 竹 及 瓜 多 竹 等 已 完成 测序 [10, 14 - 15] , 但 其中 大部分 竹 种 主要 分布 在 南方 热带 地区 , 这些竹 种 在 经过 长时间 、 长距离 运输 后 , 部分 材料 萎蔫 或者 细胞核 结构 改变 已达 不到 实验 要求。 为了 检测 不同 对照 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 是否 存在 影响 , 本 研究 尝试 同时 利用 水稻 毛竹 毛竹为 参照 , 对 孝顺 竹 、 柳叶 竹 、 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 唐 竹 及 曙 筋 矢 竹 等 种 种 基因 组 大小 进行 比较 分析 , 表明 2 种 参照 所获 基因 组 大小 十分 , , ,毛竹基 因 组 大小 与 待测 竹 种 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 茶 竿 竹 及 唐 竹 等 竹 的 的 基因 组 相差 较小 , 因此 测量 过程 中 对照 毛竹 的 峰 和 待测 竹 种 较 的 的 的大 区域 的 重叠 和 干扰。 水稻 与 竹类 植物 同属 禾本科 Poaceae , 其 种子 通过 催芽 2

竹类 植物 主要 分为 草本 竹 种 和 木本 竹 种 2 个 基本 类型。 根据 分布 区域 , 木本 竹 种 又 分为 温带 木本 竹 种 和 热带 木本 竹 种 2 个 类型 [11 , 26]。温带 木本 竹 种 染色体 数目 比较 稳定 , 基本上 为 2norte=48(2norte代表 体 细胞 染色体 数 , 即 是 单倍体 的 2 倍) , 热带 木本 竹 种 染色体 数目 表现 比较 复杂 , 主要 有 2norte=64,2norte=70±2,2norte=96,2norte= 104 等 多种 类型 [19, 27 - 29]。 本 研究所 分析 的 12 个 木本 竹 种 中 , 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 为 热带 木本 竹 种 , 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋竹 、 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 花叶 赤 竹 、 美丽 箬竹 及 红 秆 寒竹 均为 温带 木本 种。 本 研究 表明 : 12 个 木本 竹 种 基因 组 组染色体 数目 并不 呈 正 相关 , 虽然 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 2 个 竹 种 染色体 数目 另外 另外 10 个 温带 木本 竹 种 , 但 基因 组 大小 却 明显 小于 温带 木本 竹 种 , 这 与 一些 温带 竹 种和 热带 竹 种 研究 的 情况 类似 [16, 18 - 19, 25]。 部分 竹 种 测序 结果 表明 : 竹类 植物 是 异 源 多倍体 植物 , 基因 组 主要 分为 A 、 B 、 C 和 D 等 4 个不同 的 亚基 因 组 , 长期 进化 过程 中 C 基因 组 竹 种 分别 与 B 和 D 基因 组 竹 种 杂交 形成 染色体 组 类型 分别 为 BBCC 和 CCDD 的 异 源 四倍体 竹 种 (2norte= 48) , 之后 A 基因 组 竹 种 又 与 基因 组 类型 为 BBCC 的 异 源 四倍体 竹 种 杂交 形成 染色体 组 类型 为 AABBCC 的 异 源 六倍 体 竹 种 (2norte= 72) [14]。 本 研究 中 : 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 花叶 赤 竹 、 美丽 箬竹 及 红 秆 寒竹 等温带 竹 种 虽然 染色体 数目 相同 , 但 基因 组 大小 却 存在 较大 差异 , 2C值为 3,76

5.73 pág.属 中 的 一些 竹 种。 另外 , 唐 竹 属 、 矢 竹 属 、 赤 竹 属 、 箬竹 属 及 寒竹 属 的 一些 竹 种 在 基因 组 大小 上 差异 不大 , 特别 是 花叶 刺 竹 、 箬竹 及红 秆 寒竹 3 个 竹 种 基因 组 大小 十分 接近。 因此 , 根据 12 个 不同 竹 种 的 基因 组 大小 测定 结果 推测 , 赤 竹 属 、 箬竹 属 及 寒竹 属 等 属 竹 种 在 染色体 组 组成 类型 可能 可能相近 , 与 刚 竹 属 竹 种 在 染色体 组 类型 上 存在 较大 差异。

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Discusión

Nuestro análisis revela que FCM proporciona datos precisos sobre la composición de la base, que se correlacionan con los resultados de métodos bioquímicos independientes. Aunque no pudimos determinar si las diferencias observadas entre las estimaciones de FCM y TMA fueron causadas por un sesgo metodológico de FCM o TMA, la diferencia observada de C. El 2% del contenido de GC estimado proporciona una estimación práctica de los límites de resolución de los datos de FCM obtenidos a partir de mediciones de especies filogenéticamente distantes con una estructura genómica previamente desconocida. En particular, esta predicción se basó en los resultados de un experimento cuidadosamente diseñado en el que se utilizó un estándar individual para todas las mediciones, y las mediciones se realizaron con los mismos instrumentos y en unos pocos días consecutivos. Con modificaciones de este diseño y la introducción de otras fuentes de posible sesgo, la desviación puede aumentar ocasionalmente. Nuestra experiencia actual con mediciones de contenido de GC en numerosos taxones, incluidas diversas accesiones de diferentes Oryza especie (Šmarda et al., 2008 P. Šmarda et al., inédito), indica que este sesgo sería en gran medida de origen metodológico, mientras que los factores biológicos, como la posible presencia de variación intraespecífica, tendrían solo un efecto muy pequeño en la precisión y repetibilidad de las estimaciones del contenido de GC de las especies.

Nuestros experimentos revelaron que la longitud de unión de DAPI más apropiada para las mediciones de FCM del contenido de GC es ligeramente inferior a 4, que se encuentra dentro de los límites de las longitudes de unión de DAPI (entre 3 y 4) generalmente predichas en estudios experimentales de oligonucleótidos (ver la Introducción). A pesar de la incertidumbre general con respecto al valor exacto de la longitud de unión del DAPI específico de AT utilizado, el cambio de este parámetro tuvo un efecto limitado en los rangos de contenido de GC de la planta estudiados y en la correspondencia general entre las estimaciones obtenidas utilizando FCM y otros métodos alternativos. Por lo tanto, la longitud de unión de DAPI de 4 recomendada por Barow y Meister (2002) aún podría usarse como una aproximación universal y suficientemente robusta, lo que permite un análisis FCM confiable del contenido de GC en una variedad de especies de plantas. Sin embargo, aún se debe tener cierto cuidado al comparar taxones relacionados lejanamente con composiciones genómicas y contenidos de GC extremadamente diferentes, para lo cual la importancia de usar la longitud de unión correcta puede ser sustancial. Tales diferencias podrían esperarse, por ejemplo, al comparar genomas de plantas con genomas estructurados con isocoros de vertebrados de sangre caliente (por ejemplo, humanos, ratones y pollos Eyre-Walker & Hurst, 2001 Constantini et al., 2009), que por lo tanto no pueden recomendarse actualmente como estándares de referencia seguros para calcular el contenido de GC de la planta con FCM. Este es un punto crítico, porque los estándares que se utilizan actualmente en FCM para el cálculo de la composición base se basan en la comparación con la secuencia de humanos o pollos (Doležel et al., 1992 Marie & Brown, 1993 Barow & Meister, 2002 Doležel & Greilhuber, 2010), y se desconoce el efecto de los diferentes patrones de base en las estimaciones de contenido de GC resultantes para los estándares de referencia de plantas. Como el efecto del contenido de GC del estándar parece ser más importante que el conocimiento de la longitud de unión para la estimación correcta del contenido de GC en las plantas, preferimos que los cálculos del contenido de GC de la planta con FCM se basen en O. sativa"Nipponbare" (GC = 43,6%) como patrón de referencia principal. Cuatro grupos diferentes (Vij et al., 2006) han secuenciado de forma independiente O. sativa"Nipponbare" y C. Se conoce el 95% de su secuencia genómica, incluido el número de regiones centroméricas altamente repetitivas (International Rice Genome Sequencing Project, 2005), que con frecuencia está ausente en proyectos genómicos "completos" llevados a cabo en otras plantas (por ejemplo, en Arabidopsis Bennett et al., 2003 Meister, 2005).

En contraste con la gran variación en las mediciones de FCM obtenidas al comparar especies filogenéticamente distantes con organizaciones genómicas contrastantes, el experimento con Oryza y algunos de nuestros análisis anteriores con especies de gramíneas relacionadas (Šmarda et al., 2008) demostraron claramente que FCM es un método sensible que permite la detección de pequeñas diferencias en el contenido de GC entre taxones estrechamente relacionados con estructuras genómicas similares y patrones de base probablemente similares. En comparaciones entre especies estrechamente relacionadas, con el uso constante de un solo estándar, la resolución de FCM podría ser del orden de décimas de GC%. Los experimentos en los que se comparan una serie de muestras con un solo estándar no requieren ningún conocimiento del contenido de GC del estándar, y las estimaciones pueden calcularse simplemente usando solo el factor colorante, lo que permite el uso de cualquier especie como estándar (Barow & Meister, 2002 Meister y Barow, 2007). Por lo tanto, el cálculo del valor absoluto de GC parece ser un problema técnico que no debería impedir que un investigador saque conclusiones sobre el significado de la variación observada de la composición de la base, incluso si el contenido exacto de GC del estándar sigue siendo desconocido.

La investigación sobre la composición de la base tiene una larga tradición en la investigación microbiológica, en la que la composición de la base representa un criterio de clasificación significativo (Stackebrandt & Liesack, 1993 Stackebrandt et al., 2002) y, similar al tamaño del genoma, es un predictor importante de la ecología de las especies (Rocha & Danchin, 2002 Musto et al., 2006 Mann y Phoebe-Chen, 2010). Una investigación similar sobre la magnitud y la dinámica de la evolución del genoma con respecto a la composición de la base (calidad del ADN) y su importancia para la ecología y la distribución de especies es muy escasa en las plantas debido a la ausencia de suficientes datos de composición de la base del ADN. Por lo tanto, FCM proporciona una herramienta útil para completar en el futuro los datos de composición base en plantas y elucidar la dinámica evolutiva de la composición base y su relevancia biológica.

Nuestros datos de FCM actuales sobre el contenido de GC representan los contenidos de GC más bajos y más altos observados en plantas vasculares (Tabla 1) e indican que el rango de contenido de GC en monocotiledóneas es de al menos el 14%. Este amplio rango es el resultado en parte del contenido extremadamente alto de GC encontrado para las gramíneas, consistente con todos los estudios de FCM previos (Barow & Meister, 2002 Meister & Barow, 2007) y datos de secuencia (cf. Šmarda & Bureš, 2012). El contenido extremadamente alto de GC de Poaceae es consistente con el patrón inusual de composición de GC de genes de gramíneas (Kuhl et al., 2004 Guo et al., 2007), y la elucidación de las fuerzas de selección que median la función de estos genes podría ayudar a mejorar significativamente nuestro conocimiento de la función del contenido de GC (Šmarda & Bureš, 2012). Evidencia reciente indica que estos aumentos globales del contenido de GC podrían coincidir con la divergencia intragenómica en la regulación génica y en la mejora general de la respuesta al estrés (Tatarinova et al., 2010), que podría ser en parte responsable del gran éxito evolutivo de las gramíneas en los tiempos geológicos modernos (Šmarda & Bureš, 2012). Los estudios en genomas de bacterias y vertebrados han sugerido varias hipótesis sobre las fuerzas impulsoras de la composición de la base del ADN y el efecto que puede tener el cambio del contenido de GC en la ecología de las especies (revisado en Šmarda & Bureš, 2012). Una de las hipótesis más discutidas es la hipótesis de la termoestabilidad, que sugiere una mayor tolerancia de los organismos ricos en GC a temperaturas más altas debido a la mayor estabilidad térmica del ADN rico en GC frente a AT (Galtier et al., 1999 Vinogradov, 2003 Musto et al., 2006 Bernardi, 2007 Bucciarelli et al., 2009). Basado en el hecho de que la síntesis de pares de bases GC es más exigente energéticamente (Rocha & Danchin, 2002), los organismos de crecimiento rápido, por ejemplo, pueden estar compuestos preferentemente de nucleótidos AT, que tienen un costo menor y son fáciles de sintetizar, y podría esperarse una disminución en el contenido de GC genómico (en comparación con parientes cercanos) en especies parasitarias y de rápido crecimiento, especies con genomas extremadamente grandes o especies que viven en entornos con recursos limitados (por ejemplo, limitados en términos de nutrientes, luz o competidores Šmarda Y Bureš, 2012). Sería útil probar estas hipótesis en plantas en un futuro próximo.

La medición del contenido de GC es fácilmente accesible para los laboratorios que realizan mediciones de FCM del contenido de ADN y que poseen al menos dos fuentes independientes de luz de excitación (incluidas dentro del mismo o situadas en diferentes citómetros de flujo). La medición de FCM del contenido de GC requiere solo modificaciones menores a los procedimientos estándar para las mediciones de contenido de ADN y tiene los mismos requisitos para la calidad y cantidad de tejido (cf. Doležel et al., 2007 Greilhuber et al., 2007). Las únicas diferencias están en el uso de otro tinte específico de base (Barow & Meister, 2002) y la medición de la muestra en un citómetro de flujo separado en paralelo al procedimiento estándar de medición del contenido de ADN. Nuestra modificación de este procedimiento para los propósitos de las mediciones de contenido de GC consiste solo en cortar la muestra y el estándar para ambos colorantes juntos en una sola placa de Petri y cálculos por pares de los resultados correspondientes (en lugar de comparar los promedios de las mediciones de DAPI y PI sobre varios días), lo que ayuda a limitar los posibles efectos de los metabolitos secundarios y la variación diaria de los instrumentos / operadores. Dada la sencillez de las modificaciones empleadas, y las reducciones conseguidas en el tiempo necesario para realizar las mediciones y en sus costes asociados, esperamos que la medición del contenido de GC en plantas por FCM encuentre una aplicación más amplia en un futuro próximo. .


Análisis de los tamaños del genoma de las plantas mediante citometría de flujo: un estudio de caso que demuestra el rango dinámico y la linealidad de la medición

Los citómetros de flujo se diseñaron originalmente para operar con suspensiones de células, prototípicamente de células sanguíneas, y la mayoría de las aplicaciones todavía involucran muestras de este tipo. A pesar de que las células vegetales y sus protoplastos son generalmente más grandes que las células sanguíneas de los mamíferos, estas células aún pueden analizarse mediante citometría de flujo. En la mayoría de las etapas de crecimiento, las plantas superiores se componen de tejidos y órganos, conjuntos tridimensionales complejos de células unidas por paredes celulares. En consecuencia, antes del análisis, las plantas deben procesarse primero para producir suspensiones celulares que sean compatibles con la citometría de flujo. Un enfoque consiste en disolver las paredes celulares, utilizando enzimas que hidrolizan sus componentes de carbohidratos, para liberar protoplastos, que luego pueden analizarse fácilmente en el citómetro.

El segundo enfoque, que se detalla aquí con CytoFLEX, implica el análisis no de protoplastos, sino de suspensiones de núcleos liberados de tejidos y órganos vegetales mediante un sencillo procedimiento de picado (2). El procedimiento implica abrir las células dentro de los tejidos usando una hoja de afeitar estándar de doble filo. El homogeneizado se clarifica utilizando un filtro de malla de nailon a través del cual pasan los núcleos liberados. Luego, los núcleos se tiñen con fluorocromos específicos de ADN, lo que permite la determinación por citometría de flujo del contenido de ADN de los núcleos individuales. El interés en la medición de los tamaños del genoma de las plantas se deriva de la observación de que las plantas superiores, cuando se analizan entre especies, muestran una gama extraordinariamente grande de tamaños de genomas: un límite inferior actual de alrededor de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae hasta un límite superior de 304,40 pg. para Paris japonica (3). El último genoma es aproximadamente 50 veces más grande que el genoma humano, y el ADN de una sola célula de Paris japonica, cuando se estira, se extenderá aproximadamente 91 metros.

La citometría de flujo junto con el procedimiento de corte proporciona un medio simple para determinar el tamaño del genoma que es generalmente aplicable a todas las especies y la metodología se ha adoptado ampliamente en todo el mundo para abordar numerosos problemas en biología básica y aplicada, ecología y agricultura. Esto incluye aplicaciones en biotecnología, como monitorear la estabilidad genética después de la transformación y cultivo de tejidos, priorizar especies para la secuenciación del genoma completo, validar la integridad de conjuntos de genoma completo y proporcionar una planificación adecuada para procedimientos de ingeniería genética como la producción de bibliotecas de ADN. Las aplicaciones en agricultura que se benefician de la citometría de flujo incluyen la producción de líneas haploides y dihaploides usando cultivo de anteras / ovarios, seguido de la duplicación de colchicina, producción de líneas triploides estériles en semillas, producción de plantas que tienen niveles tetraploides y ploidía más altos, asociados con rasgos deseados tales como tamaño del fruto, control de calidad del estado de euploidía para lotes de semillas comerciales, identificación de individuos que tienen niveles novedosos de ploidía y que muestran modos de reproducción novedosos (incluida la apomixis), caracterización de la hibridación interespecífica basada en contenidos intermedios de ADN nuclear, clasificación de distribuciones de ploidía dentro de colecciones de germoplasma, determinación del sexo en plantas dioicas e identificación de híbridos formados entre especies silvestres y entre especies silvestres y cultivadas.

Las aplicaciones en anatomía vegetal, biología celular, fisiología y desarrollo que se benefician de la citometría de flujo incluyen el estudio de la regulación del ciclo de división celular y de la endorreduplicación en el desarrollo de las plantas, y los efectos del estrés abiótico y biótico en estos procesos. La citometría de flujo también ha llevado a investigaciones generalizadas sobre el concepto de nucleotipo, es decir, el efecto fenotípico de la cantidad de ADN nuclear, independientemente de su contenido informativo codificado, sobre el volumen nuclear, las proporciones del núcleo ocupado por cromosomas, las duraciones de mitosis y meiosis, tamaño de semilla y tiempo mínimo de generación. La citometría de flujo también es útil para la detección de mixoploidía y quimerismo. El análisis de la expresión génica en función del tipo de célula, utilizando núcleos clasificados por flujo, se reconoce cada vez más como un campo importante de investigación. En taxonomía y sistemática, la citometría de flujo es invaluable en el cribado de modos de reproducción, identificación de especiación y aislamiento reproductivo, descripción de la dinámica poblacional en zonas híbridas, descubrimiento de nuevos citotipos y de la estructura del citotipo en poblaciones a gran escala, detección y delimitación de plantas. especies para la biodiversidad y la conservación, estudios de los mecanismos de evolución del genoma de las plantas centrados en las causas y consecuencias de la variación del contenido del ADN nuclear, e información sobre la evolución procedente del estudio del contenido del ADN nuclear entre filogenias. Los análisis comparativos a gran escala del tamaño del genoma también se pueden utilizar para estudiar las correlaciones entre el tamaño del genoma y los factores ambientales, entre el tamaño del genoma y la masa de semillas, entre el tamaño del genoma y la riqueza de especies en diferentes grupos de plantas, con la sugerencia de que las especies que tienen genomas grandes pueden ser más susceptibles a la extinción, entre el tamaño del genoma y el potencial invasor, y entre el nicho ecológico y el tamaño mínimo del genoma (en particular las plantas carnívoras).

Como consecuencia del creciente nivel de interés en los análisis de citometría de flujo de este tipo, y el número cada vez mayor de especies para las que se publican datos, los repositorios de búsqueda han surgido como un recurso valioso para la asignación de contenido de ADN a los tamaños del genoma, a través de proporcionando relaciones de calibración, con el consenso que se aborda de una manera de fuentes múltiples. Uno de los más importantes de estos recursos es la base de datos de valor C de Kew, que está curada por expertos y proporciona valores de contenido de ADN nuclear en función del género y la especie, en forma de búsqueda a través de Internet (3). Los curadores también definen valores de contenido de ADN nuclear & ldquoGold-standard & rdquo, que se cree que son más precisos y reproducibles (3). En general, las estimaciones de citometría de flujo del contenido de ADN nuclear son comparables a los tamaños de los ensamblajes de la secuenciación del genoma completo, aunque la presencia de ADN cromosómico altamente repetitivo generalmente conduce a estimaciones de tamaño del genoma más bajas obtenidas de enfoques basados ​​en secuencias. Se han identificado y pueden evitarse varios factores que tienen el potencial de confundir la calibración citométrica de flujo. Por ejemplo, la unión y la fluorescencia resultante de algunos fluorocromos específicos de ADN es específica de pares de bases y, por lo tanto, no es una medida verdadera de la cantidad de ADN entre especies que tienen genomas nucleares con diferentes proporciones AT: GC.

En este protocolo, empleamos yoduro de propidio (PI) como el fluorocromo de ADN. En presencia de ribonucleasa para eliminar las contribuciones a la fluorescencia del ARN bicatenario, el PI intercala la doble hélice del ADN, produciendo una fluorescencia intensa con un máximo de excitación alrededor de 535 nm y un máximo de emisión a 617 nm. El perfil de emisión es relativamente amplio y tiene un ancho espectral máximo del 50% que abarca aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

Se utilizó PI para evaluar el contenido de ADN de cuatro especies: Arabidopsis thaliana (thale berro) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (maíz) y Capsicum annuum (pimiento). Los órganos utilizados para preparar las muestras de Arabidopsis y Capsicum ilustran el interesante fenómeno de endorreduplicación, en el que las células somáticas entran en sucesivas rondas de replicación del genoma (fase S) sin una mitosis intermedia (4). Este proceso endocíclico da como resultado poliploidía, que es común en las plantas (7).

Figura. La citometría de flujo mide eficazmente la endoreplicación en células vegetales. La imagen de la derecha muestra varios tipos de replicación de genes mitóticos durante el ciclo celular. Estos eventos dan como resultado tejidos poliploides. A la izquierda se muestra el flujo de trabajo para preparar tejidos vegetales mediante citometría de flujo, incluidos los datos que indican los resultados del endociclado mitótico.


Ver el vídeo: . Citometría de flujo (Julio 2022).


Comentarios:

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  2. Stephon

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  3. Jorgen

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  4. Stuart

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  6. Muzilkree

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