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BIS 2A Otoño 2018 - Biología

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BIS 2A Otoño 2018

La metionina coordina un programa anabólico organizado jerárquicamente que permite la proliferación

La disponibilidad de metionina durante la limitación general de aminoácidos reprograma metabólicamente las células para apoyar la proliferación, cuya base subyacente sigue sin estar clara. Aquí construimos la organización de este programa anabólico mediado por metionina usando levadura. Al combinar el análisis comparativo del transcriptoma y los enfoques bioquímicos y basados ​​en el flujo metabólico, descubrimos que la metionina reconecta las salidas metabólicas generales al aumentar la actividad de un nodo regulador clave. Esto comprende la vía de la pentosa fosfato (PPP) acoplada con la biosíntesis reductora, la síntesis de glutamato / glutamina dependiente de glutamato deshidrogenasa (GDH) y la capacidad de transaminación dependiente de piridoxal-5-fosfato (PLP). Este nodo PPP-GDH-PLP proporciona los cofactores y / o sustratos necesarios para las reacciones posteriores que limitan la velocidad en la síntesis de aminoácidos y, por lo tanto, de nucleótidos. Estos pasos limitantes de la velocidad en la biosíntesis de aminoácidos también se inducen de una manera dependiente de metionina. Por lo tanto, esto da como resultado una cascada bioquímica que establece un programa anabólico organizado jerárquicamente. Para que se mantenga este programa anabólico mediado por metionina, las células cooptan un regulador de "respuesta al estrés por inanición", Gcn4p. En conjunto, nuestros datos sugieren un marco metabólico jerárquico que explica cómo la metionina media un cambio anabólico.


Una hermosa mujer se encuentra desnuda en Times Square, su memoria borrada, su cuerpo cubierto por una serie de tatuajes codificados. Pero a medida que & quotJane Doe & quot y el equipo del FBI descubrieron su trabajo para descifrar, investigar y resolver el complejo mapa del tesoro de su cuerpo, se revela una red cada vez más amplia de conspiración y corrupción, al igual que la verdad detrás de la identidad real de Jane Doe y la identidad. de las personas que la enviaron al FBI en primer lugar. Pero, ¿qué es lo que realmente quiere este infame grupo? ¿Y podrán Jane y sus compañeros de equipo detenerlos a tiempo?

El reparto incluye a Sullivan Stapleton (& quot300: Rise of an Empire & quot & quotStrike Back & quot), Jaimie Alexander (& quotThor: The Dark World & quot & quotAgents of SHIELD & quot), Rob Brown (& quotTreme & quot), Audrey Esparza (& quotBlack Box & quot), Ashley Johnson ( "Mucho ruido y pocas nueces") y Luke Mitchell ("Agentes de SHIELD").

El creador y escritor Martin Gero (& quot; Bored to Death & quot & quot; L.A. Complex & quot) actúa como productor ejecutivo junto con Greg Berlanti (& quotArrow, & quot & quot; The Flash & quot & quotLegends of Tomorrow & quot) y Sarah Schechter (& quotArrow, & quot & quot The Flash & quot & quotLegends of Tomorrow & quot).

& quotBlindspot & quot es una producción de Warner Bros. Television, Berlanti Productions y Quinn's House.

Día y hora
Viernes a las 8 / 7c

Estreno de la temporada
12 de octubre de 2018

Protagonizada
Sullivan Stapleton, Jaimie Alexander, Rob Brown, Audrey Esparza, Ashley Johnson y Luke Mitchell

Creado por
Martín Gero

Productores ejecutivos
Greg Berlanti, Martin Gero y Sarah Schechter

Coproductores ejecutivos
Alex Berger, Brendan Gall, Christina M. Kim, Chris Pozzebon

Productor supervisor
Ryan Johnson y Peter Lalayanis

Producido por
Chad McQuay

Coproductores
Rachel Caris Love, Kristen Layden, Jennifer Lence, Carl Ogawa, Sarah Rath

Director (301)
Martín Gero

Directores de fotografía
Jon Delgado (impar), Andrew Priestley (par)

Editores
Mike Banas, Kristin Windell, Finnian Murray, Hilary Bolger, Ian Mayberry

Casting por
Suzanne Ryan

Diseñador de producción
Andrew Jackness

Origen
Nueva York

Serie producida por
Berlanti Productions y Quinn's House, Inc. en asociación con Warner Bros. Television


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Resultados

Modelos de ratón para la regulación genética de la ATP sintasa en neuronas

Para explorar el papel biológico de IF1 en las neuronas, hemos desarrollado un knockout de IF1 condicional específico de neuronas (IF1 KO ) e IF1 que sobreexpresan transgénicos (IF1 TG ) ratones. Los ratones IF1-floxed se generaron a partir de una línea de ratones que albergaba un reportero etiquetado Atp5if1 alelo condicional (Atpif1 tm1a) después de la deleción ubicua mediada por Flp del casete de captura de genes (Fig. 1A y 1B). IF1 KO Los ratones se obtuvieron eliminando el exón 3 de IF1 en los ratones floxed mediante recombinación mediada por Cre bajo el control de la proteína quinasa II α dependiente de Ca 2+ / calmodulina (Camk2a) promotor, que está activo principalmente en neuronas excitadoras (Fig. 1A y 1B). IF1 TG Los ratones transgénicos se desarrollaron reproduciendo ratones que albergan IF1 humano bajo el control de un elemento regulado por tetraciclina con ratones que expresan el transactivador bajo el control de Camk2a promotor (Fig. 1B y 1C). IF1 es una proteína altamente conservada en mamíferos que inhibe la ATP sintasa de diferentes especies, incluida la levadura [31], y es probable que la sobreexpresión de IF1 humana recapitule una ganancia de función de IF1 de roedor [12,22]. La expresión de IF1 se eliminó en las neuronas del prosencéfalo de IF1 KO ratones (Fig.1D), y el IF1 humano se sobreexpresó en IF1 TG ratones, aumentando los niveles totales de IF1 (Fig. 1D), como se reveló utilizando un anticuerpo que reconoce tanto las proteínas humanas como las de ratón [30]. Además, el knockout de IF1 era específico para las regiones del prosencéfalo y no afectaba al cerebelo ni a otros tejidos con alto contenido de IF1 (Fig. S1A). Ratones heterocigotos con una copia funcional de Atp5if1 gen expresó niveles normales de la proteína (Fig. S1B), lo que sugiere la relevancia de los mecanismos postranscripcionales para la regulación de la expresión de IF1 [30].

(A) Generación de IF1 KO ratones en neuronas que muestran el Atp5if1 knockout-first (tm1a), floxed (salmón ahumado), KO y alelos wt. Se indican las regiones amplificadas por las PCR utilizadas para la genotipificación. Las flechas muestran cebadores y las cruces rojas indican PCR no productivas. (B) Genotipado por PCR de wt, salmón ahumado, CRL y IF1 KO ratones (panel superior), o wt, IF1, tTA y IF1 TG ratones (panel inferior). (C) Esquema de Camk2a-tTA y TRE-hIF1 constructos utilizados para impulsar la expresión de hIF1 en neuronas del prosencéfalo de una manera inducible por tetraciclina. (D) Western blot de total (humano y ratón) y hIF1 en extractos de diferentes regiones del prosencéfalo de IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones. GAPDH se muestra como CRL. (E y F) Actividades sintéticas e hidrolíticas de ATP en mitocondrias aisladas del prosencéfalo de IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones (norte = 3-5) utilizando succinato como sustrato respiratorio. OL redujo ambas actividades en un grado similar en los 3 genotipos (se muestra el promedio). (GRAMO) Mitocondrias de IF1 KO , CRL y SI TG los ratones fueron IP con anti-F1-ATPasa, y el co-IP IF1 se identificó mediante Western Blot. El histograma de la parte inferior muestra la cuantificación de IP β-F1 e IF1 (norte = 3). (H) Micrografías de electrones representativas de mitocondrias en la región CA1 del hipocampo (barra de escala, 300 nm). Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación de la relación de aspecto mitocondrial (norte = 46-69 mitocondrias cada una) y el número de crestas que entran en contacto con el IMM normalizado por área mitocondrial (norte = 18-22) en 2 ratones por genotipo. (I) Western blots de OPA1, MFN2, DRP1, VDAC, IMMT y HSP60 en extractos de hipocampo. Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación como cambio de veces de CRL (norte = 5). (J) Número de copias de ADNmt en el ADN extraído del prosencéfalo de IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones (norte = 9). Barras de error: media ± SEM. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001, ****PAG & lt 0,0001 por 2 colas t prueba (E – G y J) o Kruskal – Wallis con prueba de comparaciones múltiples de Dunn (I). Las transferencias de Western sin recortar se pueden encontrar en S1 Raw Images, y los datos numéricos subyacentes a los gráficos en S1 Data. CMV, CRL del promotor de citomegalovirus mínimo, DRP1 de control, proteína hIF1 similar a dinamina-1, IF1 humana HSP60, proteína de choque térmico IF1 de 60 kDa, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa IMM transgénico, IMMT de membrana mitocondrial interna, IP de mitofilina, KO inmunoprecipitado, MFN2 knockout, ADNmt de mitofusina 2, ADN mitocondrial OL, oligomicina OPA, atrofia óptica 1 pA, señal de poliadenilación TRE, elemento de respuesta de tetraciclina VDACTA, elemento de respuesta a tetraciclina t de canal aniónico dependiente de peso, tipo salvaje.

Es importante destacar que las actividades sintéticas de ATP (Fig 1E) e hidrolíticas (Fig 1F) en las mitocondrias aisladas aumentaron tras la ablación de IF1 y se redujeron significativamente a medida que aumentaba la dosis de IF1, lo que sugiere que IF1 se une e inhibe una fracción significativa de la ATP sintasa. en condiciones fisiológicas normales. Para verificar este punto, se inmunoprecipitó ATP sintasa y se determinó la proteína IF1 co-inmunoprecipitada (Fig. 1G). Los resultados revelaron que la reducción en ambas actividades enzimáticas se correlacionaba con niveles más altos de IF1 co-inmunoprecipitado con la enzima (Fig. 1G), lo que apoya fuertemente el papel de IF1 en la regulación de la ATP sintasa en las neuronas.

La dosis de IF1 regula la estructura mitocondrial, la respiración y la producción de mtROS

El análisis de microscopía electrónica de la región CA1 del hipocampo reveló que las mitocondrias del soma neuronal de IF1 KO Los ratones eran más redondeados y mostraban una arquitectura de crestas menos organizada en comparación con las mitocondrias más alargadas de control y IF1 TG ratones, aunque no se encontraron diferencias en el área mitocondrial (Fig. 1H). A nivel molecular, estos cambios fueron paralelos a una importante regulación a la baja de la proteína similar a la dinamina-1 pro-fisión (DRP1) solo en IF1 TG ratones (Fig. 1I). Al mismo tiempo, los niveles del canal aniónico dependiente del voltaje (VDAC) y de la subunidad central MICOS mitofilina (IMMT) aumentaron en IF1 TG ratones (Fig. 1I), lo que sugiere que la dosis de IF1 afecta la estructura mitocondrial en las neuronas. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) entre los 3 genotipos (Fig. 1J).

Tanto la respiración basal como la sensible a oligomicina en cultivos primarios de neuronas del hipocampo se redujeron significativamente a medida que aumentaba la dosis de IF1 (Fig. 2A y 2B), de acuerdo con la inhibición de la ATP sintasa mediada por IF1. Es de destacar que la respiración máxima se redujo significativamente solo en IF1 TG ratones (Fig. 2A y 2B), debido a una disminución en la actividad del complejo IV (Fig. 2C) pero no del complejo I (Fig. 2D), de acuerdo con hallazgos previos [12]. Estos cambios ocurrieron en ausencia de diferencias significativas en los marcadores de la masa mitocondrial, como el número de copias de ADNmt (Fig 1J) y el contenido de HSP60 (Fig 1I), o en la expresión (Fig S1C) y ensamblaje (Fig S1D) de los complejos respiratorios. a pesar de las grandes diferencias en la expresión de IF1 (Fig. S1C). La reducción de la actividad del complejo IV no estuvo acompañada por la alteración de su organización supramolecular (Fig. S1D), como se muestra en un informe anterior [12], porque el IF1 de tipo salvaje ejerce una inhibición menos estricta de la ATP sintasa que el IF1 constitutivamente activo mutante [22] que se utilizó en ese estudio [12]. Sin embargo, la dosis de IF1 aumentó significativamente los ensamblajes oligoméricos de la ATP sintasa (Fig. S1D), de acuerdo con observaciones anteriores [14, 19]. Curiosamente, la respiración ligada a fugas de H + se redujo significativamente con una dosis más alta de IF1 (Fig. 2A y 2B), lo que sugiere OXPHOS más eficiente.

(A) Perfiles respiratorios de IF1 KO (línea azul), CRL (gris) y IF1 TG (rojo) neuronas primarias. Se indica la adición de OL, FCCP y A / R. (B) Los histogramas muestran las tasas de respiración basal, OSR, máxima y ligada a fugas de protones en Seahorse XF24 (norte = 6-8 embriones de 3 cultivos independientes). (C y D) Actividades de los complejos IV e I en mitocondrias aisladas del prosencéfalo (norte = 6). (E y F) Actividad glicolítica medida por la tasa de producción de lactato o ECAR en cultivos primarios (norte = 6–11 embriones de 3 cultivos independientes). (GRAMO) Western blots de la fosforilación y expresión de AMPKα y AMPKβ, ACC, PYGM, GAPDH y LDHA en extractos de hipocampo. La α-tubulina se muestra como control y se muestran 2 muestras representativas (1 y 2). Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación como cambio de veces de CRL (norte = 5). (H) Relación ATP / ADP en el prosencéfalo (norte = 6). (I) Tinción de neuronas primarias con TMRM, MTG y MitoSOX (barra de escala, 40 μm). Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación de ΔΨm y mtROS como cambio de veces de CRL (norte = 4-14 embriones) y su correlación positiva. (J) Western blots de CAT, SOD1 y SOD2, PRDX3 y PRDX6, NRF2, la subunidad catalítica del GCLC y GSR en extractos de hipocampo. La α-tubulina se muestra como control. Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación como cambio de veces de CRL (norte = 5). Barras de error: media ± SEM. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0,01 por 2 colas t prueba (B – J). En un), *PAG & lt 0.05 para IF1 KO -CRL, # PAG & lt 0.05 para CRL-IF1 TG , y **PAG & lt 0.01 para IF1 KOIF1 TG comparaciones (2 colas t prueba). Véase también la Fig. S1. Las transferencias Western sin recortar se pueden encontrar en S1 Raw Images, y los datos numéricos subyacentes a los gráficos en S1 Data. ΔΨm, potencial de membrana mitocondrial ACC, acetil-CoA carboxilasa AMPKα, subunidad de proteína quinasa activada por AMP alfa AMPKβ, subunidad de proteína quinasa activada por AMP beta A / R, antimicina A y rotenona CAT, catalasa CRL, control ECAR, tasa de acidificación extracelular GSR, glutatión reductasa IF1, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa KO transgénico, LDHA knockout, lactato deshidrogenasa A MTG, MitoTracker Green mtROS, especies de oxígeno reactivas mitocondriales NRF2, factor nuclear eritroide 2 similar a 2 OL, oligomicina OSR, respiración sensible a oligomicina PRDX, peroxiredoxina PYGM, glulasecógeno reactivo ROSGM especies de oxígeno SOD, superóxido dismutasa.

Tanto la producción de lactato (Fig.2E) como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Fig.2F) en los cultivos primarios se redujeron en IF1 TG ratones, lo que sugiere un flujo glucolítico reducido. Además, la capacidad glucolítica máxima también se redujo en IF1 TG ratones, según lo evaluado por ECAR tras la adición de oligomicina (Fig. 2F). No se observaron diferencias significativas en la expresión de enzimas glucolíticas en extractos de cerebro (Fig. 2G). Aunque la fosforilación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y de su acetil-CoA carboxilasa (ACC) diana aguas abajo se incrementó en el hipocampo de IF1 TG ratones (Fig. 2G), la relación ATP / ADP del prosencéfalo fue similar entre los 3 genotipos (Fig. 2H). En general, estos resultados sugieren una actividad metabólica reducida en las neuronas de IF1 TG ratones en comparación con los otros genotipos.

Es importante destacar que el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y la producción de mtROS aumentaron en cultivos neuronales a medida que aumentaba la dosis de IF1, de manera similar al efecto del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina (Fig. 2I). La hiperpolarización mitocondrial y la producción mejorada de mtROS son consistentes con un consumo reducido de la fuerza motriz del protón (Δp) debido a la inhibición de la síntesis de ATP por IF1 [20, 22]. Investigamos la producción de mtROS por transferencia inversa de electrones (RET) [32,33] a través del complejo I en mitocondrias cerebrales aisladas utilizando succinato para reducir el grupo de CoQ y generar Δpag [34]. Curiosamente, las mitocondrias de los 3 genotipos mostraron una tasa sustancial de H2O2 producción que era sensible al complejo I, inhibidor de rotenona (fig. S1E), y que también se veía afectado por él. Estos hallazgos indican que el RET basal es el mismo entre los 3 genotipos y enfatizan que una proporción relevante de mtROS son producidos por RET en las mitocondrias del cerebro. De todos modos, dado que los niveles de RET in vivo están controlados por ΔΨm [34], los hallazgos apoyan que RET mejora su contribución a la producción de mtROS observada en neuronas con dosis de IF1 más altas (Fig. 2I). De acuerdo con estas observaciones, las enzimas antioxidantes catalasa, superóxido dismutasa 1 y 2 (SOD1 y SOD2) fueron reguladas positivamente en el hipocampo de IF1 TG ratones, apoyando in vivo un aumento en la producción de ROS (Fig. 2J). Es de destacar que este aumento debe ser leve, porque no se indujo la expresión de otras proteínas de la defensa antioxidante (Fig. 2J). En general, estos hallazgos apoyan que la dosis de IF1 juega un papel importante en la regulación de la respiración mitocondrial y en la generación de mtROS en las neuronas del hipocampo.

La dosis de IF1 regula los programas transcripcionales de la función neuronal

Los cambios en la producción de mtROS regulan las quinasas y los factores de transcripción implicados en las respuestas mitohorméticas que favorecen la adaptación a las señales cambiantes [35]. Con el fin de develar los posibles mecanismos regulados por la dosis de IF1, llevamos a cabo un análisis transcriptómico del hipocampo e identificamos 463 genes expresados ​​diferencialmente entre IF1 TG y IF1 KO ratones (Fig. 3A-3C). Nos enfocamos en el IF1 TG versus IF1 KO comparación porque produjo el mayor número de genes expresados ​​diferencialmente, que incluían genes de las otras 2 comparaciones (Fig. 3A y Disponibilidad de datos GSE154064). El análisis de componentes principales (PCA) reveló la agrupación de IF1 TG ratones lejos de IF1 KO y contrapartes de control (Fig. 3D). Como muestra el análisis de ontología genética (GO), la mayoría de los genes expresados ​​diferencialmente codificaban proteínas localizadas fuera de las mitocondrias (Fig. 3E). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) confirmó la mejora de los genes relacionados con la comunicación celular y la membrana postsináptica en IF1 TG ratones (Fig. 3F). Estos hallazgos apoyan que la dosis de IF1, además de regular la estructura y la actividad mitocondrial (Figuras 1 y 2), también afecta a otras estructuras neuronales como las dendritas y las membranas postsinápticas, que son cruciales para la transmisión sináptica. De acuerdo con esta idea, el análisis de la vía del ingenio (IPA) predijo diferencias en la dinámica dendrítica, la plasticidad sináptica, la memoria a corto plazo y el comportamiento (Fig. 3G). Además, la señalización del miembro de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral CD40, que promueve la neuroinflamación [36], se redujo en IF1 TG ratones (Fig. 3G). El análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de los genes clave que se encuentran expresados ​​diferencialmente entre los 3 genotipos confirmó el estudio transcriptómico (Fig. 3H).

(A) Genes expresados ​​diferencialmente identificados en las 3 comparaciones entre IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones. (B) Mapa de calor que muestra genes que exhiben estadísticamente significativos (PAG & lt 0.05) y aumentos del doble o más entre IF1 KO y IF1 TG ratones. (C) Gráfico de volcán que muestra genes expresados ​​diferencialmente en IF1 TG vs. IF1 KO comparación. (D) PCA de los 3 genotipos. (MI) Análisis de enriquecimiento genético de las transcripciones reguladas hacia arriba y hacia abajo en IF1 TG con respecto a IF1 KO ratones, mostrando los componentes celulares GO. La línea discontinua muestra el umbral de significación. (F) Gráficos de enriquecimiento de los mejores éxitos obtenidos de GSEA. (GRAMO) IPA de funciones biológicas y vías canónicas con su estado de activación / inhibición previsto. Las líneas discontinuas muestran el umbral de significación. (H) Cuantificación mediante PCR en tiempo real de genes clave expresados ​​diferencialmente identificados en la matriz. Barras de error: media ± SEM de 6 ratones por genotipo. *PAG & lt 0,05 por 2 colas t prueba. Los datos numéricos subyacentes a los gráficos se pueden encontrar en S1 Data. CRL, control GO, ontología genética GSEA, análisis de enriquecimiento del conjunto de genes IF1, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa IPA transgénica, análisis de la vía del ingenio KO, PCA knockout, análisis de componentes principales.

Los análisis proteómicos y metabolómicos confirman el papel de IF1 en la función neuronal

Un análisis proteómico cuantitativo del hipocampo de IF1 KO , control y IF1 TG los ratones identificaron 6.168 péptidos, correspondientes a 58 proteínas diferentes, que se expresaron diferencialmente entre los 3 genotipos (Figura 4A) y los separaron claramente (Figura 4B). La expresión de algunas proteínas se correlacionó con la dosis de IF1 (Fig. 4C y 4D). Como se observó con los datos transcriptómicos, las proteínas expresadas diferencialmente se ubicaron tanto en las mitocondrias como en otros compartimentos, incluidas las proyecciones de neuronas (Fig 4E) y mostraron un enriquecimiento significativo para el aprendizaje o la memoria en IF1 TG ratones (Fig. 4F). Encontramos una sutil regulación a la baja de las proteínas OXPHOS en ratones IF1 TG (Fig 4G), que incluía la subunidad COX6B1 del complejo IV mitocondrial, que podría contribuir a la reducción del citocromo C actividad oxidasa observada en estos ratones (Fig.2C), de la proteína Rieske (UQCRFS1) y de δ, B, y F subunidades de la ATP sintasa (consulte Disponibilidad de datos PXD020262). La potenciación a largo plazo (LTP), un mecanismo de plasticidad sináptica subyacente al aprendizaje y la memoria [37], también se encontró enriquecida entre las proteínas reguladas negativamente en IF1 TG ratones (Fig 4G). Por otro lado, las proteínas reguladas al alza en IF1 TG los ratones mostraron enriquecimiento de enzimas involucradas en el metabolismo de alanina, aspartato, glutamato y glutatión (Fig. 4G), a saber, glutamina sintetasa, glutamato descarboxilasa y 4-aminobutirato aminotransferasa (ver Disponibilidad de datos PXD020262).

(A) Proteínas expresadas diferencialmente entre IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones resultantes del análisis iTRAQ. (B) PCA de los 3 genotipos. (C) Mapa de calor que representa las proteínas cuya expresión se correlaciona con la dosis de IF1. (D) Diagramas de caja que muestran la expresión de las proteínas que aumentan o disminuyen con una dosis mayor de IF1, expresada como veces de CRL (norte = 8 regulado al alza y norte = 13 proteínas reguladas a la baja línea central, límites de caja mediana, bigotes de los cuartiles superior e inferior, puntos de rango intercuartílico 1,5 ×, valor atípico). (MI) Análisis de enriquecimiento génico de las proteínas reguladas hacia arriba y hacia abajo en IF1 TG con respecto a IF1 KO ratones, que muestran la significativa GO celular c. (F) Gráfico de enriquecimiento de un golpe superior obtenido en GSEA a partir de datos proteómicos. (GRAMO) Análisis de enriquecimiento génico de las proteínas reguladas hacia arriba y hacia abajo en IF1 TG vs. IF1 KO ratones, mostrando las vías KEGG significativamente enriquecidas. Los datos numéricos subyacentes a los gráficos se pueden encontrar en S1 Data. CRL, control GSEA, análisis de enriquecimiento del conjunto de genes IF1, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa KEGG transgénico, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KO, knockout OXPHOS, PCA de fosforilación oxidativa, análisis de componentes principales.

Curiosamente, un análisis metabolómico del hipocampo (Fig.5A, Tabla S1) reveló que el glutamato se redujo significativamente en IF1 TG ratones (Fig. 5B), de acuerdo con la regulación positiva de las enzimas que consumen glutamato (Fig. 4G). El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del cerebro y su reducción en IF1 TG ratones (Fig. 5B) refuerza la existencia de diferencias en la función sináptica como lo sugieren los análisis ómicos (Figs. 3G y 4G). La glutamina, el aspartato y la alanina también se redujeron en IF1 TG ratones (Figura 5B), lo que podría sugerir que las proteínas reguladas al alza (Figura 4G) responden a un déficit compensatorio de los metabolitos (Figura 5B). No observamos cambios relevantes en los niveles de glutatión con el aumento de la dosis de IF1 (Fig. 5B), quizás porque la respuesta antioxidante leve desencadenada por la regulación al alza de catalasa, SOD1 y SOD2 (Fig 2J) es suficiente para amortiguar la producción de mtROS. El metabolismo de los aminoácidos aromáticos también se enriqueció en el conjunto de datos (Fig. 5A y 5C). Específicamente, la fenilalanina y la tirosina, que son precursoras del neurotransmisor dopamina, la dopamina misma y sus metabolitos, se redujeron significativamente en IF1 TG ratones (Fig. 5C). Es de destacar que la reducción del contenido tisular de un gran número de aminoácidos en IF1 TG ratones (Fig. 5, Tabla S1) sugiere que IF1 contribuye a la reprogramación del metabolismo de los aminoácidos en las neuronas.

(A) Análisis de enriquecimiento de la vía de los metabolitos en la comparación IF1 TG vs. IF1 KO ratones. El color del nodo se basa en el PAG los valores del análisis de enriquecimiento integrado y el radio del nodo representa los valores de impacto de la vía del análisis de topología. (B) Descripción general de las vías metabólicas de alanina, aspartato y glutamato y GSH. Metabolitos significativamente reducidos en IF1 TG vs.Ratones CRL se muestran en rojo, y su cuantificación se muestra en la parte inferior (norte = 3). (C) Esquema de la biosíntesis y degradación de la dopamina. Metabolitos significativamente reducidos en IF1 TG vs.Ratones CRL se muestran en rojo, y su cuantificación se muestra en la parte inferior (norte = 3). Barras de error: media ± SEM. *PAG & lt 0,05 por 2 colas t prueba. Consulte también la tabla S1. Los datos numéricos subyacentes a los gráficos se pueden encontrar en S1 Data. CRL, control DOPAC, ácido 3,4-dihidroxifenilacético GABA, ácido γ-aminobutírico GSH, glutatión HVA, ácido homovanílico IF1, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa KO transgénico, ciclo del TCA inactivo, ciclo del ácido tricarboxílico.

La sobreexpresión de IF1 aumenta la transmisión sináptica basal

Los análisis combinados estructural, funcional y ómico sugirieron que los cambios en la expresión de IF1 mitocondrial podrían afectar la actividad sináptica. Para probar esta posibilidad, determinamos si la dosis de IF1 afecta la transmisión basal en la sinapsis glutamatérgica entre las neuronas piramidales CA3 y CA1, que es clave para el aprendizaje y la memoria [37]. Se realizaron registros electrofisiológicos en cortes de hipocampo agudo utilizando un electrodo estimulante colocado sobre fibras colaterales de Schaffer en el estrato radiactivo de la región CA1 (Fig. 6A) [38]. Se midió la pendiente de los potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) (figura 6B) para controlar la activación sináptica de las neuronas piramidales CA1. Curiosamente, se observó una respuesta postsináptica 3 veces mayor en un rango de intensidades estimulantes en IF1 TG ratones en comparación con los otros genotipos (Fig. 6C). En particular, esto también se reflejó en la presencia de picos de población, que aparecieron a altas intensidades de estimulación en las respuestas de IF1 TG rebanadas, y son causadas por la activación de potenciales de acción en las neuronas postsinápticas debido a su mayor estimulación (ver traza representativa en la Fig. 6C).

(A) Configuración de las grabaciones de campo realizadas en cortes de hipocampo. (B) Traza representativa para ilustrar un registro extracelular en el stratum radiatum de la región CA1 (sin escala). (C) Curvas de entrada-salida que muestran la pendiente de fEPSP en cortes de IF1 KO (norte = 8), CRL (norte = 9), y IF1 TG (norte = 11) ratones (norte = 5 ratones cada uno) en respuesta al aumento de la fuerza del estímulo. Inserciones: fEPSP representativas a 250 μA (barra de escala de las inserciones, 0,2 mV, 10 ms). (D) Western blots de la fosforilación y expresión de GluA1 y ERK 1/2. La α-tubulina se muestra como control y se muestran 2 muestras representativas (1 y 2). Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación como pliegue de los ratones CRL de control (norte = 5). (MI) Imágenes representativas de espinas dendríticas (puntas de flecha) de neuronas primarias del hipocampo transfectadas con EGFP (barra de escala, 10 μm). Los histogramas de la derecha muestran la cuantificación de la densidad y el área de la columna (norte = 247–628 espinas de 2 culturas independientes). (F) Western blots de RhoA, WAVE1 y β-actina en extractos de hipocampo. Los histogramas de la parte inferior muestran la cuantificación como pliegue de los ratones CRL de control (norte = 5). (GRAMO) Parcelas de pistas representativas de IF1 KO , CRL y IF1 TG ratones en la prueba de campo abierto. Los puntos azules y rojos indican el punto de inicio y finalización de la pista, respectivamente. (H) Actividad exploratoria de IF1 KO (norte = 6), CRL (norte = 7), y IF1 TG ratones (norte = 9). (I) Esquema de la prueba de reconocimiento de objetos novedosos. (J y K) Los gráficos muestran el índice de discriminación a las 2 y 24 horas después de la sesión de entrenamiento. IF1 KO , CRL (norte = 7 cada uno), y IF1 TG ratones (norte = 8). Barras de error: media ± SEM. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001, ****PAG & lt 0,0001 por ANOVA de 1 (H) o 2 (C) vías con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni, Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (E) o por pares t prueba (J y K). Véase también la Fig. S2. Se pueden encontrar transferencias de Western sin recortar en S1 Raw Images, y datos numéricos subyacentes en gráficos en S1 Data. CRL, DG control, giro dentado ERK 1/2, quinasa regulada por señal extracelular 1/2 fEPSP, potencial postsináptico excitador de campo GluA1, subunidad 1 del receptor AMPA IF1, factor inhibidor de ATPasa 1 IF1 KO , Nocaut IF1 IF1 TG , IF1 que sobreexpresa KO transgénico, RhoA knockout, miembro de la familia homólogo Ras A SC, Schaffer colateral s.r., stratum radiatum WAVE1, miembro 1 de la familia WASP.

El aumento de la transmisión sináptica basal en IF1 TG los ratones se correlacionaron con una mayor fosforilación de la subunidad GluA1 de los receptores AMPA (Fig. 6D), que se asocia con una mayor probabilidad de apertura [39] y conductancia del canal [40]. También aumentó la fosforilación de la quinasa 1/2 regulada por señales extracelulares (ERK 1/2) (Fig. 6D), cuya señalización aumenta la transmisión sináptica [41]. Curiosamente, aunque la densidad de la columna fue menor en IF1 TG neuronas (Fig. 6E), las espinas eran significativamente más grandes en comparación con los otros genotipos (Fig. 6E), lo que podría estar relacionado con el aumento de la transmisión basal en estos animales (Fig. 6C) [42]. Las diferencias en la dinámica de la columna vertebral podrían explicarse parcialmente por la organización diferencial del citoesqueleto de actina [43], como lo sugieren los análisis transcriptómicos y proteómicos (Figs. 3E, 3G y 4G). De hecho, la expresión del miembro de la familia A (RhoA) homólogo de GTPasa Ras, que promueve el crecimiento de la columna [44], se incrementó en el hipocampo de IF1 TG ratones (Fig. 6F). Por el contrario, el miembro 1 de la familia WASP (WAVE1), cuya actividad aumenta la densidad de la columna [45], fue regulado a la baja (Fig. 6F). Sorprendentemente, no hubo diferencias significativas en la expresión de LTP entre los 3 genotipos (Fig. S2A), a pesar de una fuerte disminución en los niveles de subunidades del receptor de NMDA en IF1 TG ratones (Fig. S2B), que median la forma principal de LTP en las sinapsis CA1 [46]. No se encontró una reducción significativa de los niveles de ARNm de las subunidades del receptor de NMDA en IF1 TG ratones (figura S2C y disponibilidad de datos GSE154064). Por lo tanto, la disminución de su expresión en IF1 TG los ratones podrían resultar de su internalización y degradación dependiente de ubiquitina [47], como se informó anteriormente para la subunidad GluN1 tras aumentos prolongados de la actividad neuronal in vitro mediante el tratamiento con bicucullina, un antagonista del inhibidor GABAA receptores [48].

La dosis de IF1 afecta el aprendizaje

Dadas las diferencias ómicas (Figs. 3G y 4G) y sinápticas entre los 3 genotipos (Fig. 6C), examinamos a continuación si la expresión diferencial de IF1 puede tener efectos más amplios sobre el comportamiento y la cognición. En la prueba de campo abierto, IF1 KO los ratones mostraron una actividad exploratoria basal reducida en comparación con los otros 2 genotipos (Fig. 6G y 6H). La memoria se evaluó en la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (Fig. 6I), que se basa en la tendencia de los roedores a explorar preferentemente objetos nuevos [49]. Es de destacar que todos los ratones participaron por igual en estas pruebas (figura S2C). En la prueba de memoria a corto plazo, el control y IF1 TG los ratones mostraron índices de discriminación superiores al 50%, lo que indica que reconocieron el objeto nuevo (Fig. 6J). Notablemente, IF1 KO Los ratones exhibieron una cognición deteriorada con incapacidad para reconocer la novedad (Fig 6J) y tendieron a explorar ambos objetos con más frecuencia en comparación con CRL y IF1 TG (Figura S2C). Curiosamente, en la prueba de memoria a largo plazo, solo IF1 TG los ratones reconocieron el objeto nuevo (Fig. 6K). Estos hallazgos sugieren que IF1 KO los ratones tienen una memoria a corto plazo deteriorada, mientras que la expresión de IF1 en las neuronas mejora la memoria en función de la dosis de IF1.

La memoria mejorada a largo plazo de IF1 TG los ratones fueron parcialmente resistentes contra un protocolo amnésico basado en escopolamina que interfiere con la consolidación de la memoria [50] (Fig. S2D-S2F). Estos resultados refuerzan el mejor desempeño cognitivo de IF1 TG ratones y juntos apoyan un papel funcional para IF1 en las neuronas, porque su ablación afecta el aprendizaje, mientras que el aprendizaje se ve reforzado por su sobreexpresión.

La señalización mtROS media el aumento de la transmisión sináptica y la memoria de IF1 TG ratones

Las ROS regulan el desarrollo y la función neuronal, incluida la actividad sináptica [51] y la activación de ERK 1/2 [52]. A continuación, investigamos si los mtROS contribuyen a mejorar la cognición en IF1 TG ratones. Administration of the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ to IF1 TG mice reduced the hippocampal level of mtROS in living mice, as measured using the mitochondria-targeted exomarker MitoB, whereby an increase in mtROS leads to an increase in the ratio of MitoP relative to MitoB (Fig 7A), suggesting the partial quenching of mtROS production in vivo by MitoQ [53]. This point was further confirmed by the decreased expression of some antioxidant defense proteins upon MitoQ treatment, which included nuclear factor erythroid 2-like 2 (NRF2), its regulator kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1), and some of the downstream targets such as the mitochondrial enzymes SOD2 and peroxiredoxin 3 (PRDX3) (Fig 7B). Interestingly, MitoQ did not affect the expression of antioxidant proteins located outside mitochondria, such as catalase, SOD1, peroxiredoxin 6 (PRDX6), glutathione reductase (GSR), and heme oxygenase 1 (HMOX1) (Fig 7B). MitoQ administration also reduced protein carbonylation and tyrosine 3-nitration in hippocampal extracts (S3A and S3B Fig).

(A) MitoP/MitoB ratio in the hippocampus of IF1 TG untreated (norte = 17) or MQ-treated mice (norte = 15). (B) Western blots of NRF2, KEAP1, SOD2, PRDX3, CAT, SOD1, PRDX6, GSR, and HMOX1 in hippocampal extracts. α-tubulin is shown as control, and 2 representative samples are shown (1 and 2). Histograms to the right show the quantification as fold of untreated IF1 TG mice (norte = 6). (C) Input–output curves showing fEPSP slope in acute hippocampal slices from untreated or MQ-treated IF1 TG mice (norte = 11 slices from 5 mice) in response to increasing stimulus strength. Insets: representative fEPSPs at 250 μA (scale bar, 0.2 mV, 10 ms). (D) Western blots of the phosphorylation and expression of GluA1, ERK 1/2, and Ca 2+ /Camk2a. α-tubulin is shown as control. Histograms to the right show the quantification as fold of untreated IF1 TG mice (norte = 6). (MI) The plot shows the discrimination index in the long-term memory test (norte = 9). Error bars: mean ± SEM. *PAG < 0.05, ***PAG < 0.001, ****PAG < 0.0001 by 2-tailed (A, B, and D) or pairwise (E) t test, or 2-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test (C). In (C), data from IF1 TG mice are replotted from Fig 3, since the recordings were performed in the same experiment. See also S3 Fig. Uncropped western blots can be found in S1 Raw Images, and numerical data underlying plots in S1 Data. Camk2a, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II α CAT, catalase ERK 1/2, extracellular signal-regulated kinase 1/2 fEPSP, field excitatory postsynaptic potential GluA1, AMPA receptor subunit 1 GSR, glutathione reductase HMOX1, heme oxygenase 1 IF1 TG , IF1 overexpressing transgenic KEAP1, kelch-like ECH-associated protein 1 MQ, MitoQ mtROS, mitochondrial reactive oxygen species NRF2, nuclear factor erythroid 2-like 2 PRDX3, peroxiredoxin 3 SOD, superoxide dismutase.

Electrophysiological recordings in hippocampal slices revealed that MitoQ partially reduced the enhanced basal synaptic transmission found in IF1 TG mice (Fig 7C). The phosphorylation of ERK 1/2 and of Camk2a was also reduced upon MitoQ treatment (Fig 7D), supporting a role for mtROS production in activating the signaling pathways controlling synaptic function. However, we did not observe changes in the phosphorylation of AMPA receptor subunit GluA1 (Fig 7D). MitoQ administration had no significant effect on LTP expression (S3C Fig) or in the levels of NMDA receptor subunits, RhoA, or WAVE1 (S3D Fig).

Importantly, quenching mtROS partially diminished the long-term memory of IF1 TG mice, as shown by their inability to recognize the novel object in the long-term memory test (Fig 7E). Of note, MitoQ-treated animals showed high dispersion in the discrimination index for the test session (Fig 7E), although this did not correlate with the redox markers analyzed for some of them (Fig 7B, S3A and S3B Fig), following a random distribution. These changes happened without gross differences in the time exploring both objects (S3E Fig) or in basal exploratory activity (S3F and S3G Fig), suggesting the specificity of mtROS production by the IF1-inbibited ATP synthase in learning and memory.

IF1 improves exploratory activity, memory, and motor coordination in aged mice

Finally, we studied the exploratory, cognitive, and locomotor behavior in 2-year old mice expressing different doses of IF1. Aged IF1 TG mice showed higher exploratory activity when compared to the other 2 genotypes (S4A and S4B Fig). In the long-term memory test, they also exhibited a higher discrimination index in the test session (S4C Fig), with no differences in the participation in the test (S4D Fig), suggesting that they have improved long-term memory. Motor coordination was also better preserved in aged IF1 TG mice, especially at low rotating speeds, as assessed in the Rota-rod test (S4E Fig). No significant differences were found in the life span among the 3 genotypes (S4F Fig).


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    • AIRSv7: AIRS/Aqua L3 Monthly Standard Physical Retrieval 1 degree x 1 degree V7.0 (AIRSv7 Data)
    • Anomalies: Mean temperature (°C) averaged over a specified mean period y time interval relative to a given base period.
    • Trends: Temperature change (°C) of a specified mean period over a specified time interval based on local linear trends.

    Referencias:

    Please see the GISTEMP references page for citations to publications related to this research.


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    Implementing providers will require a PRODA account to access the NDIS Commission Portal. Upon logging in for the first time, plans that have been lodged can be accepted. The next step is to submit monthly reports via the NDIS Commission Portal.


    About Summer and Fall 2021

    In-Person, Remote, and Online Classes

    The Summer and Fall 2021 schedules include in-person, online, and remote classes. To find out the status of a particular class, look at the Remote, Online or Campus column of the online schedule.

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    2021 ASH Annual Meeting

    63rd ASH Annual Meeting and Exposition

    December 11-14, 2021
    Atlanta, GA
    In-Person/Virtual

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    ASH would like to acknowledge the following companies for the educational grants provided in support of the 2020 ASH Annual Meeting:

    Hematology 2020: The Education Program

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    • Bristol Myers Squibb
    • Incyte Corporation
    • Jazz Pharmaceuticals, Inc.
    • Novartis Pharmaceuticals

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    • AstraZeneca
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    • Daiichi Sankyo, Inc.
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    • Incyte Corporation
    • Janssen Biotech, Inc.
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    • Pfizer Inc.
    • Seagen

    Key Dates for the 2021 ASH Annual Meeting and Exposition

    Members-only registration and housing opening
    July 21, 2021 at 11:00 a.m. Eastern time

    Abstract submission deadline
    August 3, 2021 at 11:59 p.m. Pacific time

    Non-member and group registration
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    Abstracts available online
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    Meeting opens
    December 11-14, 2021

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Comentarios:

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