Información

Solución acuosa al 1% de ácido desoxicólico. ¿Como se prepara?

Solución acuosa al 1% de ácido desoxicólico. ¿Como se prepara?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Según Sigma, la solubilidad del ácido desoxicólico es:

0,24 g / L en agua a 15 ° C

Según la FDA, Kybella (marca comercial) es una solución acuosa al 1% de ácido desoxicólico. ¿Cómo hicieron esto?


De acuerdo con el documento sigma al que hizo referencia (énfasis agregado por mí):

"El ácido libre es soluble a 0,24 g / L en agua a 15ºC, mientras que la sal de sodio es soluble a> 333 g / L en agua a 15ºC. Por lo tanto, El control del pH es muy importante para el uso de este producto. Las soluciones acuosas precipitan cuando el pH se reduce a 5."

Según el documento de la FDA (énfasis agregado por mí):

"Cada vial de 2 ml de KYBELLA® (ácido desoxicólico) inyectable contiene 20 mg de ácido desoxicólico sintético como ingrediente activo y los siguientes ingredientes inactivos: alcohol bencílico (18 mg), fosfato de sodio dibásico (2,84 mg), cloruro de sodio (8,76 mg), hidróxido de sodio (2,86 mg) en agua para inyección, USP. Se añaden ácido clorhídrico e hidróxido de sodio adicional según sea necesario para ajustar la formulación a pH 8,3.."

La solubilidad de 0,24 g / L en agua a 15ºC se determina mediante la disolución del ácido libre en agua pura. A medida que disuelve un ácido en agua pura, el pH bajará progresivamente y, dado que este compuesto es menos soluble a un pH más bajo, limita su propia solubilidad en agua pura.

El hidróxido de sodio en KYBELLA es una base fuerte, que eleva el pH y, cuando se mezcla con el ácido desoxicólico, forma una sal de sodio acuosa y agua mediante una reacción ácido-base. La base conjugada del ácido desoxicólico en solución acuosa es desoxicolato. Esta porción del compuesto permanece sin cambios, independientemente de si es parte de un ácido libre o una sal de sodio. El fosfato de sodio es un compuesto amortiguador que ayuda a estabilizar el pH y permite un ajuste más fino para controlar el pH final y asegurar que permanezca soluble.


Agua purificada

Agua purificada

El agua purificada está destinada a la formulación de medicamentos que no están destinados a ser estériles y apirógenos. El agua purificada se usa ampliamente para productos orales y tópicos y en procesos de granulación para tabletas y cápsulas. También es el agua de alimentación para la producción de agua para inyección (WFI) y para vapor limpio de calidad farmacéutica. El agua purificada también se utiliza para el enjuague de equipos y para la preparación de soluciones de limpieza. El límite de acción microbiana en Europa es de 100 ufc / ml (equivalente a 10.000 ufc / 100 ml, dado que el método de prueba principal es la filtración por membrana). En los Estados Unidos, los compendios recomiendan que el límite lo establezca la evaluación de riesgos.

El agua purificada se prepara por ósmosis inversa. Las unidades de ósmosis inversa utilizan una membrana semipermeable y un diferencial de presión sustancial para impulsar el agua a través de la membrana y lograr mejoras químicas, microbianas y de calidad de endotoxinas. Los sistemas existen en múltiples formatos de diseño y a menudo se utilizan en serie. La ósmosis inversa funciona como un filtro de exclusión de tamaño que funciona en condiciones de alta presión.


Química de Rocky Star

El ácido acético glacial es ácido acético al 99,6% (p / v) y es de 17,4 M.

1 M - Agregue 57,5 ​​mL de ácido acético glacial a 800 mL de agua y luego afore a 1 litro con agua.

0.05 N - Agregue 2.87 mL de ácido acético glacial a 800 mL de agua y luego afore a 1 litro con agua.

0.9 M - Agregue 54 mL de ácido acético glacial a 800 mL de agua y luego afore a 1 litro con agua.

7% (p / v) - Agregue 70 mL de ácido acético glacial a 800 mL de agua y luego afore a 1 litro con agua.

45% (p / v) - Agregue 450 mL de ácido acético glacial a 500 mL de agua y luego afore a 1 litro con agua.

(15:60:25) - Combine 150 mL de ácido acético glacial, 600 mL de n-butanol y 250 mL de agua.

Agregue 2.0 gramos de orceína a 45 mL de ácido acético glacial. Deje hervir y continúe calentando hasta que se disuelva por completo. Enfriar y agregar 55 mL de agua destilada. Filtrar antes de usar. Nota: Algunos de los primeros investigadores agregaron una sal de hierro (como el citrato férrico) como mordiente. Tiende a aumentar la intensidad de la tinción de aceto-orceína. Se puede tener la misma reacción cortando material vegetal con una hoja de afeitar de acero más antigua (no inoxidable).

Agregue 1.0 mL de HCl concentrado a 100 mL de alcohol etílico al 70% (v / v).

Reactivo ácido de orcinol (FeCl 3 al 0,1% en HCl al 10%)

Añadir 0,1 gramos de FeCl 3 a 50 ml de HCl al 10% (v / v) y completar hasta 100 ml con HCl al 10%.

Las soluciones de acrilamida para PAGE se dan como concentración total de acrilamida (acrilamida + bisacrilamida) y la cantidad de reticulante (bisacrilamida). Esto se enumera como la relación T: C. Por ejemplo, un gel al 10% (10% T: 5% C) contendría un total de 10 g de carneros de acrilamida por 100 ml, y estaría compuesto por 5 gramos de acrilamida y 5 gramos de bisacrilamida. Normalmente, se produce una solución madre de acrilamida al 30% que contiene bis-acrilamida al 0,8%. Muchos investigadores utilizan 30 gramos de acrilamida más 0,8 gramos de bis-acrilamida por 100 ml de agua, pero 29,2 gramos de acrilamida más 0,8 gramos de bis serían técnicamente correctos. En la práctica, hay poca diferencia ya que los geles se diluyen al 10% o menos. La solución madre al 30% se filtra a través de un filtro de 0,45 y se almacena a 4 ° C en la oscuridad. Para su uso, la solución madre se diluye con un tampón apropiado (generalmente un 2X Tris-HCl). La solución madre es estable durante aproximadamente un mes. Desechar después de este período. Se añaden SDS, -mercaptoetanol y un colorante rastreador (azul de bromofenol) en varios puntos.

Azul alcián (MW Apéndice 1300)

0.001 M - Disuelva 0.13 gramos de Alcian Blue 8GX (Sigma # A-2899) en 100 mL de agua.

Reactivo de alcohol-orcinol (10% de orcinol en etanol al 95%)

Disuelva 1.0 gramo de orcinol en etanol al 95% hasta un volumen final de 10 mL.

Agregue un gránulo de NaOH a 1 litro de agua destilada.

Solución alcalina para bandas G

Disuelva 2.8 gramos de NaOH y 6.2 gramos de NaCl hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Ácido aminosalícico (PAS MW 175.1)

6% (p / v) - Disuelva 6.0 gramos de PAS hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0.1 M - Agregue 7.708 gramos de acetato de amonio a un volumen final de 1 litro de agua.

Persulfato de amonio (MW 228,2)

10% (p / v) - Disuelva 1.0 gramos de persulfato de amonio hasta un volumen final de 10 mL con agua. Mezclar fresco, antes de usarlo como catalizador para PAGE. Normalmente, se añaden aproximadamente 50 l de persulfato de amonio a cada 15 de solución de gel para la polimerización. Disuelva 0.13 gramos de Alcian Blue 8GX (Sigma # A-2899) en 100 mL de agua.

Sulfato de amonio (PM 132,14)

2% (p / v) - Agregue 2 gramos de sulfato de amonio a un volumen final de 100 ml de agua.

4,1 M (sat.) 0,001 M - Disuelva 542 gramos de sulfato de amonio hasta un volumen final de 1 litro.

alcohol n-amílico (pentanol C 5 H 11 OH - PM 88,15)

0.38 M - El alcohol amílico se puede pesar (33.5 gramos) o medir volumétricamente usando la densidad. Es decir, 33,5 gramos 0,8144 gramos / ml o 41,1 ml de alcohol n-amílico. Pesar o medir la cantidad adecuada y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

1% (p / v): disuelva 0,5 gramos de amilasa hasta un volumen final de 50 ml con tampón de fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,0.

2 mM: disuelva 35,2 mg de ácido ascórbico hasta un volumen final de 100 ml con agua.

ATP (trifosfato de adenosina, PM 507,21)

5 mM: disuelva 254 mg de ATP hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón. Disuelva 35,2 mg de ácido ascórbico hasta un volumen final de 100 ml con agua.

Agregue 1.0 gramo de cloruro de calcio, 1.0 gramo de cloruro de cadmio y 10 mL de formalina concentrada a 75 mL de agua. Llevar a un volumen final de 100 mL con agua.

8 mM: disuelva 98 mg de ácido benzoico hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Bis-acrilamida (N, N'-Metilen-bis-acrilamida)

Reticulante para geles de acrilamida.

Agregue 1.50 gramos de Cu 2 SO 4 H 2 O y 6.0 gramos de tartrato de sodio y potasio a 500 mL de agua. Prepare por separado 300 ml de NaOH al 10% (p / v) disolviendo 300 gramos de NaOH hasta un volumen final de 300 ml con agua. Combinar las dos soluciones en un volumétrico de 1 litro, agitar para mezclar y completar hasta 1 litro con agua. Guarde la solución final en una botella de plástico oscura. Desechar si se forma un precipitado rojo o negro.

Hay muchos grados de BSA disponibles y se debe tener cuidado al usar esta proteína. Para estándares de concentración de proteínas de rutina, se puede usar una fracción pura del 96-99% (Sigma # A 2153). Para cultivo de tejidos, RIA o estandarización del peso molecular, debe obtenerse BSA que se extrae y purifica específicamente para ese propósito.

1% (p / v): disuelva 0,5 gramos de BSA hasta un volumen final de 50 ml en agua o tampón.

Este procedimiento utiliza un cambio de absorbancia en una solución ácida de azul Coomasie. Está disponible comercialmente de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois como Protein Assay Reagent, cat. # 23200. Contiene metanol y agentes solubilizantes y es muy confiable. Si desea hacer el suyo, disuelva 100 mg de Coomasie Brilliant Blue G-250 en 50 mL de etanol al 95%. Agregar 100 mL de ácido fosfórico al 85% y llevar a un volumen final de 1 litro con agua destilada.

Azul de bromofenol (sal sódica, PM 692,0)

0,001 (p / v) - Disuelva 1 mg de azul de bromofenol, sal sódica (Sigma # B7021) hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

n-butanol (C 4 H 9 OH - PM 74,12)

1.1 M - El butanol se puede pesar (81.5 gramos) o medir volumétricamente usando la densidad. Es decir, 81,5 gramos 0,8098 gramos / ml o 100,7 ml de n-butanol. Pesar o medir la cantidad adecuada y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Esta es una solución salina básica para nematodos. Disuelva 11,36 gramos de Na 2 HPO 4 7 H 2 O, 3,0 gramos de KH 2 PO 4, 0,5 gramos de NaCl y 1,0 gramos de NH 4 Cl hasta un volumen final de 1 litro. Ajuste el pH a 7.0. Puede esterilizarse en autoclave.

Cloruro de calcio (MW 110,99)

0.0033 M - Disuelva 0.522 gramos de acetato de calcio hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

0.001 M - Disuelva 0.111 gramos de cloruro de calcio anhidro hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

0.08 M - Disuelva 8.879 gramos de cloruro de calcio anhidro hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

2% (p / v): disuelva 2 gramos de cloruro de calcio anhidro hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

AMPc (monofosfato de adenosina, cíclico - PM 329,22)

0,001 M (1 mM): disuelva 33 mg de cAMP hasta un volumen final de 100 ml con agua, tampón o medio.

Combine 10.0 mL de ácido acético glacial con 60.0 mL de alcohol etílico absoluto y 30.0 mL de cloroformo.

Tampón de homogeneización de cloroplasto

A 400 ml de agua destilada, agregue 30,058 gramos de sorbitol, 2,23 gramos de pirofosfato de sodio, 0,407 gramos de cloruro de magnesio y 0,176 gramos de ácido ascórbico. Ajustar el pH a 6.5 con HCl y diluir hasta un volumen final de 500 mL.

Tampón de suspensión de cloroplasto

A 400 mL de agua destilada, agregue 30.058 gramos de sorbitol, 0.372 gramos de EDTA, 0.102 gramos de cloruro de magnesio y 5.958 gramos de tampón HEPES. Ajustar el pH a 7,6 con NaOH y diluir hasta un volumen final de 500 mL.

Gelatina de alumbre de cromo (solución de sustitución)

Disuelva 5,0 gramos de gelatina en 1 litro de agua hirviendo. Enfriar y añadir 0,5 gramos de alumbre de potasio y cromo [CrK (SO 4) 2 12 H 2 O]. Conservar en frigorífico. Para usar, sumerja los portaobjetos limpios en la solución y séquelos en posición vertical en un lugar libre de polvo.

Ácido cítrico (H 3 C 6 H 5 O 7 H 2 O - PM 210.14)

0.1 M - Disuelva 21.01 gramos de ácido cítrico hasta un volumen final de 1 litro.

Tampón de citrato (tampón de fosfato de sodio-citrato)

Ph 4.8 - Agregue 493.0 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 507 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 3.6 - Agregue 322.0 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 678 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 4.2 - Agregue 414.0 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 586 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 5.4 - Agregue 557.5 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 442.6 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 6.0 - Agregue 631.5 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 368.5 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 6.6 - Agregue 727.5 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 272.5 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 7.2 - Agregue 869.5 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 130.5 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Ph 7.8 - Agregue 957.5 mL de Na 2 HPO 4 0.2 M a 42.5 mL de ácido cítrico 0.1 M.

Nitrato cobaltoso (MW 182,96)

2% (p / v) - Disuelva 2.0 gramos de nitrato cobaltoso (el hexahidrato es muy soluble) hasta un volumen final de 100 mL con agua. Consérvese bien cerrado en lugar fresco.

10 g / mL - Disuelva 10 g de colcemid por mL de solución salina o medio de cultivo.

Azul Coomasie (Azul brillante Coomasie R250)

0,25% (p / v) 0,001 M - Disuelva 2,50 gramos de Coomasie Brilliant Blue R250 hasta un volumen final de 1 litro con 20% (p / v) de ácido tricloroacético (TCA). Algunos investigadores utilizan una solución al 0,25% de azul de Coomasie en metanol-agua-ácido acético glacial (5-5-1).

Sulfato de cobre (CuSO 4. 5H 2 O MW 249,68)

0.5% (p / v) - Disuelva 0.13 gramos de Alcian Blue 8GX (Sigma # A-2899) en 100 mL de agua.

0.5% (p / v) - Disuelva 0.5 gramos de sulfato de cobre hasta un volumen final de 100 mL con agua.

Tartrato / carbonato de cobre (CTC)

Disuelva 0.5 gramos de sulfato de cobre y 1.0 gramo de tartrato de sodio y potasio hasta un volumen final de 100 mL con agua. Combine 1,0 ml de esta solución con 50 ml de Na 2 CO 3 al 2% en NaOH 0,1 N. Debe estar fresco antes de su uso. Las soluciones madre son estables.

Disuelva 0.1 gramos de violeta cristal y 0.25 mL de ácido acético glacial hasta un volumen final de 100 mL con agua.

DCMU [3- (3,4-Diclorofenil) -1,1-Dimetilurea - PM 233,1]

1 x 10 -4 M 0,001 M - Disuelva 2,3 mg de DCMU hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

5 x 10 -7 M0.001 M - Diluya la solución 1 x 10 -4 M 1/200 antes de usar.

Diclorofenolindofenol (DCPIP - MW 290.1)

0.0025 M - Disuelva 73 mg de DCPIP hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0,0001 M - Disuelva 2.9 mg de DCPIP hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

Dinitrofenol (DNP - MW 184.11)

18,4 mg% - Disuelva 18,4 mg de 2,4-dinitrofenol hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Reactivo de dische difenilamina

Disuelva 500 mg de difenilamina en 49 mL de ácido acético glacial. Agregue 1.0 mL de HCl concentrado.

Ditiotreitol (reactivo de Cleland - MW 154,3)

0.01 M - Disuelva 154 mg de ditiotreitol hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón. El ditiotreitol está disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, Cat # D0632. Puede sustituirse con ditioeritritol.

DOPA [3- (3,4-Dihidroxifenil) -L-alanina - PM 197,19]

8 mM: disuelva 158 mg de L-DOPA hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón. Tenga en cuenta que la solubilidad máxima de DOPA en agua es 165 mg / 100 ml (8,3 mM).

EDTA (ácido etilendiaminotetraacético - MW 292.24)

1 M - Disuelva 292,24 gramos de EDTA, ácido libre hasta un volumen final de 1 litro. Si se usa la sal disódica más soluble de EDTA, ajuste el peso en consecuencia. El pH se puede ajustar con ácido acético o NaOH. Para las diluciones de concentración correspondientes, multiplique el peso en gramos por la molaridad deseada. Por ejemplo, para EDTA 10 mM, multiplique 292,24 X 0,010 para obtener 2,92 gramos de EDTA por litro.

EGTA [Ácido etilenglicol-bis (aminoetílico) N, N N 'N'-tetraacético - PM 380,4]

1 mM - Disuelva 380 mg de EGTA hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

0.5% (p / v) - Disuelva 0.5 gramos de Eosina Y en 100 mL de agua.

Etanol (C 2 H 3 OH - PM 46,07)

50-95% (v / v): dado que el alcohol etílico al 95% es menos costoso y más fácil de almacenar que el absoluto, estas diluciones deben hacerse con alcohol etílico al 95%. A menos que se indique lo contrario, el alcohol desnaturalizado funciona tan bien como el no desnaturalizado más caro. Una forma sencilla de preparar la solución% es utilizar la cantidad adecuada de etanol al 95% y diluir a 950 ml en lugar de 1 litro. Por ejemplo, para hacer una solución al 50% (v / v), mida 500 mL de alcohol etílico al 95% y diluya hasta un volumen final de 950 mL con agua. Para una solución al 70%, mida 700 mL de alcohol etílico y diluya a 950 mL con agua. El etanol absoluto debe usarse directamente como etanol al 100%. Es importante para la histología que esto sea realmente del 100%. Dado que es hidroscópico (absorbe agua del aire), no asuma que es absoluto a menos que esté sellado o tratado para asegurar que no haya agua. Para probar, agregue una gota a una muestra de xilol. Si se produce alguna turbidez, el alcohol no es absoluto.

8.5 M - El etanol se puede pesar [391.6 gramos de absoluto, 412.2 gramos de 95% (v / v)] o medir volumétricamente usando la densidad. Es decir, 391,6 gramos 0,7893 gramos / ml o 496,1 ml de etanol absoluto. Usando 95%, 412.2 gramos 0.7893 gramos / mL o 522.2 mL. Pesar o medir la cantidad adecuada y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Fijador de etanol-ácido acético para histología (3: 1)

A 75 mL de alcohol absoluto, agregue 25 mL de ácido acético glacial. Debe estar fresco, justo antes de su uso.

Si bien es posible preparar su propio suero a partir de sangre total, es más fácil (y más seguro) comprar FCS de un proveedor de confianza. Las fuentes comerciales están libres de micoplasmas, preesterilizadas y controladas para detectar la presencia de anticuerpos. Hay varios sustitutos de suero disponibles en el mercado y estos pueden ser menos costosos cuando se considera el almacenamiento. Los proveedores incluyen Gibco, Flow Laboratories, KC Biological y Sigma Chemical Co.

Por lo general, se compra premezclado, ya que es difícil de preparar. También conocido como reactivo 2N Folin-fenol.

Prepare una solución madre disolviendo 3,8 gramos de polvo de giemsa en 25 ml de glicerina. Calentar suavemente con agitación durante aproximadamente 2 horas a 60 ° C. Enfriar y agregar 75 mL de metanol (neutro, sin acetona). Para una solución de trabajo, diluya la solución madre 1 /10 con agua antes de usar. Para las bandas cromosómicas, combine 5,0 mL de stock Giemsa, 3,0 mL de metanol absoluto, 3,0 mL de ácido cítrico 0,1 M y 89 mL de agua destilada. Ajustar el pH de la solución a 6,6 con Na 2 HPO 4.

10% (v / v): disuelva 10 gramos de D-glucosa (dextrosa) en un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

5% - GTA generalmente se suministra como una solución al 25% o 50% (p / v). Se utiliza para la fijación al microscopio electrónico como una solución al 5% en un tampón. Para uso rutinario, agregue 20 ml de GTA al 25% a 80 ml de tampón de cacodilato de sodio 0,2 M, pH 7,4.

10% (v / v) - A 10 mL de glicerol (glicerina) agregue suficiente agua para hacer un volumen final de 100 mL.

8 M - Pese 73,67 gramos de glicerol y agregue hasta un volumen final de 100 mL. Alternativamente, mida 499.1 mL de glicerol y hágalo hasta un volumen final de 1 litro (la densidad del glicerol a temperatura ambiente es 1.476) con agua o tampón. Para glicerol 8 M en tampón MT, prepare un tampón MT 2X para usar como diluyente.

0.192 M - Disuelva 1.44 gramos de glicina hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

Disuelva 0,33 gramos de yodo y 0,67 gramos de yoduro de potasio hasta un volumen final de 100 ml con agua.

HEPES [N- (2-hidroxietil) piperazina-N '- (ácido 2-etanosulfónico) - PM 238,3]

50 mM - Disuelva 11,92 gramos de HEPES, ácido libre hasta un volumen final de 1 litro. Si se usa sal hemisódica, ajuste el peso en consecuencia. No use sales de sodio a menos que se especifique. La sal de hemisodio contiene 0,5 moles de sodio por cada mol de HEPES.

pH7.6 - Disuelva 2.38 gramos de HEPES, ácido libre en 900 mL de agua. Ajuste el pH con NaOH o HCl a 7,6. Ajustar el volumen final a 1 litro con agua destilada.

Ácido clorhídrico (HCl - MW 36.46)

El HCl concentrado tiene una molaridad de aproximadamente 11,6. El HCl es un gas soluble en agua que se presenta en forma de HCl concentrado de grado reactivo. Esta solución es aproximadamente 36-38% (p / v) de HCl.

1 N - agregar 86 mL de HCl concentrado a 800 mL de agua y diluir hasta un volumen final de 1 litro.

0.1 N - diluya el 1 N por un factor de 10.

% de soluciones, tenga en cuenta que el HCl líquido es solo el 38% de HCl, por lo que una solución al 1% requeriría 2.6 mL de HCL concentrado (1 / .38) por volumen final de 100 mL.

0.01% (p / v) - Disuelva 10 mg de Janus Green B en 2-3 mL de etanol absoluto. Diluir hasta un volumen final de 100 mL con agua.

Ca 3 (NO 2) 4H 2 O - 4.0 gramos

H 2 O destilada - 1,0 litro

Na 2 MoO 4 2H 2 O - 25 mg

H 2 O destilada - 1,0 litro

FeC 6 H 5 O 7 5H 2 O - 2,5 gramos

Medio 1X: agregue 250 mL de Knudson X4 a 750 mL de agua destilada. Añada 0,5 ml de elementos menores B5, 0,5 ml de fosfato madre y 0,4 ml de citrato férrico. Ajuste el pH a 5,5 con HCL, agregue 15 gramos de agar y caliente para disolver. Esterilizar y verter en platos.

Timbres de fosfato de Krebs (KPR)

Prepare cada uno de los siguientes por separado:

Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 (17,8 gramos de Na 2 HPO 2 H 2 O

+ 20 mL de HCL 1 N, diluido a 1 litro)

Para mezclar, combine 200 mL de NaCl, 8 mL de KCl, 6 mL de CaCl 2 y 2 mL de MgSO 4. Con cuidado y agitando constantemente, agregue 40 mL de tampón fosfato.

Tampón LPS (tampón de solución de almohadilla inferior)

Disuelva 1,5 gramos de KCl, 0,5 gramos de MgCl 2 y 0,5 gramos de sulfato de esteptomicina en 500 ml de agua. Agregue 40 mL de tampón fosfato 1 M, pH 6.5 y diluya a 1 litro con agua.

Cloruro de magnesio (MgCl 2 - MW 95.23)

1 mM - Disuelva 95,2 mg de cloruro de magnesio por volumen final de 1 litro.

4 mM - Disuelva 0.381 gramos de cloruro de magnesio por volumen final de 1 litro.

10 mM - Disuelva 0.952 gramos de cloruro de magnesio por volumen final de 1 litro.

0.1 M - Disuelva 9.523 gramos de cloruro de magnesio por volumen final de 1 litro.

Sulfato de magnesio (MgSO 4 - MW 120,39)

5% (p / v): disuelva 5,0 gramos de sulfato de magnesio hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Compre comercialmente o mezcle con cualquiera de los siguientes procedimientos:

A. Disuelva 1.0 gramo de hematoxilina en 10 mL de etanol absoluto. Disuelva 20 gramos de alumbre de potasio (KAl (SO) 2 12H 2 O) en 200 mL de agua. En una campana química, con protección contra explosión, hierva la solución de alumbre de potasio y agregue la mezcla de hematoxilina / etanol. Continúe hirviendo durante aproximadamente un (1) minuto. Agregue 0.5 gramos de óxido de mercurio y enfríe rápidamente. Agregue 0.5 mL de ácido acético glacial. Filtrar antes de usar. Esta mezcla es estable durante unos dos meses.

B. Alternativamente: disuelva 5.0 gramos de hematoxilina en 50 mL de etanol absoluto y agregue a 650 mL de agua tibia. Calentar suavemente hasta que la hematoxilina se disuelva y luego agregar 300 mL de glicerina, 0.3 gramos de yodato de sodio y 20 mL de ácido acético glacial. Enfriar y completar el volumen hasta 1 litro con agua destilada. Filtrar antes de usar.

0,5 M - Densidad = 1,2 gramos / mL. Utilice 3,91 gramos O 3,26 ml de -mercaptoetanol en un volumen final de 100 ml de agua o tampón.

5% (p / v): use 5.0 gramos o 4.167 mL en un volumen final de 100 mL de agua o tampón.

MES [ácido 2- (N-morfilino) etanosulfónico - PM 195,2]

0.1 M - Disuelva 1.952 gramos de MES hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

Metanol (CH 3 OH - MW 32,04)

22 M - El metanol se puede pesar (704,9 gramos) o medir volumétricamente utilizando la densidad. Es decir, 704,9 gramos 0,7914 gramos / ml o 890,7 ml de alcohol metílico. Pesar o medir la cantidad adecuada y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Metanol / ácido acético (para fijar proteínas en geles de acrilamida)

45%: 12% - Agregar 120 mL de ácido acético glacial a 450 mL de metanol y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Metanol / ácido acético (para decolorar o fijar proteínas en geles de acrilamida)

5%: 7% - Agregar 70 mL de ácido acético glacial a 50 mL de metanol y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

0,2% (p / v): disuelva 0,2 gramos de verde de metilo hasta un volumen final de 100 ml con tampón acetato 0,1 M, pH 4,2.

Tampón de microtúbulos (tampón MT)

Disuelva 19,52 gramos de MES en 800 mL de agua destilada. Agregue 0.380 gramos de EGTA y 47.62 gramos de MgCl 2. Ajustar el pH a 6,4 con HCL o NaOH y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua destilada.

Medio mínimo esencial (MEM)

Para todos los propósitos de este manual, MEM se refiere al MEM de Eagle. Si bien es posible mezclar este medio, es infinitamente más fácil (y menos costoso) comprar el medio premezclado de cualquier número de fuentes comerciales (Gibco, Flow, KC Biological, Sigma Chemical). Es esencial que se utilicen productos químicos de la más alta pureza.

Agar NG (agar de crecimiento de nematodos)

Disuelva 3,0 gramos de NaCl, 2,5 gramos de peptona y 17 gramos de agar en un volumen final de 1 litro. Hervir para disolver el agar, esterilizar en autoclave. Mientras tanto, prepare soluciones estériles separadas de:

10 mg / mL de colesterol en etanol

Tampón de fosfato de potasio 1 M, pH 6,0

Utilizando una técnica estéril adecuada, enfríe ligeramente la solución de agar y agregue 1 ml de CaCl 2, 1 ml de uracilo, 0,5 ml de colesterol, 25 ml de tampón fosfato y 1 ml de MgSO 4. Gire para mezclar todos los ingredientes y vierta los platos.

Fosfato de nitrofenilo (MW 263,1)

0.05 M - Disuelva 1.32 gramos de fosfato de nitrofenilo hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0.8% (p / v) - Disuelva 0.8 gramos de fosfato de nitrofenilo hasta un volumen final de 100 mL de agua o tampón.

Tetróxido de osmio (OsO 4 - MW 254,2)

El uso de una campana extractora es obligatorio cuando se usa OsO4. El tetróxido de osmio reparará rápidamente los conductos nasales y la córnea expuesta si no se ventila adecuadamente. Debe manipularse con sumo cuidado.

1%: el tetróxido de osmio es un gas que se utiliza en solución para la conservación de EM. Se compra mejor en viales sellados de 2 ml de OsO al 4%.4. Para su uso, agregue 6.0 mL de agua o tampón a los 2.0 mL de tetróxido de osmio al 4%. Selle en un recipiente herméticamente cerrado, envuelto con papel de aluminio y manténgalo en el refrigerador.

Ácido perclórico (PCA - MW 100,47)

2% (p / v): disuelva 2,0 gramos de PCA hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Sílice coloidal recubierta de PVP. Disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis. Gato. #P 1644.

Ácido periódico (Periodato: utilizado para la reacción PAS)

Disuelva 0.6 gramos de ácido periódico en 100 mL de agua y agregue 0.3 mL de ácido nítrico concentrado.

Metosulfato de fenazina (PMS - PM 306,34). Mutágeno e irritante.

0.033% (v / v) - Agregue 33 l de metosulfato de fenazina a 90 mL de agua o tampón y complete hasta 100 mL de volumen final. Debe prepararse inmediatamente antes de su uso.

El fenol causa quemaduras graves y disuelve fácilmente todos los compuestos de plástico y caucho. Tenga mucho cuidado al manipular este compuesto.

Combine 555 mL de fenol acuoso (o 500 gramos de cristales de fenol más 55 mL de agua) con 70 mL de mcresol. Agregue 0.5 gramos de 8-hidroxiquinolina.

Oxalato de fenilendiameno (PPDO - MW 198.18)

0.02% (p / v) - Disuelva 20 mg de PPDO hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

Solución salina tamponada con fosfato (PBS)

Mezclar 100 mL de Ca +2 / Mg +2 10X PBSA libre con 800 mL de agua destilada. Por separado, disuelva 0,1 gramos de cloruro de magnesio y 0,1 gramos de cloruro de calcio anhidro hasta un volumen final de 100 ml con agua. Con agitación constante, agregue lentamente la solución de cloruro de magnesio / calcio a la PBSA diluida. Si se forma un precipitado, comience de nuevo y agregue más lentamente con agitación continua.

Solución salina tamponada con fosfato libre de Ca +2 / Mg +2 - 10X (10X PBSA)

Disuelva 80 gramos de NaCl, 2.0 gramos de KCl, 15.0 gramos de fosfato de sodio dibásico y 2.0 gramos de fosfato de potasio monobásico en 1 litro de agua destilada. Esto produce una solución 10X de solución salina tamponada con fosfato libre de Ca +2 / Mg +2. Diluir 1:10 antes de usar. Conservar en nevera.

Solución salina tamponada con fosfato-Tween 20 (4.8)

Mezcle PBS y agregue 0.1% (v / v) Tween 20.

Disponible como lecitina de frijol. Por lo general, se utiliza como una solución madre de 10 a 20 g / ml en una solución salina equilibrada. Para el cultivo de tejidos, debe esterilizarse en frío antes de su uso.

Cloruro de potasio (KCl - MW 74.55)

1 M - Disuelva 74,55 gramos de KCl hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón. Para otras concentraciones, multiplique el peso por la molaridad requerida. Por ejemplo, para 0.150 M (150 mM), use 0.150 X 74.55, o 11.183 gramos de KCl en 1 litro de agua o tampón. Utilice la mitad para obtener 0,075 M para el cariotipo.

Cianuro de potasio (KCN - MW 65.11)

8 mM: disuelva 52 mg de KCN hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Fosfato de potasio, monobásico (KH 2 PO 4 - MW 136.09)

0.01M - Disuelva 1.36 gramos de fosfato de potasio monobásico hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Fosfato de potasio, dibásico (K 2 HPO 4 - MW 174)

0.01 M - Disuelva 1.74 gramos de fosfato de potasio dibásico hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Tampón de fosfato de potasio

0.01M - pH 7.4 - Prepare 500 mL de K 2 HPO 4 0.01 M y 500 mL de KH 2 PO 4 0.01 M. Coloque el KH 2 PO 4 en un agitador magnético e inserte un electrodo de pH. Agregue el K 2 HPO 4 lentamente para ajustar el pH a 7,4.

Hidróxido de potasio (KOH - MW 56.10)

0.5 N - Disuelva 28.05 gramos de KOH a un volumen final de 1 litro con agua.

10% (p / v): disuelva 10 gramos de KOH hasta un volumen final de 100 ml con agua. Almacenar en un recipiente de plástico.

Tartrato de sodio y potasio - Sal de Rochelle (KNaC 4 H 6 O 6 4H 2 O - MW 282.23)

n-propanol (C 3 H 7 OH - PM 60,11)

3 M - El n-propanol se puede pesar (180,3 gramos) o medir volumétricamente utilizando la densidad. Es decir, 180,3 gramos 0,8035 gramos / mL o 224,4 mL de n-propanol. Pesar o medir la cantidad adecuada y diluir hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Disuelva 1.46 gramos de K 2 HPO 4 y 0.92 gramos de K 2 HPO 4 en 80 mL de agua destilada. Añada 2,5 gramos de albúmina sérica cristalina y ajuste el volumen a 100 ml finales con agua.

0.6% (p / v) - Disuelva 0.6 gramos de pironina Y en 100 mL de acetona.

0,1% (p / v): disuelva 10 mg de ribonucleasa pancreática tipo A en 10 ml de agua o tampón. Use para el tratamiento enzimático de secciones histológicas flotando 0.5-1.0 mL de esta solución en la sección, con el portaobjetos en una placa de Petri cubierta.

Disuelva 2.5 gramos de safranina O en 10 mL de etanol al 95% y diluya a 100 mL con agua.

0.85% (p / v): solución salina se refiere a una solución de NaCl, con el uso más común para lo que es isotónico para las células sanguíneas de mamíferos, notablemente una solución al 0.85% o 0.9%. Para mezclar, disuelva 8.5 gramos de NaCl hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Citrato salino (1 /10 dilución de SSC)

Disuelva 0,878 gramos de NaCl y 0,294 gramos de citrato de sodio hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Tampón de citrato salino (SSC)

20X: es común preparar este tampón como una solución stock 20X, para diluirlo a 2X, 1X o 0.1X antes de su uso. Para preparar una solución madre 20X, disuelva 175 gramos de NaCl y 88 gramos de citrato de sodio en 900 ml de agua. Ajustar el pH a 7.0 con HCL 1 N y llevar a un volumen final de 1 litro. Para usar, como 1X SSC, diluya 1 parte de stock 20X con 19 partes de agua destilada. Para un 2X SSC, diluya 1 parte de stock 20X con 9 partes de agua.

Disuelva 0.8 gramos de fucsina básica en 85 mL de agua destilada. Agregue 1.9 gramos de metabisulfito de sodio y 15.0 mL de HCL 1 N. Coloque la solución en un embudo de decantación y agite a intervalos de 2 horas durante aproximadamente 12 horas. Agregue 200 gramos de carbón activado, agite durante 1 minuto y filtre la solución transparente. Si la solución todavía es rosa, agregue otros 100 gramos de carbón y agite por un minuto más. Filtrar y almacenar en una botella oscura. La solución debe ser transparente (sin coloración rosada) para su uso.

Disuelva 2.0 gramos de bicarbonato de sodio y 20.0 gramos de sulfato de magnesio en agua hasta un volumen final de 1 litro. Agregue una pizca de timol para retardar el crecimiento de mohos.

Consulte Lauril sulfato de sodio.

Tampón de ejecución de electroforesis SDS 1X

Diluya el tampón de tris-glicina 5X a 1X y agregue 1.0 gramo de SDS por litro de Tris-Glycine 1X. El pH debe ser de 8,3 después de la dilución.

Disolver 1.52 gramos de base Tris, 2.0 gramos de SDS, 20 mL de glicerina, 2.0 mL de -mercaptoetanol y 1 mg de azul de bromofenol hasta un volumen final de 100 mL con agua.

Las pipetas Pasteur pueden siliconizarse sumergiéndolas en un vaso de precipitados que contenga diclorodimetilsilano al 5% (v / v) en cloroformo durante aproximadamente 1 minuto. Retirar, escurrir y enjuagar varias veces con agua destilada. Hornee las pipetas a 180 ° C durante 2 horas y déjelas enfriar antes de usarlas.

Solución de nitrato de plata (para tinción por electroforesis)

Disuelva 0.15 gramos de NaOH en 150 mL de agua. Agregar 3.5 mL de NH 4 OH concentrado y llevar a un volumen de 200 mL. Por separado, disuelva 2.0 gramos de nitrato de plata en un volumen final de 10 mL. Con agitación constante, agregue 8.0 mL del nitrato de plata a los 200 mL de NaOH / NH 4 OH. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes de su uso y usarse dentro de los 30 minutos.

Medio agar SM (medio Slime Mold de Sussman)

Disuelva 10.0 gramos de glucosa, 10.0 gramos de peptona, 1.0 gramo de extracto de levadura, 1.0 gramo de MgSO 4, 1.5 gramos de KH 2 PO 4, 1.0 gramo de K 2 HPO 4 y 20.0 gramos de agar hasta un volumen final de 1 litro. . Calentar para disolver el agar, esterilizar en autoclave y dispensar en placas de Petri.

1 M - Disuelva 82.04 gramos de acetato de sodio hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

0.02 M - Disuelva 1.64 gramos de acetato de sodio hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

1 M - pH 5.7 - A 925 mL de acetato de sodio 1 M, agregue 75 mL de ácido acético 1 M.

0.01 M - Disuelva 0.065 gramos de azida de sodio hasta un volumen final de 100 mL con agua.

0.39% (p / v) - Disuelva 0.39 gramos de azida de sodio a un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0,2% (p / v): disuelva 0,2 gramos de barbitol sódico hasta un volumen final de 100 ml con agua.

Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 - MW 84.0)

0,1 M: disuelva 0,84 gramos de NaHCO 3 hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

0,2 M - pH 7,4 - Prepare una solución 0,2 M de ácido cacodílico, sal sódica (PM 159,91). Disuelva 3,20 gramos de ácido cacodílico, sal sódica hasta un volumen final de 100 ml con agua. Ajuste el pH a 7,4 con HCL.

2% (p / v): disuelva 2,0 gramos de carbonato de sodio hasta un volumen final de 100 ml con NaOH 0,1 N.

NaOH 0,1 N: se utiliza para el ensayo de proteínas Lowry.

M - Para una solución molar de cloruro de sodio, disuelva 58,44 gramos de NaCl hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón. Para las diluciones correspondientes, multiplique el peso por la molaridad requerida. Por ejemplo, para 0.05 M, multiplique 58.44 por 0.05 o 2.92 gramos / litro.

%: Para soluciones de%, son invariablemente p / v. Para una solución al 1% (p / v), disuelva 1.0 gramo de NaCl hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón. Multiplique el peso por un cambio correspondiente en% para otras concentraciones.

200,300,400 mOsM - Los osmoles para NaCl se calculan como el doble de la concentración molar. Por lo tanto, una solución de 200 mOsM sería NaCl .100 M. Asimismo, 300 mOsM sería .150 M y 400 mOsM sería NaCl 0.200 M.

0.09 M - Disuelva 2.65 gramos de citrato de sodio a una concentración final de 100 mL con agua.

Citrato de sodio / formaldehído (para proteínas teñidas con plata)

Disuelva 5,0 gramos de citrato de sodio en 800 mL de agua, agregue 5,0 mL de formalina concentrada (solución de formaldehído al 37%) y diluya a 1 litro con agua.

Desoxicolato de sodio (ácido desoxicólico, sal de sodio - MW 392.58)

0.15% (p / v) - Disuelva 150 mg de ácido desoxicólico, sal sódica hasta un volumen final de 100 mL con agua.

Ditionito de sodio (Na 2 S 2 O 6 2H 2 O - MW 242.16)

0.1 mg / mL - Disuelva 10 mg de ditionito de sodio en 100 mL de agua justo antes de su uso. Alternativamente, para reducir una solución, se puede agregar el polvo seco según sea necesario. El ditionito de sodio debe almacenarse a -20% deg C.

Fluoruro de sodio (NaF MW 42.0)

0.1 M - Disuelva 4.2 gramos de NaF hasta un volumen final de 1 litro con agua.

Lauril sulfato de sodio (SDS o SLS - MW 288.38)

0,1% (p / v): disuelva 0,1 gramos de SDS hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Mezclar revolviendo suavemente, no agitar.

10% (p / v): disuelva 10 gramos de SDS hasta un volumen final de 100 ml con agua.

0.6 M - Disuelva 2.49 gramos de ácido malónico, sal sódica, hasta un volumen final de 25 mL con agua o tampón.

Perclorato de sodio (NaClO 4 H 2 O - MW 140.47)

1 M - Disuelva 14.01 gramos de perclorato de sodio a un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

Fosfato de sodio, monobásico (NaH 2 PO 4 H 2 O - MW 137,99)

1 M - Disuelva 14.01 gramos de perclorato de sodio a un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0.01 M - Disuelva 1.38 gramos de fosfato de sodio monobásico hasta un volumen final de 1 litro.

Fosfato de sodio, dibásico (Na 2 HPO 4 7H 2 O - MW 268.07)

1 M - Disuelva 268,07 gramos de fosfato de sodio dibásico hasta un volumen final de 1 litro.

0.2 M - Disuelva 53.61 gramos de fosfato de sodio dibásico hasta un volumen final de 1 litro.

0.01 M - Disuelva 2.68 gramos de fosfato de sodio dibásico hasta un volumen final de 1 litro.

Estos son los tampones más utilizados en biología. Se producen mediante la adición de soluciones equimolares de KH 2 PO 4 y Na 2 HPO 4. Los mismos volúmenes de los dos producirán un pH de 7.0, mientras que el fosfato de sodio aumentará el pH. El aumento de los volúmenes de fosfato de potasio reducirá el pH. El pH se puede ajustar de 5,4 a 8,2. Si se desea un pH de 7.0-8.2, comience con 500 mL de fosfato de sodio y agregue fosfato de potasio mientras agita y monitorea el pH con un medidor de pH hasta que se alcance el pH deseado. Si se desea un pH de 5.4-7.0, comience con 500 mL de fosfato de potasio y agregue fosfato de sodio hasta alcanzar el pH deseado. Normalmente, la molaridad del tampón variará de 0,01 a 0,1 M. Utilice la molaridad adecuada de KH 2 PO 4 y Na 2 HPO 4. Es decir, si se desea un tampón 0,05 M, utilice KH 2 PO 4 0,5 M y Na 2 HPO 4 0,5 M como se indicó anteriormente.

Tampón de fosfato de sodio y potasio: consulte Tampón de fosfato de sodio.

Pirofosfato de sodio (Na 4 P 2 O 7 10H 2 O - MW 446.06)

10 mM - Disuelva 0.446 gramos de Na 4 P 2 O 7 10H 2 O hasta un volumen final de 100 mL con agua.

Succinato de sodio (MW 270.16)

0.6 M - Disuelva 16.2 gramos de ácido succínico, sal sódica hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

0.33 M - Disuelva 60.12 gramos de sorbitol hasta un volumen final de 1 litro con agua o tampón.

Tampón de fosfato de Sorenson: consulte el tampón de fosfato de sodio.

0.2 M - pH 7.5 - Disuelva 24.14 gramos de Na 4 P 2 O 7 y 4.08 gramos de KH 2 PO 4 en 800 mL de agua. Diluir hasta un volumen final de 1 litro.

Solución de sustitución (portaobjetos): consulte la gelatina de alumbre de cromo.

1.0 M - Disuelva 34.2 gramos de sacarosa hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón. Para otras molaridades, multiplique el peso por la concentración molar requerida. Por ejemplo, para sacarosa 0,25 M, pese 34,2 x 0,25 o 8,55 gramos hasta un volumen final de 100 ml.

40% (p / v): disuelva 40 gramos de sacarosa hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón. Diluya esta solución para requisitos porcentuales más bajos. Si se usa para gradientes de densidad de sacarosa, se debe agregar a la sacarosa 0.1 mL de dietilpirocarbonato, la solución se debe llevar a ebullición durante 3-5 minutos y se debe enfriar antes de usar. Esto eliminará la ARNasa, que de otro modo sería un contaminante de la solución. Guarde todas las soluciones de sacarosa en un refrigerador.

Ácido sulfúrico (H2ASI QUE4 - MW 98,08)

H concentrado2ASI QUE4 es 17,8 M o 35,6 N. 1,09 N Añada 30,6 mL de ácido sulfúrico concentrado lentamente, con agitación constante y con la protección adecuada contra salpicaduras, a aproximadamente 800 mL de agua. Enfriar y hacer volumen a 1 litro con agua.

Ácido sulfuroso (para la reacción de Feulgen)

Agregue 1.0 mL de HCl concentrado y 0.4 gramos de bisulfito de sodio a 100 mL de agua destilada. Esta solución debe estar fresca antes de su uso. No se almacena bien.

Para fines de cultivo de tejidos, use un detergente no tóxico diseñado para el lavado quirúrgico. p.ej. Phisohex, Betadine o equivalente. Para la mayoría de los frotis de rutina, el etanol al 70% (v / v) es suficiente y tiene la ventaja de que no dejará residuos.

TEMED (N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina)

Catalizador para PAGE. Utilizar directamente y añadir 10 l de TEMED por 15 ml de solución de gel.

0.1% (p / v) - Disuelva 0.1 gramos de azul de toluidina en 10 mL de etanol y agregue agua o tampón de citrato (pH 6.8-7.2) hasta un volumen final de 100 mL.

Ácido tricloroacético (TCA - CCl3COOH - MW 163,4)

72% (p / v): disuelva 72 gramos de TCA hasta un volumen final de 100 ml. El TCA es hidroscópico y absorbe agua fácilmente. Los cristales sólidos se volverán líquidos si la botella de stock se coloca en agua tibia, con una tapa suelta (punto de fusión 57-58 ° C). Es más fácil de manejar como líquido. El almacenamiento de soluciones superiores al 30% (p / v) es no se recomienda ya que la descomposición es rápida, por lo que estas soluciones deben prepararse según sea necesario.

Existen muchas variaciones en la combinación básica de tampón Tris-HCl, la mayoría de las cuales están disponibles comercialmente. Las soluciones con EDTA se conocen como tampones TE, mientras que las soluciones con EDTA y ácido acético se conocen como tampones TAE. La terminología varía según el autor, y el tampón Tris se utiliza para referirse a las soluciones Tris-HCL. Sigma Chemical Co., St. Louis, tiene una línea completa de tampones comercializados con el nombre comercial de Trizma (base y HCl). El tampón básico es una combinación de Tris (tris (hidroximetil) aminometano) y ácido HCl. A veces se las denomina soluciones Tris-base y Tris-HCl. Los tampones Tris no deben usarse por debajo de un pH de 7.2 o por encima de un pH de 9.0. Los tampones Tris también son extremadamente sensibles a la temperatura. Se dan instrucciones para temperatura ambiente (25 ° C). El pH disminuirá aproximadamente 0.028 unidades por cada grado de disminución de temperatura.

1 M - Disuelva 121 gramos de Tris en 800 mL de agua destilada. Ajuste el pH con HCl concentrado. Diluir hasta un volumen final de 1 litro. Las molaridades inferiores requeridas se pueden diluir de esta reserva o mezclar como combinaciones de molaridades inferiores de Tris y HCl. Es importante medir el pH a la temperatura y la molaridad que se utilizará en el análisis final.

5X - Disuelva 15,1 gramos de tris base y 72,0 gramos de glicina hasta un volumen final de 1 litro. Para su uso, diluya 1 parte de tampón 5X con 4 partes de agua.

0,2% (p / v): disuelva 0,2 gramos de azul tripán hasta un volumen final de 100 ml con agua.

0.25% - 0.25% Disuelva 0.25 gramos de tripsina cruda en PBSA hasta un volumen final de 100 mL. Esterilizar en frío por filtración. Alternativamente, compre tripsina cruda prediluida, vendida como 1: 250 que también está preesterilizada.

Agregue 17,0 gramos de tripticasa peptona, 3,0 gramos de fitona peptona, 5,0 gramos de cloruro de sodio, 2,5 gramos de fosfato dipotásico y 2,5 gramos de glucosa a 1 litro de agua. Ajuste el pH a 7,3 y esterilice en autoclave.

Tween 20 u 80 (monooleato de polioxietilensorbitán)

1% (v / v) - Agregue 1.0 mL de Tween a 90 mL de agua. Mezclar y diluir hasta un volumen final de 100 mL con agua.

5% (p / v): disuelva 5,0 gramos de acetato de uranilo hasta un volumen final de 100 ml en etanol al 50% (v / v). Almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente. Deje pasar al menos 24 horas para que el acetato de uranilo se disuelva por completo. Esta solución se mantendrá durante unos 3 meses.

2.5 M - Disuelva 15.02 gramos de urea hasta un volumen final de 100 mL con agua o tampón.

10 M: disuelva 60,06 gramos de urea hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

14 M - Disuelva 84,08 gramos de urea hasta un volumen final de 100 ml con agua o tampón.

Tinción de viabilidad: consulte Azul tripán.

  • Proporcionar una fuente de datos en línea para los laboratorios de biología celular estándar o para la educación basada en la investigación.
  • Para crear un acceso rápido y fácil a muchos otros recursos relacionados con la informática en biología celular en Internet.
  • Globalizar la instrucción del laboratorio de biología celular a través de la red de información.
  • Individualizar la instrucción del laboratorio de biología celular para diferentes instituciones.
  • Reducir el costo de la educación para los futuros científicos.

Información de copyright del Manual de laboratorio de biología celular.
Este trabajo está respaldado por la subvención No. DUE 9451132 de la National Science Foundation.
Los derechos de autor siguen siendo propiedad del Dr. William H. Heidcamp.

Un laboratorio de biología celular se compone de una variedad de técnicas y procedimientos recopilados durante un período de tiempo por el autor. Hasta cierto punto, la colección representa el sesgo del autor para la selección de temas y ejercicios específicos. La presente colección no es una excepción. Los amigos que conocían la existencia de la colección pensaron que era necesario publicarla. La colección original abarcaba alrededor de 100 páginas de folletos y produjo un exceso de 350 páginas.

Los ejercicios están organizados en quince capítulos y diez apéndices que tratan temas que se consideran fundamentales para la apreciación de la biología celular moderna. Se agregará material de forma regular. Se agradecen sugerencias y ejercicios específicos. Al revisar los cursos impartidos por docenas de instructores de biología celular, y al observar los planes de estudio resumidos de otros cien, es evidente que existe una gran diversidad en la instrucción de la biología celular. En algunas instituciones, la biología celular es un curso introductorio sin requisitos previos y, a menudo, sustituye a la biología general. Puede enseñarse sin componentes de laboratorio o con herramientas y equipos bastante simples diseñados para ilustrar conceptos básicos. En el otro extremo, el curso limita con el nivel de pregrado superior al de posgrado de primer año, con procedimientos sofisticados, costosos y que requieren mucho tiempo, generalmente centrados en el área de investigación profesional del instructor. La preponderancia de los cursos de biología celular se encuentra entre estos extremos; son cursos que se ofrecen a los graduados en biología con un requisito previo de biología general, una preferencia por algunos antecedentes de química y están diseñados para conducir hacia un trabajo adicional a nivel molecular de estudio (Genética y Biología Molecular o Inmunología).

Los ejercicios tienen tres niveles. Los ejercicios de nivel I presentan conceptos fundamentales y utilizan técnicas mínimas necesarias para estudiar las células. Se cree que cualquier institución debe tener las facilidades para completar estos ejercicios. El nivel II presenta técnicas y procedimientos que requieren más tiempo y energía de los estudiantes e instructores. El trabajo en este nivel es apropiado para que un estudiante de biología continúe con estudios de posgrado y profesionales. Requiere más equipo y suministros que el Nivel I. Los departamentos que se toman en serio los estudios actuales en biología celular tendrán disponible o planearán comprar el equipo necesario para realizar las actividades del Nivel II. El nivel III satisface las necesidades de trabajo avanzado y estudios independientes en el campo. Los ejercicios presentados en este nivel han sido realizados por estudiantes que trabajan con el autor y por lo tanto se pueden realizar en una institución de pregrado. Los ejercicios del Nivel III están destinados a fomentar los proyectos de investigación de los estudiantes. Los estudiantes serán responsables del trabajo más allá del laboratorio programado. Los ejercicios de nivel III combinan varias técnicas avanzadas y, a menudo, requieren instrumentación que puede no estar fácilmente disponible en el departamento de biología de la universidad promedio.

Sin embargo, no hay ejercicios que alguna institución de pregrado no esté realizando actualmente. La decisión de colocar un ejercicio en un nivel determinado es únicamente del autor, no todos dividirían los ejercicios de la misma manera. Por tanto, la indicación del nivel es orientativa, no absoluta. Se le permite descargar y modificar cualquiera de los documentos HTML o imágenes para uso educativo. Sin embargo, se le solicita que indique la fuente de los materiales utilizados. Si tiene la intención de utilizar los ejercicios, háganos saber cuántas copias hará y el propósito previsto (para nuestros registros). Todas las copias deben contener la fuente del material y una declaración de apoyo de la National Science Foundation. Los derechos de autor siguen siendo propiedad del Dr. William H. Heidcamp. Si tiene comentarios sobre los ejercicios, correcciones o mejoras, comuníquese con nosotros. Si desea agregar un ejercicio, lo revisaremos y lo agregaríamos a la lista. Se le dará todo el crédito por el ejercicio, pero debe permitir el uso gratuito del ejercicio a través de la red.


Función del citocromo P450 y roles farmacológicos en la inflamación y el cáncer

Tiangang Li, Udayan Apte, en Avances en farmacología, 2015

3.2.5 Receptor de Pregnane X

La PXR puede ser activada por una amplia gama de xenobióticos, endobióticos y fármacos clínicos y, a su vez, induce varias enzimas de la familia CYP3A y CYP2, enzimas de conjugación y transportadores en el metabolismo de fármacos (Kliewer, Goodwin y Willson, 2002). En la colestasis, niveles elevados de ácidos biliares primarios y ácidos biliares secundarios y algunos de los metabolitos intermedios de los ácidos biliares pueden activar la PXR. Tras la activación del ligando, el PXR normalmente induce la transcripción génica mediante la unión a los elementos de respuesta xenobióticos en sus regiones promotoras o potenciadoras del gen diana. En el metabolismo de los ácidos biliares de fase I, PXR induce CYP3A4 y CYP2B genes (Staudinger et al., 2001). La hidroxilación de los ácidos biliares por CYP3A4 no solo desintoxica los ácidos biliares sino que también aumenta su conjugación y posterior excreción. Específicamente, CYP3A4 puede convertir CDCA en HCA y ácido 3α, 7α-dihidroxi-3-oxo-5β-colanoico y CA en 3-dehidro-CA. El CYP3A4 puede convertir el DCA altamente tóxico y cancerígeno en 3-dehidro-DCA y ácido 1β, 3α, 12α-trihidroxi-5β-colanoico y LCA en 3-dehidro-LCA, ácido hiodesoxicólico y 1β-hidroxi-LCA. En el metabolismo de los ácidos biliares de fase II y fase III, PXR induce las enzimas de conjugación de ácidos biliares, SULT2A1 y UGT, el transportador canalicular MRP2 y el transportador basolateral OATP2 (Kliewer & amp Willson, 2002). Estos genes diana de PXR se inducen en ratones tratados con LCA o sometidos a ligadura de los conductos biliares, mientras que estas respuestas adaptativas se vieron afectadas en pxr ratones knockout. PCN, un agonista de PXR de ratón, reprimió la expresión de ARNm de CYP7A1 hepático, la actividad enzimática y la secreción de ácidos biliares en roedores (Mason & amp Boyd, 1978 Stahlberg, 1995 Staudinger et al., 2001), lo que sugiere que PXR puede regular la síntesis de ácidos biliares. También se demostró que la PXR activada con rifampicina reprime CYP7A1 transcripción de genes (Bhalla, Ozalp, Fang, Xiang, & amp Kemper, 2004 Li & amp Chiang, 2005). PXR no se une directamente al CYP7A1 promotor de genes. En cambio, interactúa y reprime la actividad de transactivación de HNF4α que se une al CYP7A1 promotor de genes. Además, se demostró que la activación de PXR en el intestino induce la expresión de FGF15 o FGF19, y se identificó un elemento de respuesta de PXR en el promotor de la FGF19 (Wang, Venkatesh, et al., 2011 Wistuba, Gnewuch, Liebisch, Schmitz y amp Langmann, 2007). Los ratones que carecían de PXR eran más susceptibles a la hepatotoxicidad causada por el tratamiento con LCA o la ligadura de los conductos biliares (Staudinger et al., 2001 Stedman et al., 2005). Los estudios también han demostrado que la activación farmacológica de PXR protege contra la lesión hepática inducida por ácidos biliares en modelos experimentales de colestasis (Stedman et al., 2005). La rifampicina, el agonista de PXR humano, se ha utilizado para reducir el prurito asociado con la colestasis en humanos (Hofmann, 2002). La efectividad de la rifampicina en el tratamiento del prurito varió entre los individuos (Hofmann, 2002).


Se aisló un organismo anaeróbico obligado capaz de deshidroxilar ácido cólico en ácido desoxicólico y ácido alocólico en ácido alodesoxicólico de las heces del conejo. Era un miembro del grupo de los bacteroides (anaerobios Gram variables, no esporulantes). El crecimiento del organismo fue inhibido por neomicina, 10-20 μg / ml. La existencia de este organismo proporciona una explicación satisfactoria del desarrollo de cálculos biliares en el conejo alimentado con colestanol y de su ausencia en los conejos tratados simultáneamente con neomicina.

Usamos cookies para ayudar a proporcionar y mejorar nuestro servicio y personalizar el contenido y los anuncios. Al continuar, acepta las uso de cookies .


4. Conclusiones

En resumen, una serie de nuevos derivados de DCA 2& # x0201310, que contienen diamina alifática y aminoalcohol, así como restos de morfolina en la posición C3, se sintetizaron y probaron su citotoxicidad contra cuatro líneas celulares de cáncer humano, macrófagos murinos y fibroblastos humanos no malignos in vitro, así como su capacidad para suprimir la producción de NO por macrófagos. Demostramos que todos los sustituyentes que contienen amina introducidos aumentaron significativamente la citotoxicidad de los nuevos compuestos en comparación con la molécula original DCA y no impartieron actividad inhibidora contra la síntesis de NO mediada por macrófagos. Se demostró que los compuestos evaluados muestran una pronunciada selectividad de efecto antiproliferativo para las líneas celulares tumorales enterohepáticas HuTu-80 y HepG2, que aumentaron notablemente cuando los grupos amino terciarios en los restos laterales de los derivados (compuestos 2/5 y 3/6) fueron reemplazados por grupos hidroxilo (compuestos 8 y 9). Compuesto 9, que lleva un sustituyente aminopropanol en la posición C3, se identificó como un compuesto líder, que muestra el índice de selectividad más alto en la serie probada para las células HuTu-80 más susceptibles y buenos parámetros de similitud con el fármaco. Estudios mecanicistas de compuestos 9 en células HuTu-80 reveló que este derivado inducía la muerte celular dependiente de ROS mediante la activación de la apoptosis dependiente de caspasa intrínseca y la autofagia citodestructiva. Los resultados de las simulaciones de acoplamiento molecular mostraron que el VDR puede considerarse como un objetivo intracelular primario del compuesto. 9. Tomados en conjunto, nuestros hallazgos proporcionan algunas sugerencias nuevas para el diseño de nuevos agentes antitumorales basados ​​en el andamio de BA y una base para una mejor comprensión del mecanismo de acción de los derivados de BA.


Plomería

Robert C. Dysko,. Wesley D. Thompson, en Planificación y diseño de instalaciones para animales de investigación, 2009

D Sistemas de agua destilada / desionizada / de ósmosis inversa

Es posible que se requiera agua purificada en el procedimiento y los espacios de apoyo dentro de una instalación para animales. La primera decisión debe ser la calidad del agua que se requiere en toda la instalación. La calidad necesaria variará según los usos específicos del agua purificada.

Hay al menos cuatro estándares diferentes de calidad del agua en uso en la industria: el College of American Pathologists (CAP), la American Society for Testing and Materials (ASTM), el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente NCCLS) y el Farmacopea de los Estados Unidos (USP). Una vez que se selecciona un estándar, se debe determinar el tipo específico de calidad del agua. Por ejemplo, ASTM usa las designaciones Tipos I, II, III y IV para las diversas purezas del agua de grado reactivo. El tipo I es el agua de mayor calidad que se utiliza para aplicaciones críticas, como el análisis de oligoelementos y HPLC, y el tipo IV es el de menor calidad, utilizado para aplicaciones menos críticas como el enjuague de cristalería.

El agua purificada puede producirse mediante un sistema central y distribuirse a través del edificio, en el punto de uso o mediante una combinación de estos métodos. No es inusual tener un sistema central que produzca agua Tipo IV que se distribuya a todos los puntos de uso, y luego cada punto de uso individual tiene una unidad de pulido que da un grado de agua más alto (Tipo I, II o III) si es necesario.

Se puede combinar una variedad de diferentes combinaciones de equipos para producir agua purificada que cumpla con los diversos estándares de calidad. Algunas normas especifican específicamente qué proceso se puede utilizar para producir el agua. La necesidad de almacenar el agua depende del tamaño del sistema y de la cantidad de agua utilizada. Los sistemas pequeños pueden utilizar filtros de cartucho y no almacenarlos. Es posible que los sistemas más grandes necesiten usar filtros de medios más grandes y requieran almacenamiento. Como existe una amplia variedad de equipos actualmente disponibles relacionados con la purificación de agua, con tecnología en continuo avance, este capítulo abordará un sistema típico "promedio".

Un sistema típico de agua purificada presenta varias etapas diferentes de tratamiento. Por lo general, el agua doméstica se entrega a la entrada del sistema de tratamiento a 77 ° F y luego se pasa a través de un filtro multimedia para eliminar partículas y sustancias biológicas. La temperatura de 77 ° F se considera la temperatura ideal para la producción más eficaz de agua de ósmosis inversa (RO). Luego, el agua filtrada se pasa a través de un ablandador de agua para eliminar la dureza (minerales) del agua y a través de un filtro de 3 μm para capturar cualquier resina que pueda pasar del lecho del ablandador. Luego, se proporciona un medio para eliminar el cloro, como una inyección química o carbón activado, seguido de un filtro de 5 μm para capturar cualquier partícula adicional. Después de esto, el agua ingresa a la unidad de RO, que presuriza el agua y la fuerza a través de una membrana que evita que pasen las impurezas. Esta agua pura se dirige luego a un tanque de almacenamiento, que generalmente tiene el tamaño suficiente para contener agua por valor de 1 día & # x27s.

Desde el tanque de almacenamiento, el agua se extrae a través de bombas y se puede pasar a través de un pulido adicional con un sistema de desionización (DI) para producir agua de mayor calidad. La tecnología más nueva que se ha utilizado durante los últimos 10 años utiliza la electrodesionización, que electrifica el proceso de regeneración de la resina de intercambio. Luego, el agua se pasa a través de una luz ultravioleta (UV) para esterilizarla. Por lo general, se proporciona un filtro final de 0,2 μm para recolectar cualquier resina del proceso DI o material biológico degenerado del tratamiento UV. Luego, esta agua se distribuye a través de un sistema de tuberías hasta los puntos de uso.

El sistema de tuberías para el agua purificada se puede cerrar en el punto de uso terminal o recircular de regreso al tanque de almacenamiento. Un sistema sin salida puede permitir el crecimiento de bacterias dentro de la tubería debido al estancamiento del agua. Un sistema de recirculación mantiene el agua moviéndose entre 3 y 5 pies por segundo para crear una acción de fregado en la tubería para reducir el crecimiento bacteriano. Si se utiliza un sistema de recirculación, los puntos de uso de terminales que se ramifican de la tubería principal de recirculación deben mantenerse lo más cortos posible para evitar el estancamiento local.

Para estimar el volumen de agua purificada que el sistema debe producir diariamente, se puede usar una carga de 10 galones por día por salida del fregadero como una cifra para el uso general de agua. Para equipos especializados que utilizan agua purificada, la demanda debe investigarse en función de los requisitos específicos del equipo y la instalación. Para las tasas de flujo de diseño, las salidas de los sumideros deben estimarse en 1–2 galones por minuto (gpm) y las salidas de los equipos deben estimarse en 5 gpm, a menos que el equipo específico que se va a servir requiera una tasa de flujo más alta. El tamaño de la tubería para el sistema de agua purificada debe basarse en una velocidad promedio de 3-5 fps. La presión mínima de diseño en las salidas debe ser de 20 psi. Si se van a utilizar unidades de pulido en el punto de uso, se debe verificar que el flujo de suministro de agua y los requisitos de presión para el sistema primario satisfagan los requisitos para los sistemas de purificación secundarios.

Existe una amplia variedad de opciones para los materiales de las tuberías para la distribución de agua purificada, estos deben evaluarse en función de la aplicación específica. La calidad del agua, el método de saneamiento, las presiones operativas y las temperaturas operativas, así como la disponibilidad del mercado y la experiencia del contratista, deben evaluarse además del costo del material. Los materiales del sistema de tuberías que se han seleccionado para la distribución de agua purificada incluyen cloruro de polivinilo (PVC), cloruro de polivinilo clorado (CPVC), polipropileno natural o pigmentado (PP), fluoruro de polivinilideno (PVDF) y acero inoxidable 304 o 316. Las tuberías de PVC y CPVC se unen con juntas de enchufe cementadas con disolvente. Estos disolventes pueden contribuir con contaminantes extraíbles y las juntas pueden ser lugares para el desarrollo de biopelículas bacterianas. El PVC y el CPVC solo se pueden desinfectar químicamente, pero son los menos costosos y pueden ser los más adecuados para agua menos pura. El polipropileno es el material más utilizado y se puede unir mediante juntas de encaje de fusión por calor, juntas a tope de fusión por calor, juntas a tope de fusión por calor por infrarrojos o juntas por fusión por calor por infrarrojos sin hendiduras sin cordones. Esta última articulación es del tipo más suave, lo que resulta en la menor superficie para un posible crecimiento bacteriano. Sin embargo, el PP también debe esterilizarse químicamente. El PVDF tiene los mismos métodos de unión que el polipropileno, pero puede desinfectarse con calor y también químicamente.

El acero inoxidable se ha utilizado ampliamente en la industria de procesos, principalmente por su capacidad para desinfectarse con calor y su durabilidad frente al abuso. El acero inoxidable tiene una variedad de acabados de superficies interiores, desde el pulido mecánico de grano 180 más común hasta los pulidos tipo espejo de 20 Ra (rugosidad promedio) o menos. No existe un material que sea mejor para todas las aplicaciones, pero el polipropileno y el acero inoxidable son los más populares.

La necesidad de validación del sistema debe determinarse lo antes posible. La documentación del diseño y el mantenimiento de registros durante la fabricación deben incluirse en el proceso de construcción. Finalmente, los sistemas complejos de tratamiento de agua purificada también deben estar equipados con alarmas de mal funcionamiento para que el personal pueda ser alertado sobre problemas con la producción o el flujo.


Los componentes biliares y los aminoácidos afectan la supervivencia del juvenil recién excitado. Clonorchis sinensis en el mantenimiento de los medios

Clonorchis sinensis prospera con el jugo de bilis. Los efectos de la bilis y los ácidos biliares en juveniles recién excitados. C. sinensis (CsNEJ) se estudiaron en términos de supervivencia. La supervivencia de los CsNEJ mantenidos en 1 × solución de Locke, medio de Eagle modificado de Dulbecco, NCTC 109, Eagle, RPMI 1640 y glucosa al 0,1% fue alta, pero disminuyó rápidamente en 2 × Locke, NaCl al 0,85% y solución salina tamponada con fosfato. La mayoría de los aminoácidos en los medios favorecieron la supervivencia de CsNEJ, sin embargo, los ácidos aspártico y glutámico y la adenina redujeron la supervivencia. La supervivencia también fue significativamente menor en los medios que contenían más del 0,1% de bilis. Los CsNEJ preacondicionados en medios biliares bajos sobrevivieron más tiempo en medios biliares altos. Se encontró que todos los ácidos biliares y las sales biliares conjugadas favorecían la supervivencia de CsNEJ, excepto el ácido litocólico (LCA) que era tóxico. Se encontró que el medio NCTC 109 era óptimo para el mantenimiento in vitro de CsNEJ y la solución de 1 × Locke era adecuada para analizar los efectos biológicos de compuestos y moléculas bioactivos. Con base en estos resultados, proponemos que los ácidos biliares mejoran la actividad de los CsNEJ, pero el LCA deteriora los CsNEJ.

Esta es una vista previa del contenido de la suscripción, acceda a través de su institución.


Abstracto

El epitelio intestinal constituye una barrera innata que, tras la lesión, sufre procesos de autorreparación conocidos como restitución. Aunque los ácidos biliares se conocen como importantes reguladores de la función epitelial en la salud y la enfermedad, sus efectos sobre los procesos de cicatrización de heridas aún no están claros. Aquí nos propusimos investigar los efectos de los ácidos biliares colónicos, ácido desoxicólico (DCA) y ácido ursodesoxicólico (UDCA), sobre la restitución epitelial. Cicatrización de heridas en T84 Las monocapas de células cultivadas sobre soportes transparentes y permeables se evaluaron durante 48 h con o sin ácidos biliares. La migración celular se midió en cámaras de Boyden. La expresión de ARNm y proteínas se midió mediante RT-PCR y transferencia Western. DCA (50-150 µM) inhibió significativamente el cierre de heridas en monocapas de epitelio cultivado y atenuó la migración celular en los ensayos de cámara de Boyden. El DCA también indujo la acumulación nuclear del receptor farnesoide X (FXR), mientras que un agonista de FXR, GW4064 (10 µM), inhibió el cierre de la herida. Tanto DCA como GW4064 atenuaron la expresión de los canales de Cl - CFTR, mientras que la inhibición de la actividad CFTR con CFTR-inh-172 (10 µM) o GlyH-101 (25 µM) también impidieron la cicatrización de heridas. Los ensayos de promotor / informador revelaron que la regulación a la baja de CFTR inducida por FXR está mediada a nivel transcripcional. Por el contrario, el UDCA (50-150 µM) mejoró la cicatrización de heridas in vitro y previno los efectos del DCA. Finalmente, el DCA inhibió y el UDCA promovió la curación de la mucosa en un modelo de ratón in vivo. En conclusión, estos estudios sugieren que los ácidos biliares son reguladores importantes de la cicatrización de heridas epiteliales y, por lo tanto, son buenos objetivos para el desarrollo de nuevos fármacos para modular la función de barrera intestinal en el tratamiento de enfermedades.

NUEVO Y DESTACADO El ácido biliar secundario, ácido desoxicólico, inhibe la cicatrización de heridas epiteliales colónicas, un efecto que parece estar mediado por la activación del receptor nuclear de ácidos biliares, FXR, con la subsecuente regulación a la baja de la expresión y actividad de CFTR. Por el contrario, el ácido ursodesoxicólico promueve la cicatrización de heridas, lo que sugiere que puede proporcionar un enfoque alternativo para prevenir las pérdidas de la función de barrera que se asocian con la inflamación de la mucosa en pacientes con EII.


Últimas patentes de ALLERGAN SALES, LLC:

Esta solicitud es una continuación de la solicitud de patente de EE. UU. Ser. No. 15 / 650,556, presentada el 14 de julio de 2017, que es una continuación de la solicitud de patente de EE. UU. Ser. 14 / 175.086, presentada el 7 de febrero de 2014, que es una continuación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 13 / 733.729, presentada el 3 de enero de 2013, ahora Patente de EE.UU. Nº 9.186.364, que es una continuación de la solicitud de patente de EE.UU. No. 13 / 323.605, presentada el 12 de diciembre de 2011, ahora Patente de EE.UU. Nº 8.367.649, que es una continuación de la solicitud de patente de EE.UU. Nº 12 / 716.070, presentada el 2 de marzo de 2010, ahora patente de EE.UU. No. 8,101,593, que reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119 (e) de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 61 / 274,129, que se convirtió de la Solicitud de Patente de EE. UU. Ser. No. 12 / 397.229, presentada el 3 de marzo de 2009, todas las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas de ácido en agua en las que la formulación se mantiene a un pH tal que se inhibe sustancialmente la precipitación de desoxicolato de sodio.

La eliminación rápida de la grasa corporal es un ideal antiguo, y se ha afirmado que muchas sustancias logran tales resultados, aunque pocas han mostrado resultados. La “mesoterapia”, o el uso de inyectables para eliminar la grasa, no es ampliamente aceptado entre los médicos debido a preocupaciones de seguridad y eficacia, aunque se han hecho afirmaciones homeopáticas y cosméticas desde la década de 1950. La mesoterapia se concibió originalmente en Europa como un método de utilizar inyecciones cutáneas que contienen una mezcla de compuestos para el tratamiento de afecciones médicas y cosméticas locales. Aunque la mesoterapia se empleó tradicionalmente para aliviar el dolor, sus aplicaciones cosméticas, en particular la eliminación de grasa y celulitis, han recibido atención recientemente en los Estados Unidos. Uno de estos tratamientos reportados para la reducción de grasa localizada, que se popularizó en Brasil y usa inyecciones de fosfatidilcolina, ha sido erróneamente considerado sinónimo de mesoterapia. A pesar de su atractivo como una supuesta inyección para "disolver la grasa", la seguridad y eficacia de estos tratamientos cosméticos siguen siendo ambiguas para la mayoría de los pacientes y médicos (ver, Rotunda, AM y M. Kolodney, Cirugía dermatológica "Mesoterapia e inyecciones de fosfatidilcolina: aclaración histórica y Review ”, 2006, 32: 465-480).

La literatura publicada recientemente informa que el ácido desoxicólico de ácido biliar tiene propiedades de eliminación de grasa cuando se inyecta en depósitos grasos in vivo (ver WO 2005/117900 y WO 2005/112942, US2005 / 0261258 US2005 / 0267080 US2006 / 127468 y US2006 / 0154906). El desoxicolato inyectado en el tejido graso tiene los efectos de: 1) degradar las células grasas a través de un mecanismo citolítico y 2) causar tensión en la piel. Ambos efectos son necesarios para mediar en las correcciones estéticas deseadas (es decir, el contorno del cuerpo). Los efectos del desoxicolato en la grasa están contenidos espacialmente porque el desoxicolato inyectado en la grasa se inactiva rápidamente por exposición a proteínas, p. Ej. albúmina, y luego regresa rápidamente al contenido intestinal. Como resultado de este efecto de atenuación que confiere seguridad clínica, las terapias de eliminación de grasa generalmente requieren de 4 a 6 sesiones. Esta eliminación de grasa localizada sin necesidad de cirugía es beneficiosa no solo para el tratamiento terapéutico relacionado con los depósitos de grasa localizados patológicos (p. Ej., Dislipidemias relacionadas con la intervención médica en el tratamiento del VIH), sino también para la eliminación de grasa cosmética sin el riesgo asociado inherente a la cirugía. (p. ej., liposucción) (ver, Rotunda et al., Dermatol. Cirugía "Los efectos detergentes del desoxicolato de sodio son una característica principal de una formulación de fosfatidilcolina inyectable utilizada para la disolución de grasa localizada", 2004, 30: 1001-1008 y Rotunda et al. , J. Am. Acad. Dermatol. “Lipomas tratados con inyecciones subcutáneas de desoxicolato”, 2005: 973-978).

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia en la misma medida que si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específica e individualmente para incorporarse como referencia.

Se ha encontrado que las soluciones acuosas de desoxicolato de sodio a concentraciones bajas (es decir, & lt5% p / v) de desoxicolato de sodio se pueden estabilizar ajustando el pH de la solución. La presente invención está dirigida a una formulación farmacéutica acuosa que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio en la que la formulación se mantiene a un pH suficiente para inhibir sustancialmente la precipitación del desoxicolato de sodio.

También se describen en el presente documento métodos para inhibir la precipitación de desoxicolato de sodio en una solución acuosa que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio, comprendiendo dicho método mantener el pH de la solución de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIGS. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F muestran la variabilidad en el pH durante un período de dos semanas de formulaciones que contienen 5, 50, 100 y 160 mg / mL (0.5, 5, 10 y 16% p / v) de desoxicolato de sodio a 4ºC (Figuras 1A, 1B y 1C) y 25ºC (Figuras 1D, 1E y 1F).

FIGS. 2A, 2B, 2C y 2D muestran que la solubilidad es independiente de la variabilidad del pH de un lote a otro. HIGO. 2A es una comparación de las muestras de 5 mg (0,5% p / v) ensayadas en las Figs. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F. HIGO. 2B es una comparación de las muestras de 50 mg (5% p / v) ensayadas en las Figs. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F. HIGO. 2C es una comparación de las muestras de 100 mg (10% p / v) ensayadas en las Figs. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F. HIGO. 2D es una comparación de las muestras de 160 mg (16% p / v) analizadas en las Figs. 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F.

HIGO. 3 muestra un cromatograma de HPLC de fase inversa para una formulación acuosa de desoxicolato de sodio de 20 mg / ml (2% p / v) (NaCl al 0,9% y alcohol bencílico al 0,9% en tampón fosfato 10 mM a un pH de 8,0) después de incubarse durante 2 meses a 4 ° C.

HIGO. 4 muestra el efecto de la temperatura (4ºC, 25ºC y 37ºC) sobre la pureza de diversas formulaciones de desoxicolato de sodio durante un período de dos meses.

HIGO. 5 muestra el efecto de la agitación sobre la pureza de diversas formulaciones de desoxicolato de sodio durante un período de cuatro horas.

HIGO. 6 muestra el efecto de la exposición a los rayos UV sobre la pureza de diversas formulaciones de desoxicolato de sodio durante un período de 24 horas.

HIGO. 7 muestra el efecto de cinco ciclos de congelación-descongelación sobre la pureza de diversas formulaciones de desoxicolato de sodio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Como se usa en este documento, ciertos términos tienen los siguientes significados definidos.

Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluidos los rangos, son aproximaciones que se varían (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que todas las designaciones numéricas están precedidas por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" también incluye el valor exacto "X" además de incrementos menores de "X" como "X + 0.1" o "X − 0.1". También debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que se conocen equivalentes de los mismos en la técnica.

Como se usa en este documento, el término "que comprende" pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero no excluyen otros. Cuando se usa para definir composiciones y métodos, “que consiste esencialmente en” significa excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación cuando se usa para el propósito previsto. Por tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos en el presente documento no excluiría trazas de contaminantes del método de aislamiento y purificación y vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes y similares. “Que consta de” significará excluir más que oligoelementos de otros ingredientes y pasos sustanciales del método para administrar las composiciones de esta invención. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.

Como se usa en este documento, el término "desoxicolato de sodio" se refiere a (4R) -4 - ((3R, 5R, 10S, 12S, 13R, 17R) -3,12-dihidroxi-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta [ a] fenantren-17-il) pentanoato como se muestra a continuación. Otros estereoisómeros están dentro del alcance de la invención.

Desoxicolato de sodio o (4R) -4 - ((3R, 5R, 10S, 12S, 13R, 17R) -3,12-dihidroxi-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta [a] fenantren-17-il) pentanoato de sodio puede prepararse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de EE.UU. nº 2008 / 0318870A1 titulada “Composición, método y preparación de ácidos biliares sintéticos” presentada el 21 de febrero de 2008, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Como se usa en este documento, el término "formulación farmacéutica acuosa" se refiere a una formulación de desoxicolato de sodio en agua adecuada para la administración a un paciente.

Como se usa en este documento, el término "tampón" se refiere a una solución acuosa que comprende una mezcla de un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado. Un tampón tiene la propiedad de que el pH de la solución cambia muy poco cuando se le agrega una pequeña cantidad de ácido o base. Las soluciones tampón se utilizan como un medio para mantener el pH a un valor casi constante en una amplia variedad de aplicaciones químicas. Los ejemplos de tampones adecuados incluyen tampones de fosfato y los conocidos en la bibliografía (véase, por ejemplo, Troy, D. B., ed. (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª ed., Lippincott Williams & amp Wilkins).

Como se usa en este documento, el término "base" se refiere a varios compuestos, moléculas o iones típicamente solubles en agua que en solución tienen un pH superior a 7. Dichos compuestos, moléculas o iones pueden absorber un protón de un ácido o pueden ceder un par de electrones no compartidos a un ácido. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen carbonatos y bicarbonatos metálicos, por ejemplo carbonato de sodio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, carbonato de zinc, bicarbonato de sodio y similares e hidróxidos metálicos, por ejemplo hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y similares, tales como los conocidos en la literatura (véase, por ejemplo, Troy, DB, ed. (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª ed., Lippincott Williams & amp Wilkins).

Como se usa en este documento, el término "carbonatos metálicos" se refiere a la sal metálica de CO3 2−. Por ejemplo, carbonato de sodio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, carbonato de zinc y similares.

Como se usa en este documento, el término "bicarbonatos metálicos" se refiere a la sal metálica de HCO3 -. Por ejemplo, bicarbonato de sodio y similares.

Como se usa en este documento, el término "hidróxidos metálicos" se refiere a la sal metálica de -OH. Por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y similares.

Como se usa en este documento, los términos "agua estéril" o "agua para inyección" se refieren a una preparación estéril, apirógena de agua para inyección que no contiene bacteriostático, agente antimicrobiano o tampón añadido. En general, la concentración osmolar de aditivos totaliza al menos 112 mOsmol / litro (dos quintos de la osmolaridad normal del líquido extracelular -280 mOsmol / litro).

Como se usa en este documento, el término "alcohol bencílico" se refiere al compuesto

Como se usa en este documento, el término "precipitación" se refiere a la formación de un sólido en una solución. Como se usa en este documento, el término "solución" se refiere a una mezcla sustancialmente homogénea que comprende dos o más sustancias disueltas en un disolvente.

Como se usa en este documento, el término "inhibir sustancialmente la precipitación" significa inhibir la mayor parte o la totalidad de la precipitación visible o mantener la homogeneidad. Esto se puede hacer durante un período de tiempo deseado.

Como se usa en este documento, el término "desviación estándar relativa para homogeneidad" o "Hmi”Se refiere al valor obtenido al dividir la desviación estándar de la homogeneidad por el valor absoluto de la media. Una Hmi menos de 10 indica muy buena homogeneidad.

Formulaciones

Es valioso el conocimiento sobre la estabilidad química y física de la formulación de un fármaco en el medio de administración deseado. A más largo plazo, la estabilidad de la formulación dictará la vida útil del producto comercializado. Es preferible que el ingrediente activo en una formulación farmacéutica esté en la concentración requerida cuando se administra a un paciente.

Los métodos actuales para la administración de desoxicolato de sodio a un paciente incluyen la administración de una concentración baja (es decir, & lt5% p / v) de una solución acuosa de desoxicolato de sodio, ya que se ha demostrado que la concentración baja es beneficiosa para la eficacia y Eliminación segura de depósitos de grasa en el cuerpo. Sin embargo, se ha observado que se forma un precipitado a concentraciones relativamente bajas (es decir, & lt5% p / v) y altas (es decir, & gt16% p / v) de desoxicolato de sodio en medios acuosos. Esta precipitación da como resultado una vida útil limitada de las soluciones acuosas de desoxicolato de sodio, incluso a temperaturas frías (3-5ºC). Esta inestabilidad de las soluciones acuosas de desoxicolato de sodio puede evitarse mediante la preparación de una solución acuosa de desoxicolato de sodio a una concentración de aproximadamente 5% a aproximadamente 16% p / v, y haciendo que el médico diluya la composición farmacéutica de desoxicolato de sodio justo antes de usar. Si bien este método de dilución es eficaz para permitir tanto la estabilidad durante el almacenamiento como la dosificación eficaz para el paciente, no es ideal como método de uso rutinario.

Se ha encontrado que las soluciones acuosas de desoxicolato de sodio a concentraciones bajas (es decir, & lt5% p / v) de desoxicolato de sodio se pueden estabilizar ajustando el pH de la solución. La presente solicitud está dirigida a una formulación farmacéutica acuosa que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio en la que la formulación se mantiene a un pH suficiente para inhibir sustancialmente la precipitación del desoxicolato de sodio. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica, que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio en agua, o alternativamente, menos de aproximadamente 4,5%, o alternativamente, menos de aproximadamente 4%, o alternativamente, menos de aproximadamente 3,5%, o alternativamente, menos de aproximadamente 3%, o alternativamente, menos de aproximadamente 2,5%, o alternativamente, menos de aproximadamente 2%, o alternativamente, menos de aproximadamente 1,5%, o alternativamente, menos de aproximadamente 1%, o alternativamente, menos de aproximadamente 0,75%, o alternativamente, menos de aproximadamente 0,5%, o alternativamente, menos de aproximadamente 0,1% p / v de desoxicolato de sodio en agua.

Desoxicolato de sodio o (4R) -4 - ((3R, 5R, 10S, 12S, 13R, 17R) -3,12-dihidroxi-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta [a] fenantren-17-il) pentanoato de sodio puede prepararse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de EE.UU. nº 2008 / 0318870A1 titulada “Composición, método y preparación de ácidos biliares sintéticos” presentada el 21 de febrero de 2008, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En una realización, las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento son adecuadas para inyectarse en un ser humano. El método de inyección puede ser cualquier tipo de inyección, como inyección subcutánea, así como otras formas de inyección. Por tanto, en algunas realizaciones, la formulación acuosa es estéril. La formulación acuosa se puede preparar usando agua estéril o agua para inyección (WFI).

En un aspecto de la presente invención, la precipitación de desoxicolato de sodio se inhibe sustancialmente durante un período de al menos aproximadamente seis meses. En otro aspecto, la precipitación de desoxicolato de sodio se inhibe sustancialmente durante un período de al menos aproximadamente un año. En otro aspecto más, la precipitación de desoxicolato de sodio se inhibe sustancialmente durante un período de al menos aproximadamente dos años.

Se contempla que cuando se almacena a diversas temperaturas, por ejemplo a temperatura ambiente o fría, la formulación puede tener una vida útil aumentada. En ciertas realizaciones, la formulación se almacena a una temperatura de aproximadamente 17 ° C a aproximadamente 27 ° C.En algunas realizaciones, la temperatura de la formulación se aumenta a una temperatura de aproximadamente 25 ° C a aproximadamente 37 ° C. En otras realizaciones, la formulación se almacena a una temperatura de aproximadamente 2 ° C a aproximadamente 8 ° C.

En determinadas realizaciones, el pH de la formulación varía de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5. En una realización, el pH de la formulación es aproximadamente 8,0, o alternativamente, aproximadamente 8,1, o alternativamente, aproximadamente 8,2, o alternativamente, aproximadamente 8,3, o alternativamente, aproximadamente 8,4, o alternativamente, aproximadamente 8,5.

En una realización, el pH se establece mediante el uso de una base. Se contempla que se puede usar cualquier base para aumentar el pH de la formulación siempre que no reaccione con el desoxicolato de sodio y no cause daño al paciente. En algunas realizaciones, la base se selecciona del grupo que consiste en carbonatos metálicos, bicarbonatos metálicos, hidróxidos metálicos o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de bases incluyen, pero no se limitan a, una base seleccionada del grupo que consiste en carbonato de sodio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, carbonato de zinc, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio o una mezcla de los mismos. En una realización, la base es hidróxido de sodio.

En ciertos casos, el pH de la formulación se puede mantener con el uso de un tampón. Se conocen varios tampones en la técnica y se contempla que cualquier tampón que tenga capacidad tamponadora al pH deseado puede usarse en las formulaciones descritas en este documento. En una realización, el tampón es un tampón de fosfato. La cantidad de fosfato en la formulación se puede determinar para proporcionar un pH y una concentración de sal deseados. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 10 mM de fosfato.

En algunas realizaciones, la formulación comprende al menos un excipiente para ayudar a lograr una formulación con las propiedades deseadas, tales como mayor solubilidad, conservabilidad o para proporcionar una solución isotónica. Dichos excipientes son conocidos en la técnica. En una realización, la formulación comprende aproximadamente un 1% de cloruro de sodio. En otra realización, la formulación comprende aproximadamente un 1% de alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la formulación comprende aproximadamente un 1% de alcohol bencílico y aproximadamente un 1% de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, la formulación comprende aproximadamente 0,9% de alcohol bencílico y aproximadamente 0,9% de cloruro de sodio.

Las formulaciones descritas en el presente documento comprenden menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio en agua mantenida a un pH suficiente para inhibir sustancialmente la precipitación del desoxicolato de sodio. La cantidad de precipitación u homogeneidad de la formulación se puede medir usando varios métodos. Por ejemplo, se puede medir cuantitativamente usando dispersión de luz iluminando la formulación con un espectrofotómetro. O alternativamente, la homogeneidad se puede medir cualitativamente observando la claridad visual de la solución con el ojo. En algunas realizaciones, la formulación tiene una desviación estándar relativa para la homogeneidad de menos de aproximadamente el 5%. Alternativamente, la formulación tiene una desviación estándar relativa para la homogeneidad de menos de aproximadamente el 4%, o alternativamente, aproximadamente el 3%, o alternativamente, aproximadamente el 2%, o alternativamente, aproximadamente el 1%.

También se contempla el uso de profármacos de desoxicolato de sodio en las formulaciones descritas en el presente documento. Un profármaco es un compuesto activo o inactivo que se modifica químicamente mediante acción fisiológica in vivo, tal como hidrólisis, metabolismo y similares, en un compuesto de las realizaciones después de la administración del profármaco a un paciente. Por ejemplo, se puede preparar un éster del presente ácido desoxicólico en uno o ambos grupos hidroxilo del mismo o en derivados adecuados del mismo, de modo que la liberación del ácido desoxicólico o derivados del mismo se desencadena por la ruptura de la membrana celular, y liberación de esterasa. Con la liberación de esterasa, el grupo protector de éster se escinde de modo que la forma activa de ácido desoxicólico o sus derivados estén presentes en el lugar deseado in situ. Para una discusión general de profármacos que implican ésteres, véase Svensson y Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) y Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985).

En algunas realizaciones, las soluciones de la presente no incluyen lípidos, fosfolípidos o fosfatidilcolina. En algunas realizaciones, las soluciones de la presente incluyen hasta un 5% p / p, p / vo v / v de lípidos, específicamente fosfolípidos, o más específicamente fosfatidilcolina.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica acuosa de la invención puede comprender además un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: agentes antimicrobianos, vasoconstrictores, agentes antitrombóticos, agentes anticoagulantes, depresores de espuma, agentes antiinflamatorios. , analgésicos, agentes dispersantes, agentes antidispersión, potenciadores de la penetración, esteroides, tranquilizantes, relajantes musculares y agentes antidiarreicos. En algunas realizaciones, hay una solución en un recipiente que contiene hasta 500 ml de solución. Dicho recipiente puede ser una jeringa o un recipiente que se puede cargar con una jeringa.

En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden además una molécula que se sabe que hace que la grasa muera mediante un mecanismo ortogonal. Dichas moléculas incluyen antagonistas del neuropéptido Y (NPY) que incluyen, entre otros, antagonistas del receptor NPY, como BIBP-3226 (Amgen), MO-3304 (Boehringer Ingleheim), BMS-192548 y AR-H040922 (Bristol-Myers Squibb). , LY-357897 (Eli Lilly), 1229U91 y GW4380145 (GlaxoSmithKline), JNJ-5207787 (Johnson & amp Johnson), Lu-AA-44608 (Lundbeck), MK-0557 (Merck NPY), NGD-95-1 (Neurgogen) , NLX-E201 (Neurologix), CGP-71683 (Novartis), PD-160170 (Pfizer), SR-120819A, BIIE0246 y SA0204 (Sanofi Aventis), S-2367 (Shiongli), dihidropiridina y derivados de dihidropiridina que son NPY antagonistas del receptor, compuestos bicíclicos que son antagonistas del receptor NPY, antagonistas del receptor NPY de carbazol y compuestos tricíclicos que son antagonistas del receptor NPY (véanse, por ejemplo, el documento WO 2006/133160 y la patente estadounidense nº 6.313.128). También se contemplan péptidos proapoptóticos selectivos de grasas tales como el péptido CKGGRAKDC que se aloja en la vasculatura de grasa blanca (véase, Kolonin M. G. et al., Nat. Med., 2004, 10 (6): 625-32).

Otro aspecto de la invención se refiere a la mezcla de ácidos biliares adipo-ablativos, tales como ácido desoxicólico (DCA) con agentes que matan las células grasas. En un aspecto, esta invención contempla un medio para mejorar los efectos estéticos de las inyecciones de desoxicolato mezclando en el desoxicolato inyectado una molécula que hace que la grasa muera por un mecanismo ortogonal. Los ejemplos de tales moléculas candidatas incluyen, pero no se limitan a, antagonistas del neuropéptido Y (NPY) y péptidos proapoptóticos selectivos de grasas. Dado que es posible que se requiera tanto la eliminación de las células grasas como el estiramiento de la piel para mediar los efectos deseados, los efectos de un agente con capacidad para eliminar las grasas y potentes efectos de estiramiento de la piel (como el desoxicolato) se pueden mejorar mediante la adición de una molécula con una potente destrucción de las células grasas. efectos. Además, las moléculas que requieren acceso a la vasculatura para matar (como ciertos péptidos proapoptóticos que se unen a proteínas expresadas en el lado luminal de los capilares) pueden obtener acceso a estas proteínas porque el desoxicolato puede causar fugas vasculares. Por tanto, dichos agentes pueden ser sinérgicos con el desoxicolato, creando potencialmente un medio más potente para mediar en el contorno corporal en menos sesiones terapéuticas.

Los ejemplos de antagonistas de NPY incluyen, entre otros, antagonistas del receptor de NPY, como BIBP-3226 (Amgen), BIBO-3304 (Boehringer Ingleheim), BMS-192548 y AR-H040922 (Bristol-Myers Squibb), LY-357897 (Eli Lilly), 1229U91 y GW4380145 (GlaxoSmithKline), JNJ-5207787 (Johnson & amp Johnson), Lu-AA-44608 (Lundbeck), MK-0557 (Merck NPY), NGD-95-1 (Neurgogen), NLX-E201 (Neurologix), CGP-71683 (Novartis), PD-160170 (Pfizer), SR-120819A, BIIE0246 y SA0204 (Sanofi Aventis), S-2367 (Shiongli), dihidropiridina y derivados de dihidropiridina que son antagonistas del receptor NPY, bicíclicos compuestos que son antagonistas del receptor NPY, antagonistas del receptor NPY de carbazol y compuestos tricíclicos que son antagonistas del receptor NPY. Véanse, por ejemplo, WO 2006/133160 y la patente de EE.UU. Nº 6.313.128 (incorporada aquí como referencia en su totalidad, incluidas las figuras).

Los péptidos proapoptóticos selectivos de grasas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, péptido CKGGRAKDC que se aloja en la vasculatura de grasa blanca. Véase, Kolonin M. G. y col., Nat. Medicina. 10 de junio (6): 625-32 (2004).

Desoxicolato de sodio o (4R) -4 - ((3R, 5R, 10S, 12S, 13R, 17R) -3,12-dihidroxi-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta [a] fenantren-17-il) pentanoato de sodio puede prepararse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de EE.UU. nº 2008 / 0318870A1 titulada “Composición, método y preparación de ácidos biliares sintéticos” presentada el 21 de febrero de 2008, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Se apreciará que cuando se dan las condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones de proceso a menos que se indique lo contrario. Las condiciones óptimas de reacción pueden variar con los reactivos o solventes particulares usados, pero tales condiciones pueden ser determinadas por un experto en la técnica mediante procedimientos de optimización rutinarios.

En el presente documento se describe un método para inhibir la precipitación de desoxicolato de sodio en una solución acuosa que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio, comprendiendo dicho método mantener el pH de la solución de al menos aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5.

En un aspecto de la presente invención, los métodos descritos en el presente documento inhiben sustancialmente la precipitación de desoxicolato de sodio en solución durante un período de al menos aproximadamente seis meses. En otro aspecto, la precipitación de desoxicolato de sodio se inhibe sustancialmente durante un período de al menos aproximadamente un año. En otro aspecto más, la precipitación de desoxicolato de sodio se inhibe sustancialmente durante un período de al menos aproximadamente dos años.

Se ha encontrado que el pH de la solución puede inhibir la precipitación de desoxicolato de sodio a concentraciones de menos de aproximadamente 5% p / v en agua, lo que permite que el desoxicolato de sodio se mantenga en solución. En una realización, el pH se establece mediante el uso de una base. Se contempla que se puede usar cualquier base para aumentar el pH de la formulación siempre que no reaccione con el desoxicolato de sodio. En algunas realizaciones, la base se selecciona del grupo que consiste en carbonatos metálicos, bicarbonatos metálicos e hidróxidos metálicos, o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de bases incluyen, pero no se limitan a, una base seleccionada del grupo que consiste en carbonato de sodio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, carbonato de zinc, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio o una mezcla de los mismos. En una realización, la base es hidróxido de sodio.

En determinadas realizaciones, el pH varía de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5. En una realización, el pH de la formulación es aproximadamente 8,0, o alternativamente, aproximadamente 8,1, o alternativamente, aproximadamente 8,2, o alternativamente, aproximadamente 8,3, o alternativamente, aproximadamente 8,4, o alternativamente, aproximadamente 8,5. En una realización, el pH de la solución acuosa es de aproximadamente 8,3.

En ciertos casos, puede ser necesario mantener el pH de la formulación con el uso de un tampón. Se conocen varios tampones en la técnica y se contempla que cualquier tampón que tenga capacidad tamponadora al pH deseado puede usarse en las formulaciones descritas en este documento. En una realización, el tampón es un tampón de fosfato. La cantidad de fosfato requerida para proporcionar un pH y una concentración de sal deseados se puede calcular usando métodos bien conocidos en la técnica. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 10 mM de fosfato.

En una realización, los métodos descritos en este documento proporcionan formulaciones que son adecuadas para inyectarse en un ser humano. El método de inyección puede ser cualquier tipo de inyección, como inyección subcutánea, así como otras formas de inyección. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la solución acuosa comprende agua estéril o agua para inyección (WFI).

En un aspecto, puede ser que se utilicen uno o más excipientes para mantener la solubilidad o aumentar la conservabilidad del desoxicolato de sodio presente en la formulación. En una realización, el método comprende añadir aproximadamente un 1% de alcohol bencílico. En algunas realizaciones, la formulación también comprende al menos un excipiente para ayudar a lograr una solución isotónica. Dichos excipientes son conocidos en la técnica. En una realización, el método comprende añadir aproximadamente un 1% de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el método comprende añadir alcohol bencílico al 1% y cloruro sódico al 1%. En algunas realizaciones, el método comprende añadir tanto alcohol bencílico al 0,9% como cloruro sódico al 0,9%. Usando los métodos descritos en este documento, una solución acuosa que comprende menos de aproximadamente 5% p / v de desoxicolato de sodio se mantiene a un pH suficiente para inhibir sustancialmente la precipitación del desoxicolato de sodio. La cantidad de precipitación u homogeneidad de la formulación se puede medir usando varios métodos. Por ejemplo, se puede medir cuantitativamente midiendo la dispersión de la luz mediante la iluminación de un espectrofotómetro. O alternativamente, la homogeneidad se puede medir cualitativamente simplemente observando la claridad visual de la solución con el ojo. En algunas realizaciones, el método proporciona una formulación farmacéutica que tiene una desviación estándar relativa para la homogeneidad de menos de aproximadamente el 5%. Alternativamente, la desviación estándar relativa para la homogeneidad de menos de aproximadamente el 4%, o alternativamente, aproximadamente el 3%, o alternativamente, aproximadamente el 2%, o alternativamente, aproximadamente el 1%.

La temperatura de almacenamiento puede ayudar a mantener la solubilidad del desoxicolato de sodio de la formulación. En ciertas realizaciones, la temperatura de almacenamiento es de aproximadamente 17 ° C a aproximadamente 27 ° C.En algunas realizaciones, la temperatura de almacenamiento es de aproximadamente 25 ° C a aproximadamente 37 ° C.En otras realizaciones, la temperatura de almacenamiento es de aproximadamente 2ºC. ° C a aproximadamente 8 ° C.

Se contempla que la concentración de desoxicolato de sodio puede variar desde aproximadamente 0,05% p / va aproximadamente 5% p / v sin afectar la solubilidad en la formulación. En determinadas realizaciones, la formulación comprende una concentración de desoxicolato de sodio de aproximadamente 0,05% p / v. Alternativamente, la formulación comprende una concentración de desoxicolato de sodio de aproximadamente 0,07% p / v, o alternativamente, aproximadamente 0,1% p / v, o alternativamente, aproximadamente 0,3% p / v, o alternativamente, aproximadamente 0,5% p / v, o alternativamente, aproximadamente 0,7% p / v, o alternativamente, aproximadamente 1% p / v, o alternativamente, aproximadamente 2% p / v, o alternativamente, aproximadamente 3% p / v, o alternativamente, aproximadamente 4% p / v, o alternativamente, aproximadamente 5% p / v.

    • A500= Absorbancia a 500 nanómetros
    • cc = Centímetro cúbico
    • Cm = centímetro
    • F / T = congelar / descongelar
    • HPLC = cromatografía líquida de alta resolución
    • hr. = Hora
    • mg = miligramo
    • mL = mililitro
    • mm = Milímetro
    • mM = milimolar
    • nm = nanómetro
    • t = tiempo
    • UV = ultravioleta
    • v / v = Volumen / Volumen
    • w / v = Peso / Volumen (g / mL)
    • w / w = Peso / Peso
    • WFI = agua para inyección

    La invención se comprende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que se pretende que sean puramente ejemplares de la invención. El alcance de la presente invención no está limitado por las realizaciones ejemplificadas, que están destinadas a ilustrar aspectos individuales de la invención únicamente. Cualquier método que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la invención. Varias modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Aunque se describen aquí en detalle varias realizaciones de la invención, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer variaciones sin apartarse del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Tales modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

    Ejemplo 1 Cambios en el pH y las observaciones visuales

    Este ejemplo demuestra que las formulaciones acuosas que contienen menos del 5% p / v de desoxicolato de sodio forman un precipitado a diversas temperaturas que no se puede volver a disolver. La solubilidad fue mejor en formulaciones acuosas que contenían 5% p / v.

    Se examinó la estabilidad de tres lotes de desoxicolato de sodio disuelto en alcohol bencílico al 0,9% y agua para inyección (WFI) en busca de cambios en el pH y observaciones visuales, como la formación de precipitado. Cada lote se formuló en cuatro concentraciones: 5, 50, 100 y 160 mg / ml (0,5, 5, 10 y 16% p / v, respectivamente) disueltos en alcohol bencílico al 0,9% y WFI. La Tabla 1 proporciona un resumen de las variables que se probaron en este ejemplo.

    Las soluciones se prepararon como sigue. Se llenaron dos muestras para cada condición a 2,0 ml en 3 c.c. estériles. viales de vidrio (West Pharma P / N 68000316) y taponados con tapones de suero estériles de 13 mm (West Pharma P / N 19560001). Estas muestras se analizaron por duplicado en cada momento para verificar cualquier cambio en el pH y las observaciones visuales, durante el almacenamiento a 2-8ºC y 25ºC durante dos semanas. La Tabla 2 resume las condiciones y los momentos en los que se analizaron las muestras a lo largo del estudio.

    Como se ve en las Tablas 3 y 4, a 5 mg / mL (0.5% p / v), se observaron partículas finas generalmente en todos los lotes y tanto a 4 ° C como a 25 ° C, aunque la Muestra 1 a 4 ° C. no precipitó. A 50 mg / mL (5% p / v), todas las muestras y condiciones fueron claras. A 100 mg / ml (10% p / v), hubo un efecto de temperatura ya que todos los lotes a 4ºC precipitaron mientras que los lotes a 25ºC permanecieron transparentes. A 160 mg / ml (16% p / v), hubo un efecto de temperatura ya que todos los lotes a 4ºC precipitaron mientras que los lotes a 25ºC permanecieron transparentes. La precipitación observada a 160 mg / mL (16% p / v) fue más severa y rápida que 100 mg / mL, sin embargo, el producto precipitado en estas dos concentraciones pudo resolubilizarse después de calentar a temperatura ambiente y agitar con vórtex. El material precipitado a 5 mg / ml (0,5% p / v) no pudo volver a disolverse. Estos datos se muestran gráficamente en las Figs. 1A a 1F.

    Los perfiles de pH tanto para 4ºC como para 25ºC se superpusieron, por lo que parece que la temperatura no tuvo un impacto a concentraciones menores de 50 mg / mL (5% p / v). En cambio, parece haber un pH de solubilidad para formulaciones de menos de 50 mg / ml (5% p / v). A 100 y 160 mg / mL, las muestras a 4ºC tenían un pH más alto que las muestras a 25ºC. Sin embargo, al aumentar la concentración, la temperatura parece ser más importante que el pH y la formulación es cada vez más sensible a la temperatura.

    La Tabla 5 muestra que la solubilidad del desoxicolato de sodio es independiente de la variabilidad del pH de un lote a otro. En general, no hubo diferencia en la estabilidad física entre lotes en condiciones similares.

    Se han identificado tres factores que contribuyen a la solubilidad. Sin ningún orden en particular, estos son concentración, pH y temperatura. Se ha encontrado que la variabilidad de un lote a otro en el pH no explica una mejor o peor solubilidad. En general, 50 mg / mL parece ser la condición más sólida, donde todos los lotes parecen estar por encima del pH de “solubilidad” y donde la temperatura no tiene impacto dentro del marco de tiempo de dos semanas de este estudio. Los resultados sugieren que la concentración, el pH y la temperatura de almacenamiento influyen en la estabilidad del desoxicolato de sodio. Las muestras a 50 mg / mL mostraron la mejor estabilidad a 4ºC y 25ºC durante dos semanas.

    Ejemplo 2 Estudio de estabilidad

    Este ejemplo demuestra que las formulaciones acuosas de menos del 5% p / v de desoxicolato de sodio a un pH de 8,0 a 8,5 exhibieron muy buena solubilidad. Este ejemplo también demuestra que el desoxicolato de sodio no muestra degradación en formulaciones acuosas que tienen menos del 5% p / v de desoxicolato de sodio durante el almacenamiento durante ocho semanas a 4 ° C, 25 ° C y 37 ° C. Varias formulaciones se sometieron a agitación, exposición a los rayos UV y ciclos de congelación-descongelación y no mostraron degradación o precipitación cuando se expusieron a esas tensiones.

    Se realizó un estudio de estabilidad de dos meses de desoxicolato de sodio en varias formulaciones diferentes. Por HPLC de fase inversa, el desoxicolato de sodio no mostró degradación en todas las formulaciones a todas las temperaturas. Sin embargo, la solubilidad fue mejor en formulaciones que contenían fosfato 10 mM, NaCl al 0,9%, alcohol bencílico al 0,9% a un pH de 8,0 u 8,5. Las temperaturas de almacenamiento de 25ºC y 37ºC también contribuyeron a la solubilidad. Todas las formulaciones que se eligieron para agitación, exposición a los rayos UV y congelación-descongelación no mostraron degradación ni precipitación cuando se expusieron a esas tensiones.

    La Tabla 6 proporciona una lista de productos químicos utilizados en la preparación de las formulaciones descritas en este documento.

    Estudios de estabilidad

    La estabilidad de las formulaciones de desoxicolato de sodio se examinó en las condiciones resumidas en la Tabla 7. Se utilizó HPLC de fase inversa junto con observaciones visuales que se realizaron en cada momento para controlar cualquier precipitación o turbidez. Las formulaciones probadas para vórtice, exposición a UV y congelación-descongelación, se eligieron entre las formulaciones que se desempeñaron mejor en el estudio de temperatura. Los principales problemas de estabilidad del desoxicolato de sodio observados durante este estudio fueron la solubilidad y la deriva del pH.

    I. Efecto de la temperatura sobre la estabilidad

    Las formulaciones se incubaron a 4ºC, 25ºC y 37ºC y se analizaron para a) productos de degradación, b) estabilidad del pH yc) claridad de la formulación.

    Formulaciones probadas

    A excepción de las formulaciones que solo consistían en agua, el desoxicolato de sodio se disolvió en tampón que se había titulado a un pH de 6. Cada formulación, excepto las dos que solo consistían en agua, se tituló luego a su pH objetivo con NaOH. Todas las formulaciones se filtraron de forma estéril y se llenaron hasta 1,5 ml en viales de vidrio estériles de 2 cc. A continuación, los viales llenos se esterilizaron en autoclave. Las formulaciones 3A y 3B estaban turbias antes del llenado.

    Se utilizó HPLC de fase inversa para visualizar los productos de degradación. Un cromatograma de muestra de la formulación 4A muestra el pico principal con respecto a los productos de degradación (Figura 3). HIGO. 4 muestra el pico principal con respecto a los productos de degradación (es decir, Pureza) para todas las formulaciones a las temperaturas de incubación de 4ºC, 25ºC y 37ºC. La FIG. 4 muestra la pureza en t = 0 y 2 meses. Los resultados sugieren que no se produjo degradación química en ninguna de las formulaciones de la Tabla 8.

    La Tabla 9 muestra el pH de las formulaciones antes del llenado y en t = 0. En general, el pH se acercó a 8 y se mantuvo constante durante todo el estudio. Esto sugiere que el desoxicolato de sodio tiene cierta capacidad amortiguadora.

    La claridad de cada formulación se determinó mediante dos métodos. Un método fue la observación visual, en la que el vial se mantuvo frente a una luz intensa y la presencia de partículas se determinó por lo que el ojo podía ver. Un conjunto de viales llenos de tampones de formulación e incubados a las tres temperaturas se utilizaron como patrones de referencia. El otro método utilizó la dispersión de luz iluminando las muestras a lo largo de una trayectoria de 1 cm con luz de 500 nm en un espectrofotómetro.

    La presencia de precipitados visibles en algunas formulaciones aumentó con el tiempo, particularmente a 4ºC. Las formulaciones que contenían sorbitol al pH más bajo produjeron la mayor precipitación. Las formulaciones que se comportaron mejor contenían fosfato 10 mM, NaCl al 0,9%, alcohol bencílico al 0,9% a pH 8,0 u 8,5.

    Las tablas 10, 11, 12 y 13 muestran los resultados de claridad. La columna “Claridad visual” tiene un sistema de clasificación de la siguiente manera: 0 = transparente, sin partículas 1 = transparente, pocas partículas 2 = transparente, varias partículas 3 = transparente, muchas partículas grandes, 4 = ligeramente turbio 5 = muy turbio.

    ii. Efectos de la agitación, la exposición a los rayos UV y el congelamiento-descongelamiento en la estabilidad

    Basándose en los resultados del estudio de temperatura, se eligieron las siguientes formulaciones en la Tabla 14 para probar los efectos de la agitación, la exposición a los rayos UV y la congelación-descongelación sobre la estabilidad.

    Se utilizó HPLC de fase inversa para visualizar los productos de degradación. FIGS. 5, 6 y 7 muestran el pico principal con respecto a los productos de degradación (es decir, Pureza) para las formulaciones en la Tabla 14 bajo el estrés de agitación, exposición a UV y cinco ciclos de congelación-descongelación. Los resultados sugieren que no se produjo degradación química como resultado de ninguna de las tensiones.

    La Tabla 15 muestra el pH de las formulaciones antes del llenado diferente al pH después de abrir los viales.

    La claridad de cada formulación se determinó mediante dos métodos. Uno de los métodos fue la observación visual, en la que el vial se sostenía a una luz intensa y la presencia de partículas se determinaba por lo que el ojo podía ver. Un conjunto de viales llenos de tampones de formulación e incubados a las tres temperaturas se utilizaron como patrones de referencia. El otro método utilizó la dispersión de luz iluminando las muestras a lo largo de una trayectoria de 1 cm con luz de 500 nm en un espectrofotómetro.

    La agitación, la exposición a los rayos UV y los ciclos de congelación-descongelación no parecen inducir la precipitación.

    Las tablas 16, 17 y 18 muestran los resultados de claridad. La columna “Claridad visual” tiene un sistema de clasificación como sigue: 0 = transparente, sin partículas 1 = claro, pocas partículas 2 = claro, varias partículas 3 = claro, muchas partículas grandes, 4 = ligeramente turbio 5 = muy turbio.

    Después de examinar el perfil de estabilidad del desoxicolato de sodio en diecisiete formulaciones únicas, se determinó que las formulaciones que contenían fosfato 10 mM, NaCl al 0,9% y alcohol bencílico al 0,9% a pH 8,0 u 8,5 evitaban mejor la precipitación visible además de maximizar la solubilidad. Por HPLC de fase inversa, el desoxicolato de sodio no muestra degradación en todas las formulaciones a todas las temperaturas, durante el almacenamiento durante ocho semanas a 4 ° C, 25 ° C y 37 ° C.En cuanto a la claridad visual de las formulaciones, temperaturas de almacenamiento de 25 ° C y 37 ° C realmente mejoraron la solubilidad del desoxicolato de sodio en comparación con 4 ° C.

    Todas las formulaciones que se eligieron para agitación, exposición a rayos UV y congelación-descongelación no mostraron degradación ni precipitación cuando se expusieron a esas tensiones. Una vez completado el estudio de estabilidad en almacenamiento de ocho semanas, las formulaciones seleccionadas se sometieron a estas condiciones de estrés agudo. Estos experimentos ayudan a determinar la estabilidad del desoxicolato de sodio durante el estrés de los procedimientos comunes de fabricación y envío. Los datos obtenidos de estos estudios de estrés agudo confirman la estabilidad del desoxicolato de sodio en formulaciones que contienen fosfato 10 mM, 0,9% de NaCl y 0,9% de alcohol bencílico a pH 8,0 u 8,5, con una concentración de desoxicolato de sodio de 5, 10 y 20 mg / ml.


    SUBSIDIOS

    Otorgado por una beca de Methusalem de KU Leuven a J. Tack y por la Research Foundation Flanders (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen, FWO) a través de becas de doctorado (para H. Vanheel y T. Vanuytsel) y posdoctorales (R. Farré).

    El financiamiento también fue proporcionado por el Fondo de Investigación Sanitaria y CIBERehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria, Ministerio de Economía y Competitividad (CP10 / 00502 & amp PI13 / 00935 a M. Vicario). CIBERehd está financiado por el Instituto de Salud Carlos III.


    Ver el vídeo: Generation P 2011 комедия HD (Agosto 2022).