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¿Se unirá un anticuerpo policlonal a proteínas de diferentes kDA?

¿Se unirá un anticuerpo policlonal a proteínas de diferentes kDA?


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Si tengo un anticuerpo policlonal GST 26kDa, ¿se unirá también a la proteína GST 28kDa?


Si la secuencia de la forma de 26 kDa se incluye dentro de la secuencia de la forma de 28 kDa, entonces la respuesta es "probablemente sí".

Sin embargo, si el extremo N o C de la forma corta es un epítopo importante / dominante y está enmascarado en la forma larga (extendiéndose), entonces la actividad del suero contra la forma larga podría reducirse significativamente.


Como dijo Alan, depende, pero supongo que sí, probablemente lo haga.

Dado que está utilizando anticuerpos policlonales contra una extensión no tan dramática, diría que es aún más probable que vea la señal. Los diversos anticuerpos dentro de la mezcla policlonal se unirán a diferentes partes de la proteína más pequeña, por lo que, a menos que el segmento adicional provoque un cambio drástico en la forma o de alguna manera bloquee la mayoría de los sitios de unión, debería ver la unión.

No creo que pueda comparar directamente las señales de unión entre las diferentes formas de proteínas, pero debería funcionar para una simple detección o purificación.


Caracterización de anticuerpos policlonales contra las proteínas de la cápside del virus de Ljungan

El virus de Ljungan (LV) es un posible patógeno humano aislado de ratones de campo en Suecia y América del Norte. Para permitir la detección de virus y los estudios de localización y actividad de las proteínas del virión, se produjeron anticuerpos policlonales contra las proteínas de la cápside expresadas en bacterias de la cepa LV, 87-012G. La detección específica de proteínas correspondientes a antígenos virales en lisados ​​de células infectadas con LV se demostró mediante inmunotransferencia utilizando cada uno de los anticuerpos policlonales generados. Además, los antígenos virales nativos presentes en cultivos celulares infectados con cepas de LV 87-012G o 145SLG se detectaron en ELISA y por inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos contra las proteínas VP0 y VP1. El anticuerpo anti-VP3 no reaccionó con las proteínas nativas del virión LV, lo que sugiere que VP3 es menos potente para provocar una respuesta humoral y puede tener una orientación menos expuesta en la cápside del virus. No se observó actividad de los anticuerpos contra el parechovirus humano de tipo 1 estrechamente relacionado. El anticuerpo policlonal contra la proteína VP1 se usó adicionalmente para la detección de miocitos infectados por LV en un modelo de ratón de miocarditis inducida por LV. Por tanto, los anticuerpos policlonales contra las proteínas de la cápside viral recombinante permitieron la detección de viriones LV naturales mediante varios métodos inmunológicos diferentes.


Producción de anticuerpos policlonales

Los anticuerpos que se utilizan con fines de investigación y diagnóstico a menudo se obtienen inyectando a un animal de laboratorio, como un conejo o una cabra, una sustancia específica. antígeno. En unas pocas semanas, el sistema inmunológico del animal producirá altos niveles de anticuerpos específicos para el antígeno. Estos anticuerpos se pueden recolectar en un antisuero, que es suero completo extraído de un animal tras la exposición a un antígeno. Debido a que la mayoría de los antígenos son estructuras complejas con múltiples epítopos, dan como resultado la producción de múltiples anticuerpos en el animal de laboratorio. Este llamado anticuerpo policlonal La respuesta también es típica de la respuesta a la infección por parte del sistema inmunológico humano. El antisuero extraído de un animal contendrá anticuerpos de múltiples clones de células B, y cada célula B responderá a un epítopo específico en el antígeno (Figura 2).

Figura 2. Este diagrama ilustra el proceso para recolectar anticuerpos policlonales producidos en respuesta a un antígeno.

Los animales de laboratorio generalmente se inyectan al menos dos veces con antígeno cuando se utilizan para producir antisuero. La segunda inyección activará las celdas de memoria que hacen clase. IgG anticuerpos contra el antígeno. Las células de memoria también se someten maduración de la afinidad, lo que da como resultado un conjunto de anticuerpos con una afinidad media más alta. La maduración por afinidad ocurre debido a mutaciones en las regiones variables del gen de inmunoglobulina, lo que da como resultado células B con sitios de unión al antígeno ligeramente alterados. Al volver a exponerse al antígeno, las células B capaces de producir anticuerpos con sitios de unión al antígeno de mayor afinidad serán estimuladas para que proliferen y produzcan más anticuerpos que sus pares de menor afinidad. Un auxiliar, que es una sustancia química que provoca una activación generalizada del sistema inmunológico que estimula una mayor producción de anticuerpos, a menudo se mezcla con el antígeno antes de la inyección.

El antisuero obtenido de animales no solo contendrá anticuerpos contra el antígeno introducido artificialmente en el laboratorio, sino que también contendrá anticuerpos contra cualquier otro antígeno al que el animal haya estado expuesto durante su vida. Por esta razón, los antisueros primero deben & # 8220purificar & # 8221 para eliminar otros anticuerpos antes de usar los anticuerpos para ensayos de investigación o diagnóstico.


Servicio de producción de anticuerpos fabuloso

Los fragmentos de unión a antígeno (Fab) proceden de la digestión enzimática o química de un anticuerpo de tamaño completo (como una IgG). Estos fragmentos son los dominios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, que contiene una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada 1 (CH1) y una región constante de cadena ligera (CL) [1]. Los fragmentos Fab se pueden obtener de dos formas: mediante síntesis recombinante o escisión enzimática del anticuerpo original [2].

Con años de experiencia en investigación en el campo de la construcción y expresión de anticuerpos recombinantes, Biologics International Corp (BIC) ofrece servicios de producción de fragmentos de anticuerpos, que incluyen Fab, scFab, Fab ’, F (ab’)2, producción de scFv, diabody, triabody, minicuerpo y scFv-Fc. No dude en ponerse en contacto para obtener más información sobre los fragmentos de anticuerpos. Siempre estaremos encantados de ayudarle.

Los fragmentos Fab con un tamaño de alrededor de 50 KDa son los dominios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo, que contienen un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera. Los fragmentos que contienen tioles puente disulfuro se denominan fragmentos Fab ', mientras que los que carecen del grupo funcional tiol se denominan fragmentos Fab [2]. Debido a su pequeño tamaño, Fab / Fab ’puede penetrar los tejidos de manera más eficiente y eliminarse de la sangre más rápidamente. Como no tienen fragmentos Fc, Fab / Fab ’no interferirá con la detección de anticuerpos mediada por anti-Fc.

Construcción de fragmentos fabulosos

Para producir fragmentos Fab, se pueden emplear dos métodos diferentes. El método principal es mediante la escisión enzimática / química del anticuerpo completo, en el que todo el anticuerpo es escindido por una enzima (como papaína, pepsina y ficina) para formar F (ab ’)2 fragmentos, seguido de la reducción de esos fragmentos para producir fragmentos Fab [2]. Un método alternativo es mediante la síntesis recombinante de F (ab ’)2 fragmentos de anticuerpos, seguido de la reducción química de estos fragmentos para producir unidades Fab.

Biblioteca de anticuerpos Fab

Actualmente, la mayoría de los fragmentos de anticuerpos recombinantes se generan mediante bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos [3]. La biblioteca de anticuerpos Fab es ventajosa de varias formas importantes: en primer lugar, en comparación con los anticuerpos monoclonales, cuya producción es muy laboriosa y requiere mucho tiempo, la biblioteca de anticuerpos Fab puede seleccionar de manera rápida y eficiente nuevos anticuerpos que son difíciles de obtener mediante la tecnología de hibridomas. En segundo lugar, al igual que los anticuerpos scFv, podría ser más fácil generar anticuerpos Fab con afinidades más altas. En tercer lugar, las ventajas de los fragmentos Fab son altamente estables en almacenamiento a largo plazo [4] y son compatibles con antisueros de detección comunes sin necesidad de reingeniería. Si necesita un anticuerpo contra algunos antígenos inusuales, póngase en contacto, nuestra biblioteca de anticuerpos con una rica diversidad y gran escala le ayudará a encontrar un anticuerpo ideal.

Más formatos fabulosos

A F (ab ')2 El fragmento, que retiene una pequeña parte de la región de bisagra Fc, tiene dos regiones de unión al antígeno que pueden aumentar la afinidad por el antígeno. Reducción de F (ab ')2 fragmentos produce dos fragmentos Fab 'monovalentes, que tienen un grupo sulfhidrilo libre que es útil para la conjugación con otras moléculas.

Aunque la utilización de métodos de escisión enzimática / química para generar fragmentos Fab es conveniente y eficaz, requiere una gran cantidad de anticuerpo monoclonal como material de partida. Un fragmento Fab monocatenario (scFab) puede conducir a una función y producción mejoradas de fragmentos Fab. Según algunos estudios [3], los fragmentos scFab muestran una capacidad superior de unión al antígeno en comparación con Fab y compensan algunas de las desventajas de la producción de Fab soluble en E. coli.

¿Tiene en mente algunos formatos de anticuerpos? Contáctenos con sus ideas, déjenos ver qué podemos hacer por usted.


3-2. Las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina están compuestas de regiones constantes y variables

Se han determinado las secuencias de aminoácidos de muchas cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas y revelan dos características importantes de las moléculas de anticuerpos. Primero, cada cadena consta de una serie de secuencias similares, aunque no idénticas, cada una de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud. Cada una de estas repeticiones corresponde a una región de estructura de proteína discreta, plegada de forma compacta, conocida como dominio de proteína. La cadena ligera está formada por dos de estos dominios de inmunoglobulina, mientras que la cadena pesada del anticuerpo IgG contiene cuatro (véase la figura 3.1a). Esto sugiere que las cadenas de inmunoglobulinas han evolucionado por duplicación repetida de un gen ancestral correspondiente a un solo dominio.

La segunda característica importante revelada por las comparaciones de secuencias de aminoácidos es que las secuencias amino-terminales de las cadenas pesada y ligera varían mucho entre diferentes anticuerpos. La variabilidad en la secuencia se limita a aproximadamente los primeros 110 aminoácidos, correspondientes al primer dominio, mientras que los dominios restantes son constantes entre las cadenas de inmunoglobulinas del mismo isotipo. La variable amino-terminal o los dominios V de las cadenas pesada y ligera (VH y VL, respectivamente) juntos forman la región V del anticuerpo y le confieren la capacidad de unirse a un antígeno específico, mientras que los dominios constantes (dominios C) de las cadenas pesada y ligera (CH y CL, respectivamente) forman la región C (ver Fig. 3.1b, c). Los múltiples dominios C de cadena pesada están numerados desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi, por ejemplo CH1, CH2 y así sucesivamente.


Anticuerpo policlonal UCP2

Inmunohistoquímica del cáncer de hígado humano incluido en parafina utilizando anticuerpo policlonal UCP2 a una dilución de 1/20.

Análisis de Western Blot de tejido de hígado de ratón utilizando anticuerpo policlonal UCP2 a una dilución de 1/200.

Dilución

WB 1: 200-1000, IHC 1: 10-50, ELISA 1: 1000-2000

Preparación de muestras de proteínas

1.Extracción de proteínas

1)Para muestra de tejido
una. Tome las muestras, lave bien el tejido con PBS preenfriado (0.01 M, pH = 7.4) (Cat # E-BC-R187) para eliminar la sangre de la superficie y los desechos internos.
B. Pese y rompa el tejido, agregue una proporción adecuada de tampón de lisis RIPA (Cat # E-BC-R327) (agregue 10 μL de PMSF y 10 μL de Na3VO4 a cada 1 mL de lisis de RIPA) y lisar el tejido de manera homogeneizada.
Se recomienda homogeneizar según la relación peso del tejido: volumen RIPA = 3:10. Por ejemplo, agregue 1 ml de tampón de lisis RIPA a 0,3 g de muestra de tejido; el volumen específico se puede ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales.
C. Agitar y lisar sobre hielo durante 30 minutos después de la homogeneización. Y luego someter a ultrasonidos la muestra durante 1 minuto (en condiciones de baño de agua helada) con sonicación de 2 s e intervalos de 2 s para hacer que las células se lisen completamente y reducir la viscosidad de la muestra.
D. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ℃.
mi. Tome el sobrenadante y mida la concentración de proteína mencionada en el paso 2.

2)Para muestra de células
una. Recoger las células, lavarlas a fondo con PBS preenfriado (0,01 M, pH = 7,4) para eliminar el medio (generalmente se recomienda lavar 3 veces).
B. Agregue una proporción adecuada de tampón de lisado RIPA (10 μL de PMSF y 10 μL de Na3VO4 en cada 1 mL de lisis de RIPA) y lisar en hielo durante 30 min.
Se recomienda añadir 0,1 ml de tampón de lisis RIPA a cada pocillo de una placa de 6 pocillos (el contenido de proteínas en diferentes células puede variar y el volumen del lisado añadido se puede ajustar adecuadamente).
C. Sonique la muestra durante 1 min (en condiciones de baño de agua helada) con 2 s de sonicación e intervalos de 2 s para que las células se lisen completamente y reduzcan la viscosidad de la muestra.
D. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ℃.
mi. Tome el sobrenadante y mida la concentración de proteína mencionada en el paso 2.

2.Medida de la concentración de proteínas.
Mediante el método BCA (consulte las instrucciones del kit de ensayo colorimétrico de proteínas totales (n.º de cat. E-BC-K318)).

3.Hervir las muestras
Ajuste la concentración de proteína con tampón PBS. Agregue 5 × Tampón de carga SDS (Cat # E-BC-R288) con la proporción de la muestra de proteína: 5 × Tampón de carga SDS = 4: 1 y hierva la mezcla durante 10 min. Centrifugar a 12.000 rpm durante 2 min y recoger el sobrenadante. La proteína desnaturalizada puede emplearse en experimentos de Western Blot o almacenarse a -20 ° C o -80 ° C.

Nota: Se recomienda que la cantidad total de carga de proteína de la muestra de prueba sea de aproximadamente 50 μg en cada pocillo. Intente que el volumen de carga de cada muestra se acerque a los 10 μL.

Electroforesis

1.Según el peso molecular de la proteína diana, prepare 0% gel de separación. Agregue la muestra de prueba a cada pocillo y agregue 5 μL de marcador de proteína preteñido (Cat # E-BC-R273) a un pozo reservado para verificar el peso molecular objetivo y el alcance de la transferencia de membrana. Agregue tampón de electroforesis (Cat # E-BC-R331) y comience la electroforesis.

2.Electroforesis a 80v cuando las muestras están en gel de apilamiento, luego convertir a 120v cuando el azul fluye hacia el gel de separación. El tiempo de electroforesis es de aproximadamente 2-3 horas hasta que el azul de bromofenol llega al fondo del gel.

Membrana de transferencia (transferencia húmeda)

1.Elija la membrana de PVDF (Cat #) con un tamaño de poro de μm según el peso molecular de la proteína diana. Remoje la membrana de PVDF en metanol durante 1 minuto para activarla y luego sumerja la membrana de PVDF en el tampón transmembrana (Cat # E-BC-R333), el papel de filtro y la estera de fibra deben empaparse en el tampón transmembrana para su uso también.

2.Coloque los siguientes materiales en el orden de la placa negra (electrodo negativo) - estera de fibra - papel de filtro - gel - Membrana PVDF - papel de filtro - estera de fibra - placa blanca (electrodo positivo) se colocan en orden, descarga burbujas, pinza y coloque en el tanque de transferencia húmeda. Las condiciones transmembrana recomendadas son. Asegúrese de que el proceso transmembrana se realice a bajas temperaturas.
Nota: Esto es para transferencia húmeda. Si se utilizan otros métodos transmembrana, ajuste de acuerdo con las condiciones específicas.

3.Después de la transmembrana, saque la membrana de PVDF con cuidado y lávela con tampón TBST durante 1 min.

Incubación de anticuerpos

1.Remoje la membrana de PVDF con tampón TBST (Cat # E-BC-R335) que contiene leche desnatada en polvo al 5% como tampón de bloqueo y bloquee la membrana a temperatura ambiente durante.

2.De acuerdo con la proporción de dilución de anticuerpo primario recomendada, utilice el tampón TBST que contiene leche desnatada en polvo al 5% para diluir el Anticuerpo UCP2 A continuación, sumerja la membrana de PVDF en la solución de trabajo del anticuerpo primario, incube durante la noche a 4 ℃ y agite suavemente.

3.Lave la membrana de PVDF con tampón TBST durante.

4.De acuerdo con la proporción de dilución de anticuerpos secundarios recomendada, utilice una solución tampón TBST que contenga leche desnatada en polvo al 2% para diluir IgG anti-conejo de cabra (H + L) (conjugado con peroxidasa / HRP) (Cat # E-AB-1003) en. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador.

5.Lave la membrana de PVDF con tampón TBST durante.

Detección

1.Mezcle A y B en el kit de detección de sustrato quimioluminiscente excelente (Cat # E-BC-R347) en una proporción de 1: 1 como solución de trabajo.

2.Saque la membrana de PVDF del tampón TBST y absorba el líquido con el papel de filtro. Pavimente la membrana de PVDF en la máquina de detección, agregue solución de trabajo ECL continuamente en la membrana de PVDF, descargue la burbuja y detecte el resultado.

3.Ajuste el contraste y el tiempo de exposición para obtener la mejor imagen.


Análisis de Western Blot

Si bien los resultados del análisis de Western blot se utilizan comúnmente para detectar la presencia de enfermedades, se aplican otros usos médicos. La investigación farmacéutica analiza cómo las drogas afectan a otros tejidos, por ejemplo. Muchas empresas fabrican anticuerpos específicamente para las pruebas de transferencia Western. Sin embargo, nuestro conocimiento de los anticuerpos específicos es limitado; si estos anticuerpos producidos pueden detectar antígenos menos estudiados es una fuente de debate.

Para producir anticuerpos de Western blot, los animales se modifican genéticamente para que no contengan el gen que produce la proteína que se va a estudiar. Esto significa que, cuando se expone a ella, el sistema inmunológico del animal ve la proteína como un invasor extraño y comienza a producir anticuerpos para destruirla. El animal genéticamente modificado se llama animal knockout. Muchos laboratorios producen sus propios animales knockout en lugar de comprar anticuerpos prefabricados.

Saber leer un Western blot es relativamente sencillo. Las bandas reciben un resultado positivo o negativo. No todos los resultados son claros. Los tamaños de banda están representados por un número precedido por la letra p o seguido de kDa (peso molecular de la proteína en kilodaltons). La p se refiere a una densidad de proteína especificada dentro de la muestra.

Los resultados del Western blot del VIH seleccionan las proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana. Mide cuatro proteínas: glicoproteínas 160 y 120, y antígenos p24 y p31. Los resultados positivos deben mostrar, como mínimo, uno de cada uno de los conjuntos de glicoproteínas y antígenos.

Los resultados de Western blot Lyme para esta enfermedad transmitida por garrapatas tienen una precisión del 97%, pero solo en personas que han desarrollado artritis de Lyme o carditis de Lyme. Las proteínas bacterianas detectadas son de transmisión sanguínea. Borrelia burgdorferi.

La prueba de detección de herpes Western blot de la Universidad de Washington solía ser el estándar de oro en las pruebas, pero desde entonces se ha demostrado que produce resultados falsos positivos demasiado altos. A menudo se requieren pruebas secundarias, lo que hace que este sea un método de detección costoso.


Introducción

Las proteínas de membrana son la interfaz molecular entre el huésped y el patógeno, sin embargo, estas proteínas clave presentan desafíos únicos para la elucidación estructural 1 y para su uso en el desarrollo no solo de terapias 2 sino también de diagnósticos y vacunas. Los anticuerpos monoclonales específicos de la diana han permitido la determinación de nuevas estructuras proteicas de membrana durante la criomicroscopía electrónica al aumentar el tamaño de la diana 3, y durante la cristalografía 4 estabilizando conformaciones proteicas únicas 5,6,7,8, proporcionando contactos de red cristalina 9,10 , 11, y permitiendo la solución de la estructura vía reemplazo molecular 10,11,12. Los anticuerpos monoclonales que reconocen conformaciones específicas de las proteínas de la vía de la señal incrustadas en la membrana permiten el emocionante desarrollo de nuevas terapias 13. Con respecto a la producción de anticuerpos para proteínas de membrana, a menudo existe una limitación en la disponibilidad de antígeno diana altamente purificado o plegado de forma nativa. Por lo tanto, exploramos el enfoque de inmunización genética 14 con el fin de generar anticuerpos que se dirijan a proteínas de membrana.

Sorprendentemente, se desconoce la eficacia de la inmunización genética aplicada a las proteínas de membrana, ya que la aplicación de este método se ha descrito solo o para colecciones de proteínas solubles 15 o para dianas de proteínas de membrana individuales 16,17,18. Para estas proteínas de membrana individuales, las diluciones de suero operativas informadas de ≤1: 200 para los GPCR de tirotropina y neuroquinina-1 humanos 16,17 y para la nefrina 18 humana sugieren margen de mejora. El enfoque biolístico, utilizando solo genes como fuente de antígeno, ha generado anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos nativos de proteínas de membrana 17,18, incluidas modificaciones como la glicosilación 18. Grupos adicionales han utilizado la inmunización genética sola para generar anticuerpos con potencial terapéutico, aunque utilizando métodos patentados 19,20.

Aquí describimos un enfoque eficiente que produjo anticuerpos contra la mayoría de las 17 proteínas de membrana de patógenos de nivel 3 de bioseguridad. El aislado SCHU S4 de Francisella tularensis es una de las bacterias más patógenas conocidas debido a su capacidad de infección fatal a partir de tan solo diez células 21. F. tularensis causa la enfermedad de la tularemia y es un patógeno bacteriano intracelular modelo dada su capacidad para evadir la respuesta inmune e infectar numerosos tipos celulares 22. El virus de la peste porcina africana transmitido por artrópodos (VPPA) causa una enfermedad porcina hemorrágica intratable y altamente letal que constituye una amenaza económica en África y Europa oriental 23. La existencia endémica de ambos patógenos a través de numerosas fuentes ambientales hace que la erradicación sea inverosímil 24,25. Las investigaciones con proteínas endógenas de estos organismos están limitadas por los requisitos de bioseguridad y el estado del agente seleccionado. Para respaldar los estudios de proteínas de membrana que son importantes en la patogénesis, desarrollamos enfoques basados ​​en ADN para generar y caracterizar anticuerpos contra un conjunto de proteínas de membrana (Tabla complementaria 1) que fueron objeto de estudios estructurales como parte de la Proteína de los Institutos Nacionales de la Salud de EE. UU. Iniciativa de Estructura (PSI: Biología). Se espera que muchas de estas dianas proporcionen nuevas estructuras de proteínas de membrana, ya que carecen de homólogos de secuencia obvios fuera de la Francisella género y el Asfarviridae familia de virus.


Anticuerpo policlonal PLGF

Análisis de transferencia de Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Inmunohistoquímica del colon humano embebido en parafina usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 100 (lente de 40x).

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia de Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Análisis de transferencia de Western de extractos de varias líneas celulares usando Anticuerpo Policlonal PLGF a una dilución de 1: 1000.

Dilución

Preparación de muestras de proteínas

1.Extracción de proteínas

1)Para muestra de tejido
una. Tome las muestras, lave bien el tejido con PBS preenfriado (0.01 M, pH = 7.4) (Cat # E-BC-R187) para eliminar la sangre de la superficie y los desechos internos.
B. Pese y rompa el tejido, agregue una proporción adecuada de tampón de lisis RIPA (Cat # E-BC-R327) (agregue 10 μL de PMSF y 10 μL de Na3VO4 a cada 1 mL de lisis de RIPA) y lisar el tejido de manera homogeneizada.
Se recomienda homogeneizar según la relación de peso del tejido: volumen RIPA = 3:10. Por ejemplo, agregue 1 ml de tampón de lisis RIPA a 0,3 g de muestra de tejido; el volumen específico se puede ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales.
C. Agitar y lisar sobre hielo durante 30 minutos después de la homogeneización. Y luego someter a ultrasonidos la muestra durante 1 minuto (en condiciones de baño de agua helada) con 2 s de sonicación e intervalos de 2 s para que las células se lisen por completo y reduzcan la viscosidad de la muestra.
D. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ℃.
mi. Tome el sobrenadante y mida la concentración de proteína mencionada en el paso 2.

2)Para muestra de células
una. Recoger las células, lavarlas a fondo con PBS preenfriado (0,01 M, pH = 7,4) para eliminar el medio (generalmente se recomienda lavar 3 veces).
B. Agregue una proporción adecuada de tampón de lisado RIPA (10 μL de PMSF y 10 μL de Na3VO4 en cada 1 mL de lisis de RIPA) y lisar en hielo durante 30 min.
Se recomienda añadir 0,1 ml de tampón de lisis RIPA a cada pocillo de una placa de 6 pocillos (el contenido de proteínas en diferentes células puede variar y el volumen del lisado añadido se puede ajustar de forma adecuada).
C. Sonique la muestra durante 1 min (en condiciones de baño de agua helada) con 2 s de sonicación e intervalos de 2 s para que las células se lisen completamente y reduzcan la viscosidad de la muestra.
D. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ℃.
mi. Tome el sobrenadante y mida la concentración de proteína mencionada en el paso 2.

2.Medida de la concentración de proteínas.
Mediante el método BCA (consulte las instrucciones del kit de ensayo colorimétrico de proteínas totales (n.º de cat. E-BC-K318)).

3.Hervir las muestras
Ajuste la concentración de proteína con tampón PBS. Agregue 5 × Tampón de carga SDS (Cat # E-BC-R288) con la proporción de la muestra de proteína: 5 × Tampón de carga SDS = 4: 1 y hierva la mezcla durante 10 min. Centrifugar a 12.000 rpm durante 2 min y recoger el sobrenadante. La proteína desnaturalizada puede emplearse en experimentos de Western Blot o almacenarse a -20 ° C o -80 ° C.

Nota: Se recomienda que la cantidad total de carga de proteína de la muestra de prueba sea de aproximadamente 50 μg en cada pocillo. Intente que el volumen de carga de cada muestra se acerque a los 10 μL.

Electroforesis

1.Según el peso molecular de la proteína diana, prepare 0% gel de separación. Agregue la muestra de prueba a cada pocillo y agregue 5 μL de marcador de proteína preteñido (Cat # E-BC-R273) a un pozo reservado para verificar el peso molecular objetivo y la extensión de la transferencia de membrana. Agregue tampón de electroforesis (Cat # E-BC-R331) y comience la electroforesis.

2.Electroforesis a 80v cuando las muestras están en gel de apilamiento, luego convertir a 120v cuando el azul fluye hacia el gel de separación. El tiempo de electroforesis es de aproximadamente 2-3 horas hasta que el azul de bromofenol llega al fondo del gel.

Membrana de transferencia (transferencia húmeda)

1.Elija la Membrana PVDF (Cat #) con un tamaño de poro de μm según el peso molecular de la proteína diana. Remoje la membrana de PVDF en metanol durante 1 minuto para activarla y luego sumerja la membrana de PVDF en el tampón transmembrana (Cat # E-BC-R333), el papel de filtro y la estera de fibra deben empaparse en el tampón transmembrana para su uso también.

2.Coloque los siguientes materiales en el orden de la placa negra (electrodo negativo) - estera de fibra - papel de filtro - gel - Membrana PVDF - papel de filtro - estera de fibra - placa blanca (electrodo positivo) se colocan en orden, descarga burbujas, pinza y coloque en el tanque de transferencia húmeda. Las condiciones transmembrana recomendadas son. Asegúrese de que el proceso transmembrana se realice a bajas temperaturas.
Nota: Esto es para transferencia húmeda. Si se utilizan otros métodos transmembrana, ajuste de acuerdo con las condiciones específicas.

3.Después de la transmembrana, saque la membrana de PVDF con cuidado y lávela con tampón TBST durante 1 min.

Incubación de anticuerpos

1.Remoje la membrana de PVDF con tampón TBST (Cat # E-BC-R335) que contiene leche desnatada en polvo al 5% como tampón de bloqueo y bloquee la membrana a temperatura ambiente durante.

2.De acuerdo con la proporción de dilución de anticuerpo primario recomendada, use el tampón TBST que contiene leche desnatada en polvo al 5% para diluir el Anticuerpo PLGF A continuación, sumerja la membrana de PVDF en la solución de trabajo del anticuerpo primario, incube durante la noche a 4 ℃ y agite suavemente.

3.Lave la membrana de PVDF con tampón TBST durante.

4.De acuerdo con la proporción de dilución de anticuerpos secundarios recomendada, utilice una solución tampón TBST que contenga leche desnatada en polvo al 2% para diluir IgG anti-conejo de cabra (H + L) (conjugado con peroxidasa / HRP) (Cat # E-AB-1003) en. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador.

5.Lave la membrana de PVDF con tampón TBST durante.

Detección

1.Mezcle A y B en el kit de detección de sustrato quimioluminiscente excelente (Cat # E-BC-R347) en una proporción de 1: 1 como solución de trabajo.

2.Saque la membrana de PVDF del tampón TBST y absorba el líquido con el papel de filtro. Pavimente la membrana de PVDF en la máquina de detección, agregue solución de trabajo ECL continuamente en la membrana de PVDF, descargue la burbuja y detecte el resultado.

3.Ajuste el contraste y el tiempo de exposición para obtener la mejor imagen.


Discusión

La liberación de espermatozoides del reservorio oviductal comienza antes de la ovulación [1, 51] sin embargo, se desconoce en gran medida cómo se estimula o regula la liberación de espermatozoides. Se cree que la capacitación de los espermatozoides desempeña un papel crucial en la liberación de espermatozoides, porque la incidencia de unión de esperma de toro capacitado al epitelio oviductal in vitro es significativamente menor que la unión de muestras no capacitadas [16]. Anteriormente, informamos que cada proteína BSP sola (BSP1, BSP3 y BSP5) puede unir los espermatozoides al epitelio oviductal [20]. Sólo BSP1 había sido examinado previamente para determinar los efectos de la capacitación [39], y se suponía que las respuestas a la capacitación de las tres proteínas BSP eran similares. En este estudio, investigamos cómo respondió cada BSP a las condiciones de capacitación para determinar si la pérdida de las tres proteínas BSP podría servir para liberar espermatozoides del reservorio. Ahora hemos demostrado que estas proteínas BSP respondieron de manera diferente a las condiciones de capacitación. Sorprendentemente, las diferencias no implicaron simplemente diferentes tasas de desprendimiento de cada tipo de BSP de la superficie del esperma. Mientras que BSP5 ​​se eliminó rápidamente de los espermatozoides y BSP1 se eliminó lentamente, en todo caso, se encontró que BSP3 se modificó en la superficie del esperma.

El esperma de toro puede capacitarse in vitro. Se informó que la heparina, un glicosaminoglicano, acelera la capacitación de los espermatozoides de toro in vitro [42] y se ha utilizado ampliamente para mejorar la capacitación de los espermatozoides de toro para la FIV [52, 53]. Cuando se combinó con dbcAMP e IBMX para aumentar el cAMP intracelular, se maximizó el aumento de la fosforilación de la proteína tirosina asociada con la capacitación (Fig. 2A). IBMX y dbcAMP no parecieron producir un aumento de la fosforilación de la proteína tirosina (Fig. 6A, carril 4) en comparación con TALP solo (Fig. 6A, carril 2), lo que es consistente con el informe de Pons-Rejrajir et al. [54]. Aunque el grado de fosforilación de la proteína tirosina varió en respuesta a diferentes condiciones de capacitación, las respuestas de BSP1 (Fig. 2B) y BSP5 ​​(Fig. 2D) no difirieron, lo que sugiere que los cambios en BSP1 y BSP5 ​​son independientes del efecto de la heparina. o cAMP. Por el contrario, la heparina redujo la apariencia del producto de escisión de BSP3 (Figuras 2C, 5A y 6B), con o sin la adición de dbcAMP más IBMX al medio. Por lo tanto, es posible que la heparina interfiriera con la escisión de la BSP3 de 15 kDa o eliminara el producto de 13 kDa mediante la interacción con los sitios de unión de la heparina en los dominios de la fibronectina tipo II de la BSP3 [22]. La primera posibilidad es más probable, porque no pudimos detectar BSP3 de 13 kDa en el sobrenadante (datos no mostrados).

Se ha informado que la glucosa retrasa significativamente la capacitación del esperma de toro, posiblemente al inhibir un aumento del pH intracelular [44]. En nuestros experimentos, la incubación con glucosa durante 5 h no afectó la pérdida o modificación de las proteínas BSP a pesar de que inhibió la fosforilación de tirosina (Fig.6), lo que sugiere que los factores que modulan las proteínas BSP en la superficie del esperma operan de forma independiente o aguas arriba de la capacitación. Vías afectadas por la glucosa. De manera similar, la adición de heparina o heparina con dbcAMP más IBMX para mejorar la capacitación no afectó significativamente el comportamiento de BSP5, lo que sugiere que la pérdida de BSP5 ​​de los espermatozoides se produce fuera o aguas arriba de la señalización de heparina y cAMP. La modificación de la membrana plasmática de los espermatozoides, en particular la salida de colesterol, que aumenta el trastorno de lípidos en la membrana, es uno de los primeros eventos de capacitación de los espermatozoides (revisado en [33]), por lo tanto, la alteración asociada a la capacitación en el movimiento de los fosfolípidos en la membrana podría Reducir la afinidad de BSP5 ​​por la superficie del esperma.

The rapid loss of BSP5 signal was examined by two different measuring methods (immunoblotting and immunofluorescence) with two antibodies raised against different regions of BSP5. Even so, we still cannot rule out the possibility that BSP5 remained on sperm membranes but modified in a way that the antibodies no longer recognized the protein. Also, as we mentioned in Resultados, we did not detect BSP5 in the concentrated supernatant. Although it is unclear how the loss (or possibly modification) of BSP5 plays a role in fertilization, it has been reported that the amount of BSP5 in accessory sex gland fluid is inversely correlated with bull fertility [ 55]. It could be that excess amounts of BSP5 on sperm membranes caused sperm to bind longer to epithelium in the reservoir, consequently impairing sperm movement out of the reservoir. We recently discovered that frozen-thawed sperm have much more BSP5 than fresh ejaculated sperm (unpublished data). We are now investigating whether membrane damage during cryopreservation increases BSP5 attachment, which in turn decreases the fertility of frozen/thawed sperm.

In contrast to previous reports [ 16, 39], we did not see a loss of BSP1 after 5 h of incubation under any of the capacitating conditions. The shedding of BSP1 was reported to be associated with cholesterol removal when epididymal sperm were coated with purified BSP1 and then incubated with high-density lipoprotein (HDL) purified from follicular fluid to capacitate them [ 39]. The response of BSP1 could have been different in those experiments, because they were performed with sperm that lacked the other two BSP proteins and because HDL was used to capacitate the sperm. A previous study showed that when fresh bull sperm, which had the physiological coating of all three BSP proteins, were incubated in capacitation medium for up to 24 h, most BSP1 remained on sperm membranes [ 50]. Therefore, we propose that BSP1 is lost slowly, if at all, during the initiation of capacitation in the sperm reservoir.

We were surprised to see the appearance of a lower molecular mass of BSP3 during incubation. By using MS analysis, we confirmed that the lower molecular mass contained BSP3 and that the protein was probably cleaved at its N terminus. We were also surprised to find out that the 15-kDa BSP3 contained two amino acids that had been considered to be part of the signal peptide. The predicted signal peptide is very hydrophobic, making it difficult to be resolved by MS. We attempted to pinpoint the cleavage site by Edman sequencing but failed because Edman sequencing data showed that the N terminus of the 13-kDa BSP3 was heterogeneous, indicating that there might be more than one cleavage site or more than one protease involved in the cleavage. Because the molecular mass of the signal peptide is estimated to be about 2 kDa, it is very possible that the whole length of the putative signal peptide was retained during vesicular secretions and was only proteolytically cleaved by protease(s) later on. We attempted to cleave the signal peptide between asparagine (no. 24) and glycine (no. 25) with hydroxylamine. Unfortunately, nonspecific cleavages by hydroxylamine prevented us from confirming the presence of signal peptide in the 15-kDa BSP3.

Our results suggest that BSP3 is cleaved by protease(s) on sperm membranes during incubation. Various sperm surface proteins with proteolytic property have been identified over the years. For example, each protein in the ADAM family contains a metalloprotease domain and some of them have been reported to play a role in fertilization (reviewed in [ 56]). ADAM3 has been demonstrated to be required for passage of sperm into the oviduct, because sperm from males that are null mutants for ADAM3 are unable to enter the oviduct [ 57]. Other proteins such as PRSS21 (testisin/TESP5) [ 58, 59] and BSp120 [ 60], which are serine proteases found on mouse and bull sperm surfaces, respectively, have been implicated in the fertilization process however, their role in sperm movement in the oviduct has not been investigated. Further study is needed to find out which sperm surface protease is responsible for the cleavage of BSP3. To make sure that the cleavage of BSP3 was not due to release of acrosomal enzymes during the various treatments, we examined the acrosome status of sperm and found that acrosomal loss did not increase during 5 h incubation in any of the treatments ( Fig. 10).

The differing responses of BSP proteins to capacitating conditions indicate that the composition of the BSP coat of sperm changes during capacitation, even under the mildest of capacitating conditions. Because each BSP protein alone can bind epididymal sperm to oviductal epithelium [ 20] and each BSP protein interacts with a different subset of the four ANXA proteins that are putative oviductal receptor [ 29], it would follow that the types of interactions of sperm with oviductal epithelium change as sperm initiate capacitation in the oviduct, especially as they lose BSP5 and as BSP3 is cleaved. Previously, our laboratory reported that when bull sperm were capacitated before addition to oviductal epithelium, the incidence of binding to the epithelium was reduced [ 16]. An example of what could occur during capacitation of sperm in the oviduct is that, first, BSP5 binds to ANXA1, ANXA2, and ANXA4 [ 30]. If a sperm in the lower isthmus loses BSP5 from its surface, the strength of its binding to ANXA1, ANXA2, and ANXA4 would lessen and the sperm might pull itself free of the epithelium. After moving around a bit in the lumen, it might bind again, via BSP1 or BSP3, both of which bind ANXA5. The process of reduction of binding affinity, detachment from the epithelium, and reattachment to the epithelium could repeat several times, as has been reported to occur in the mouse [ 15, 61]. If the ANXA proteins were distributed in a pattern that would increase the likelihood of sperm reattaching further along the oviduct, then this series of events would result in movement of sperm up the oviduct. Verification of this proposed mechanism of sperm movement up the oviduct requires extensive investigation.

It should be noted that attachment of sperm to oviductal epithelium is not confined to the region of the reservoir in the lower oviduct. Recently, we reported observing mouse sperm tightly bound to epithelium in the ampulla of the oviduct shortly before and after ovulation [ 62]. Therefore, sperm can continue to interact with oviductal epithelium after leaving the reservoir. The BSP1 that remains on sperm after capacitation could play a greater role in binding sperm to epithelium in the ampulla of the oviduct than BSP5.

In summary, we demonstrated that BSP proteins, which bind bull sperm to oviductal epithelium, respond differently to capacitating conditions. The different loss or modification of BSP proteins suggests that a mechanism exists to regulate sperm movement along the oviduct. Further study is needed to investigate how the loss/modification of BSP proteins change sperm binding affinity for different ANXA proteins, the putative binding partners of BSP proteins on oviductal epithelium [ 30].


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Comentarios:

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