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¿Cuál es la mejor manera de fijar y preservar los portaobjetos de ensayo de cometa antes de teñir con bromuro de etidio?

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Quiero utilizar el método de electroforesis en gel de celda única (ensayo cometa). Tengo muchas muestras, pero no tengo el microscopio adecuado. Así que tengo que conservar mis portaobjetos hasta que llegue el momento de la tinción y el análisis microscópico. He leído muchos protocolos diferentes y no puedo decidir cuál es el mejor. Además, después de la tinción y el análisis, es posible que deba reutilizar el mismo portaobjetos. ¿Es eso posible? y si es así, ¿qué debo hacer?


Mediciones del ensayo Comet: una perspectiva

El ensayo Comet o ensayo de electroforesis en gel de una sola célula es uno de los ensayos más utilizados para detectar microscópicamente daños en el ADN a nivel de una sola célula. La determinación del daño se lleva a cabo mediante la puntuación visual de las células (después de la clasificación en diferentes categorías en función de la longitud y la forma de la cola) o mediante el uso de diferentes programas informáticos disponibles comercialmente o de dominio público (que reconocen automáticamente el alcance del daño). En este ensayo, la forma, el tamaño y la cantidad de ADN dentro del "cometa" juegan un papel importante en la determinación del nivel de daño. El uso de un software en particular también proporciona una variedad de parámetros diferentes, muchos de los cuales pueden no ser relevantes para determinar la extensión del daño del ADN. Dado que una gran cantidad de factores pueden influir en la forma, el tamaño, la identificación y la determinación del daño inducido, lo que incluye los criterios de puntuación, las técnicas de tinción, la selección de parámetros (mientras se utilizan los paquetes de software) y la aparición de 'hedgehog' o 'nubes', Este artículo tiene como objetivo (a) proporcionar una descripción general de la evolución de las mediciones del daño del ADN utilizando el ensayo Comet y (b) resumir y analizar críticamente las ventajas y desventajas de los diferentes enfoques que se están adoptando actualmente al utilizar este ensayo. Se sugiere que la selección juiciosa de diferentes parámetros, métodos de tinción junto con la validación entre laboratorios y la armonización de metodologías ayudarán aún más a hacer que este ensayo sea más robusto y ampliamente aceptable para estudios científicos y regulatorios.


CometChip: una plataforma de 96 pocillos de alto rendimiento para medir el daño del ADN en células humanas microarrays

Aquí describimos una plataforma que permite la detección de daños en el ADN mediante ensayos de cometas con un rendimiento sin precedentes. El dispositivo modela las células de mamíferos en una micromatriz y permite el procesamiento en paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis del daño del ADN a nivel de base, el daño del ADN inducido por la exposición y la cinética de reparación del ADN.

Abstracto

Los agentes que dañan el ADN pueden promover el envejecimiento, las enfermedades y el cáncer, y son omnipresentes en el medio ambiente y se producen dentro de las células humanas como metabolitos celulares normales. Irónicamente, en dosis altas, los agentes que dañan el ADN también se usan para tratar el cáncer. Por tanto, la capacidad de cuantificar las respuestas al daño del ADN es fundamental en los ámbitos clínico, farmacéutico y de salud pública. Aquí, describimos una plataforma novedosa que explota técnicas de microfabricación para patrones de células en un microarray fijo. El & # 8216CometChip & # 8217 se basa en el ensayo de electroforesis en gel de una sola célula bien establecido (también conocido como ensayo cometa), que estima el nivel de daño del ADN mediante la evaluación de la extensión de la migración del ADN a través de una matriz en un campo eléctrico. El tipo de daño medido por este ensayo incluye sitios básicos, enlaces cruzados y roturas de hebras. En lugar de dispersarse aleatoriamente en agarosa en el ensayo tradicional, las células se capturan en una matriz de micropocillos de agarosa por gravedad. La plataforma también se expande del tamaño de un portaobjetos de microscopio estándar a un formato de 96 pocillos, lo que permite el procesamiento paralelo. Aquí describimos los protocolos de uso del chip para evaluar el daño del ADN causado por agentes genotóxicos conocidos y la respuesta de reparación celular seguida después de la exposición. Mediante la integración de principios biológicos y de ingeniería, este método potencia mediciones robustas y sensibles del daño del ADN en células humanas y proporciona el rendimiento necesario para pruebas de genotoxicidad, desarrollo de fármacos, estudios epidemiológicos y ensayos clínicos.

Introducción

El ensayo de electroforesis en gel unicelular (SCGE) (también conocido como ensayo cometa) es una técnica ampliamente utilizada para la cuantificación de un amplio espectro de lesiones de ADN, incluidas lesiones de base, sitios abásicos, roturas de una sola hebra, roturas de doble hebra, enlaces cruzados y sensibles a los álcalis. sitios. El principio subyacente del ensayo es que el ADN dañado migra más fácilmente que el ADN no dañado debido a la fragmentación y la pérdida de la estructura superhelical. La extensión de la migración es proporcional a la cantidad de daño del ADN y se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia. La captura de imágenes y el análisis del perfil de intensidad del ADN individual en forma de cometa luego brindan mediciones de parámetros como la longitud de la cola, el momento de la cola y el% de ADN en la cola para revelar el nivel de daño del ADN dentro de una célula 1-4.

Actualmente existen dos versiones de uso común del ensayo cometa: a) ensayo cometa alcalino yb) ensayo cometa neutro. El ensayo cometa alcalino es la versión más utilizada, que utiliza un tampón de pH alto para desenrollar el ADN antes de la electroforesis y, por lo tanto, detecta todo tipo de roturas de hebras y sitios sensibles a los álcalis. El ensayo del cometa neutro, por otro lado, se practica menos porque utiliza un tampón neutro para mantener las hélices dobles y detectar solo roturas de doble hebra 2,5. Para los agentes químicos y físicos que inducen DSB, los SSB se crean en concierto y se forman en niveles mucho más altos (p.ej., & # 947IR inducidas por SSB son un orden de magnitud más común que las DSB). Para la mayoría de las exposiciones a daños en el ADN, los DSB son mucho menos frecuentes que otras clases de daños en el ADN y, por lo tanto, son más difíciles de detectar. Hemos demostrado en publicaciones anteriores la ventana de detección de ambas versiones. 6,7

Aunque el ensayo del cometa se ha utilizado habitualmente para la investigación básica sobre el daño y la reparación del ADN y las pruebas de genotoxicidad 1,2,8-15, se ha informado que el ensayo tiene poca reproducibilidad debido a muestras de muestra, de persona a persona y de laboratorio. variabilidad a laboratorio. Además, el análisis es de bajo rendimiento, en parte porque la adquisición de imágenes y el análisis de datos son laboriosos. Juntas, estas limitaciones contribuyen a su relativamente baja aceptación en estudios a gran escala. A través de la integración de tecnologías y principios de ingeniería, el CometChip ofrece una solución a los problemas de rendimiento y las inconsistencias que están asociados con el ensayo cometa tradicional 6,7. En resumen, para crear el chip, se microfabrica un molde mediante fotolitografía para crear micropostes con diámetros tan pequeños como el de una sola celda. Luego, el molde se usa para estampar agarosa fundida, lo que da como resultado una serie de micropocillos después de que el gel se solidifica. Se están desarrollando chips para proporcionar a los investigadores pozos de tamaño variable que sean compatibles con diferentes tipos de células. Para cargar el chip, se permite que las células en el medio se asienten en los pozos mediante la gravedad del exceso de células que se eliminan por lavado. A continuación, las células atrapadas se encapsulan usando una capa fina de agarosa de bajo punto de fusión, y luego se sujeta una placa de 96 pocillos sin fondo a la superficie del gel para crear 96 micropocillos, cada uno con cientos de micropocillos en su superficie inferior.

Este protocolo describe los procedimientos generales para experimentos con este chip, que incluyen preparación de gel, carga celular, dosificación y reparación, lisis celular, electroforesis e imágenes fluorescentes. Demostramos dos ejemplos de experimentos de respuesta a la dosis con células linfoblásticas expuestas a agentes que dañan el ADN conocidos, utilizando versiones alcalinas y neutras del ensayo, respectivamente. También se muestran dos experimentos de reparación para describir cómo se puede evaluar la respuesta de reparación posterior a la exposición utilizando el sistema.

Protocolo

  1. Retire el gel de chip del paquete y colóquelo en una placa rectangular de un pocillo, con la película de gel hacia abajo.
  2. Lavar el gel en 25 ml de PBS 1x durante 15 min, repetir dos veces.
  3. Coloque el gel en la placa de vidrio y etiquete la orientación del gel según corresponda.
  4. Presione suavemente una placa de 96 pocillos sin fondo invertida sobre el gel, asegúrese de que todos los pocillos de la placa de pocillos sin fondo estén dentro del área del gel.
  5. Utilice clips de encuadernación de 1.5 & # 8217 & # 8217 a cada lado de la placa para asegurar la sujeción con el vidrio.
  6. Aspire el exceso de tampón PBS en cada pocillo.
  1. Prepare suspensiones celulares:
    1. Para las líneas celulares en suspensión, diluya la suspensión celular en el medio para obtener una concentración final de 10 5 & # 821110 6 células / ml.
    2. Para las líneas celulares adherentes, siga los protocolos normales de separación / tripsinización y diluya las células desprendidas en el medio hasta una concentración final de 10 5 & # 821110 6 células / ml. Si las células se agregan, pase la suspensión celular en un filtro celular para obtener una suspensión celular única.

    NOTA: Para estudiar el nivel de daño del ADN de la línea de base, vaya al Paso 4.

    1. Alinee con cuidado los pocillos del chip (creado a partir de la sujeción anterior) con los pocillos de una nueva placa de 96 pocillos sin fondo. Vuelva a presionar la placa de 96 pocillos sin fondo en la parte superior y asegure la sujeción con clips de encuadernación.
    2. Agregue 100 & # 956l de producto químico de la dosis deseada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Realice la dosificación / tratamiento en hielo o en un refrigerador a 4 & # 176C durante el tiempo deseado.
    3. Después de la dosificación, aspire los productos químicos de cada pocillo y enjuague el producto químico residual con 1x PBS. Si se estudia aquí el daño directo, continúe con el Paso 4.
    4. Para estudiar la cinética de reparación, deje que las células del chip se repare en el medio a 37 ° C y 176 ° C. Lyse (vaya al paso 4) en momentos específicos.
      NOTA: La reparación se puede realizar en el chip con una placa de 96 pocillos sin fondo adjunta, o el chip se puede cortar en trozos separados después de retirar la placa de 96 pocillos sin fondo.
    1. Para realizar un ensayo cometa alcalino:
      1. Prepare un tampón de lisis alcalino de trabajo añadiendo Triton X-100 al 1% a la solución madre de lisis alcalina (NaCl 2,5 M, Na 100 mM2EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Prepare aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip.
      2. Enfríe previamente el tampón de lisis alcalino de trabajo a 4 ° C y 176 ° C.
      3. Sumerja el chip en tampón de lisis alcalino de trabajo frío y deje que la lisis se realice O / N en el refrigerador 4 & # 176C.
      1. Prepare un tampón de lisis neutro de trabajo añadiendo Triton X-100 al 1% y DMSO al 10% a la solución madre de lisis neutra (NaCl 2,5 M, Na 100 mM2EDTA, Tris 10 mM, 1% norte-Lauroilsarcosina, pH 9,5). Prepare aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip.
      2. Precalentar el tampón de lisis neutro de trabajo a 43 ° C y 176 ° C.
      3. Sumerja el chip en tampón de lisis neutro de trabajo tibio y permita que la lisis realice O / N en la incubadora a 43 & # 176C.
      1. Para realizar un ensayo cometa alcalino:
        1. Retire el tampón de lisis y enjuague rápidamente el chip con 1x PBS.
        2. Asegure el chip en una cámara de electroforesis con el lado de la película de gel hacia abajo con cinta adhesiva de doble cara.
        3. Lleve la cámara a una cámara fría a 4 ° C y # 176 ° C.
        4. Llene la cámara con tampón de electroforesis alcalina fría (NaOH 0,3 M, Na 1 mM2EDTA) a un nivel que solo cubre el gel.
        5. Deje que se desenrolle de forma alcalina durante 40 min.
        6. Ejecute la electroforesis a 1 V / cm y 300 mA durante 30 minutos en la habitación fría. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseada.
        1. Retire el tampón de lisis y enjuague el chip con tampón de electroforesis neutro (2 mM Na2EDTA, Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, pH 8,5) durante 2 x 15 min a 4 ° C y # 176 ° C.
        2. Asegure el chip en una cámara de electroforesis con el lado de la película de gel hacia abajo con cinta adhesiva de doble cara.
        3. Lleve la cámara a una cámara fría a 4 ° C y # 176 ° C.
        4. Llene la cámara con tampón de electroforesis neutro frío (2 mM Na2EDTA, Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, pH 8,5) hasta un nivel que apenas cubre el gel.
        5. Deje que el gel se asiente en una habitación fría durante 60 minutos.
        6. Ejecute la electroforesis a 0,6 V / cm y 6 mA durante 60 min en la habitación fría. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseada.
        1. Retire el chip de la cámara de electroforesis de la cámara fría.
        2. Neutralizar los geles en tampón de neutralización (Tris 0,4 M, pH 7,5) durante 2 x 15 min en un refrigerador 4 & # 176C.
        3. Teñir el chip con la tinción de ADN fluorescente de su elección (es decir., SYBR Gold, Ethidium Bromide) según los procedimientos recomendados por la fábrica. Imagen mediante microscopía fluorescente.

        Analice imágenes de cometas con un software de ensayo de cometas estándar, como Komet 5.5.

        Resultados representativos

        En este primer ejemplo, describimos el enfoque para cuantificar los niveles iniciales de daño del ADN en células linfoblastoides humanas después de la exposición al daño oxidativo usando H2O2. Para evaluar H2O2-Lesiones de base inducidas y roturas de una sola hebra, se utilizan condiciones de cometa alcalinas. Una vez que se completa la carga y las células se han encapsulado con la capa de agarosa, se presiona una placa de 96 pocillos sin fondo sobre la superficie para crear 96 compartimentos en el chip. Cada uno de los 96 pozos puede dosificarse con un tipo o concentración diferente de productos químicos. Aquí cuatro dosis diferentes de H2O2 se utilizaron y se utilizó 1x PBS como control negativo. Imágenes representativas de cometas en matriz se muestran en Figura 1A, donde no tratado (arriba), 50 & # 956M (medio) y 100 & # 956M (abajo) H2O2-muestras expuestas demostraron diferentes niveles de colas de cometas. El análisis de las imágenes de cometas se puede realizar utilizando software disponible comercialmente, que generalmente cuantifica los niveles de daño en función de la intensidad de fluorescencia total y la distancia de migración de cada cola de cometa. Las mediciones se realizan comúnmente en 50 a 100 cometas por condición y se calcula el valor mediano (% de ADN de la cola o longitud de la cola). Figura 1B ilustra el porcentaje de la curva de respuesta del ADN de la cola analizada de los cometas de células linfoblastoides TK6 expuestos a cuatro concentraciones diferentes de H2O2. La coherencia entre los experimentos independientes demuestra la eficacia de este enfoque para evaluar la respuesta al daño del ADN de varios niveles de tratamientos químicos en las células.

        Para aprender sobre la variación entre muestras (p.ej., entre macrowells) y entre repeticiones del mismo experimento, la variabilidad entre muestras e inter-experimentales se representó en Figura 2A y 2B respectivamente. Dentro de cada experimento, cada pocillo del chip de 96 pocillos es equivalente a una muestra diferente y, por lo tanto, la variación de pozo a pozo revela la variación entre muestras del dispositivo. Aquí, las células TK6 cargadas en 12 pocillos del chip de 96 pocillos se trataron con la misma dosis de H2O2 y se lisan inmediatamente después del tratamiento. Todos los demás pasos experimentales se realizaron en paralelo y las medianas de al menos 50 cometas de cada macropocillo se trazaron en Figura 2A. El promedio de las medianas es 77,53% de ADN en la cola, con una desviación estándar de 3,99%. A partir de estos datos, calculamos que el coeficiente de variación entre las muestras es del 5,2%, que es varias veces más bajo que el ensayo tradicional, lo que demuestra la robustez mejorada de este ensayo 6,16. Para conocer la reproducibilidad del ensayo, expusimos células TK6 en un chip con 75 & # 956M H2O2 y analizar el nivel inmediato de daño al ADN. Este experimento se repitió seis veces y los datos de cada experimento se trazaron en Figura 2B. En idénticas condiciones experimentales, obtuvimos resultados que van desde el 41,76% al 57,87%, que se muestran como barras grises en la figura. El promedio de seis repeticiones es 49.57%, con un error estándar de la media de solo 2.04%. La baja variación entre repeticiones implica que el ensayo cometa realizado en este nuevo dispositivo es altamente reproducible.

        Para evaluar la cinética de reparación, se permite que las células repare su ADN en medio fresco después del tratamiento. La lisis de macropocillos en varios puntos de tiempo revela el cambio en el daño del ADN a lo largo del tiempo. Se muestra un ejemplo en figura 3. En este experimento, las células TK6 se encapsularon primero en el chip, se trataron con 50 & # 956M H2O2y se dejó reparar hasta 60 min después de la exposición. Las células se lisaron a 0, 20, 45 y 60 min respectivamente. Imágenes representativas de cometas en diferentes puntos de tiempo se muestran en Figura 3A, y el cambio en los niveles de daño del ADN a lo largo del tiempo se representa en Figura 3B. Estos datos revelaron que casi todo el daño se repara dentro de los 45 minutos posteriores a la H2O2 tratamiento. Muchas variables pueden afectar la velocidad de reparación, incluido el tipo de línea celular y el agente químico utilizado. Por tanto, los investigadores pueden modificar el protocolo (es decir., extendiendo el tiempo de reparación) para adaptarse a necesidades adicionales en sus investigaciones. Aquí proporcionamos otro ejemplo de experimento de reparación utilizando este chip, en el que las células TK6 se desafían con un agente genotóxico diferente. norte-Metilo-N & # 8217-Nitro-norte-Nitrosoguanidina (MNNG) es un agente alquilante conocido por inducir lesiones en la base, incluidas la 7-metilguanina y la 3-metiladenina. Estas lesiones se convierten en sitios abásicos por depurinación espontánea o por eliminación enzimática por ADN glicosilasas. El sitio abásico resultante puede escindirse en condiciones alcalinas y, por tanto, detectarse en el chip. La exposición inicial provoca un aumento significativo en el daño, evidente por las colas largas, y con el tiempo estas colas se reducen a medida que las células restauran el ADN intacto durante la reparación. Aunque la alquilación y el daño oxidativo son reparados principalmente por la vía de reparación por escisión de la base, la cantidad de lesiones generadas y las proteínas involucradas en la reparación varían. Estas variaciones pueden conducir a diferentes tasas de conversión a sitios abásicos, así como a diferentes tasas de reparación de los sitios abásicos resultantes. En Figura 4, Se muestra la cinética de reparación de las células TK6 expuestas a 0,1, 1 y 3 & # 181 g / ml de MNNG. En este experimento, ampliamos el tiempo del experimento a 2 horas después de la exposición porque el daño inducido por MNNG parece persistir más tiempo y se elimina a un ritmo más lento en comparación con H2O2-daño inducido.

        El análisis de las DSB en condiciones neutrales es muy similar al protocolo para el análisis de lesiones monocatenarias en condiciones alcalinas. Para mostrar los niveles iniciales de daño, las células TK6 se expusieron a niveles variables de gIR y las células resultantes se lisaron y sometieron a electroforesis a pH neutro (Figura 5A). Es de destacar que la morfología de las colas de los cometas es diferente de las condiciones del ensayo alcalino. Para lograr ADN fragmentado observable usando este ensayo, la dosis de IR usada es significativamente más alta (0-100 Gy) que la dosis requerida para ver el daño usando las condiciones alcalinas. Además, encontramos que la longitud de la cola es el parámetro más sensible para reflejar la extensión del daño del ADN cuando se utiliza el ensayo cometa neutral [7]. La curva de respuesta a la dosis analizada se ilustra en Figura 5B. También se puede evaluar la reparación de las roturas de la doble hebra del ADN en las células, y Weingeist lo ha demostrado et. Alabama. 7. En conjunto, el CometChip neutral ofrece una valiosa herramienta para el análisis de alto rendimiento de los DSB de ADN.


        Figura 1. H2O2 respuesta a la dosis de células TK6 usando ensayo cometa alcalino. (A) Cometas de micropocillos en matriz de linfoblastos TK6 no tratados (arriba) y células TK6 expuestas a 50 & # 956M (centro) y 100 & # 956M (abajo) H2O2 durante 20 min a 4 ° C y # 176 ° C. La barra de escala es de 100 y 956 m. (B) H2O2 respuesta a la dosis de células TK6 expuestas a varios niveles de H2O2. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo el porcentaje medio del ADN de la cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


        Figura 2. Variabilidad intermuestra e intereperimental. (A) Variación de muestra a muestra. Se cargaron células linfoblásticas humanas TK6 en 12 pocillos del chip de 96 pocillos. Cada pocillo fue expuesto a 100 & # 956l de 50 & # 956M H2O2 durante 20 min a 4 ° C y # 176 ° C. Las células se lisaron inmediatamente y se analizaron para el% de ADN de la cola. Aquí se muestran los datos de cada pozo. Cada cuadro representa la mediana de al menos 50 cometas individuales de cada pozo. La media de 12 pozos es 77,53%, la desviación estándar es 3,99% y el coeficiente de variación se calcula en 5,2%. (B) Variación de experimento a experimento. Se cargaron células linfoblásticas humanas TK6 en el chip de 96 pocillos, se expusieron a 100 & # 956l de 75 & # 956M H2O2 durante 20 min a 4 ° C y # 176 ° C. Las células se lisaron inmediatamente y se analizaron para determinar el% de ADN de la cola. El mismo experimento se repitió 6 veces y los datos de cada repetición se muestran como una barra gris. Cada cuadro representa la mediana del% de ADN de la cola de al menos 100 cometas individuales de cada repetición. El promedio de 6 repeticiones es 49,57%, que se muestra aquí como la barra trasera. La desviación estándar de 6 repeticiones es 4,99%, y el error estándar de la media se calcula en 2,04%, representado como la barra de error en la figura.


        figura 3. Reparación de H2O2-daño inducido en linfoblastos TK6. (A) Esquema de estudio de reparación con cometas representativos. Las células TK6 se tratan con agentes dañinos y se dejan reparar en medio a 37 ° C antes de la lisis. (B) Repara la cinética de las células TK6 después del tratamiento con 50 & # 956M H2O2 durante 20 min a 4 ° C y # 176 ° C. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo el porcentaje medio del ADN de la cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de experimentos repetidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


        Figura 4. Reparación del daño inducido por MNNG en linfoblastos TK6. Las células TK6 se tratan con 0,1, 1 y 3 & # 181 g / ml de MNNG durante 30 minutos a 4 & # 176ºC y se dejan reparar en medio a 37 & # 176ºC hasta 120 minutos después de la exposición. El porcentaje medio de ADN de la cola de al menos 50 cometas individuales se obtuvo para cada uno de los tres experimentos independientes. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres experimentos independientes.


        Figura 5. Respuesta a la dosis de IR de las células TK6 utilizando un ensayo cometa neutro. (A) Cometas de micropocillos en matriz de linfoblastos TK6 no tratados (arriba) y células TK6 expuestas a irradiación gamma de 40 Gy (centro) y 80 Gy (abajo). La barra de escala es de 100 y 956 m. (B) Respuesta a la dosis de IR de las células TK6 expuestas a varios niveles de irradiación gamma. Cada punto de datos representa la longitud mediana de la cola (& # 956m) de al menos 300 cometas agrupados de seis macropozos en el chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

        Discusión

        Las genotoxinas ubicuas en el medio ambiente y también dentro de las células humanas ejercen un estrés y daño inevitables en el ADN celular. De hecho, se ha estimado que hay miles de lesiones de ADN presentes en células humanas en estado estable 18. Comprender la susceptibilidad al daño y la cinética de reparación en los seres humanos no solo aporta conocimientos a la investigación básica, sino que también beneficia el desarrollo de fármacos. Irónicamente, a pesar de la capacidad del daño del ADN para promover el cáncer, los agentes que dañan el ADN se utilizan en niveles muy altos para tratar el cáncer, lo que hace que el conocimiento sobre el daño y la reparación del ADN sea relevante para la medicina personalizada. El CometChip es un dispositivo de investigación novedoso que utiliza prácticas de microfabricación para revolucionar un ensayo de daño del ADN que existe desde hace mucho tiempo. Basado en los mismos principios del ensayo cometa tradicional, el chip proporciona un rendimiento significativamente mayor y una mejor reproducibilidad. Describimos aquí métodos para usar este chip. Para aclarar su utilidad y robustez, mostramos los resultados de varios experimentos en los que el chip se ha utilizado para evaluar el daño inducido por varios agentes diferentes que dañan el ADN y en los que se ha utilizado para evaluar la reparación del ADN. Juntos, los resultados presentados aquí proporcionan información útil para usar el chip y demuestran su amplia aplicabilidad a la investigación sobre el daño y la reparación del ADN.

        Uno de los pasos más importantes de este protocolo es lograr una carga celular eficaz. Se han probado muchas líneas celulares en este sistema, incluidas células tanto en suspensión como adherentes. La eficiencia de carga depende de muchas variables como el tipo de celda, el tamaño de la celda, la concentración de carga y el tiempo. Las líneas de células en suspensión, como las células linfoblastoides, son las más fáciles de trabajar. La concentración de la suspensión celular puede variar de 10 4 a 10 6 células por 96 pocillos y la carga normalmente se completa en 15 & # 821130 min. Una mayor densidad celular facilita la carga y acorta el tiempo necesario para que las células se asienten en los micropocillos.

        Los parámetros de carga de las células adherentes pueden diferir de los de las células en suspensión. Se encontró que las líneas celulares, como las células de ovario de hámster chino (CHO), tienen una eficiencia de carga similar a la de las células en suspensión (después de la tripsinización) y, por lo tanto, utilizan condiciones de carga similares. Otros tipos de células, como las células tumorales que forman fácilmente agregados celulares en suspensión, requieren una manipulación adicional. Pasar las suspensiones celulares a través de un filtro de una sola célula y agregar tripsina al medio de suspensión puede suprimir la formación de grupos de células durante la carga. Finalmente, en términos de tiempo de carga, el tiempo requerido para capturar líneas celulares adherentes en micropocillos puede variar de 20 min a 1 h. Como resultado, se recomienda que los usuarios realicen experimentos piloto para determinar las condiciones óptimas de carga antes de continuar con más investigaciones. La eficacia de la carga se puede visualizar con un microscopio de campo brillante o se puede revelar con mayor precisión al teñir las células encapsuladas con DAPI u otras tinciones de ADN antes de la evaluación con el microscopio fluorescente.

        Una de las principales ventajas de este método y chip es la versatilidad. En primer lugar, los investigadores no están restringidos a una concentración específica de células de trabajo porque el exceso de células se elimina y el microarray asegura una densidad de cometas uniforme. En segundo lugar, los micropocillos se pueden fabricar con tamaños variables para adaptarse a tipos de células de diferentes tamaños. En circunstancias en las que se capturan varias células en un solo micropocillo, los cometas multicelulares se autocalibran y producen resultados consistentes en comparación con los cometas unicelulares 6,7. Otro beneficio de crear patrones de células en una micromatriz es que todos los cometas están en el mismo plano focal con posiciones fijas, lo que reduce el ruido debido a los cometas desenfocados y facilita la obtención de imágenes y el análisis automatizados. Las mejoras significativas en el rendimiento y la sensibilidad proporcionadas por CometChip permiten la aplicación del ensayo para estudios a gran escala. En conjunto, el chip proporciona una herramienta valiosa para la evaluación de daños en el ADN para investigadores, toxicólogos, médicos y epidemiólogos.

        Si bien el ensayo del cometa es conocido por su excelente sensibilidad para detectar una amplia gama de daños en el ADN, este ensayo también adolece de una baja especificidad. El uso de este protocolo mejora en gran medida la reproducibilidad y el rendimiento del ensayo, pero no demuestra un avance en la especificidad. No obstante, se ha informado que la multiplexación del ensayo con otras metodologías es eficaz para lograr una mayor especificidad. Un ejemplo es la inclusión de enzimas específicas de lesiones purificadas. Estas enzimas pueden convertir lesiones de la base que de otro modo serían indetectables en roturas de hebra detectables y sitios abásicos 1,19-21. Un ejemplo ampliamente utilizado es la endonucleasa reparadora formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg), que revela modificaciones oxidativas del ADN 19,22. Debido a que el paso de digestión enzimática se aplica después de la lisis celular, el sistema se puede tratar de la misma manera que un portaobjetos de agarosa tradicional sin alteraciones en el protocolo. Aunque el protocolo detallado no se describe aquí, este enfoque ha sido adaptado por muchos usuarios tradicionales de ensayos de cometas en el pasado y los protocolos se pueden encontrar fácilmente. En una publicación anterior, utilizamos este método para identificar el daño inducido por la luz fluorescente [22].

        La principal ventaja de este método es el rendimiento que proporciona, lo que abre las puertas a estudios que antes eran prácticamente imposibles. La capacidad de procesar 96 muestras en la misma plataforma no solo reduce el trabajo y el tiempo, sino que también reduce los ruidos experimentales y mejora en gran medida la reproducibilidad. La variación entre muestras es significativamente menor que la variación tradicional de deslizamiento a deslizamiento, que puede ser 2 veces mayor que la variación observada con este chip 6,7. La reducción del ruido también conduce a una mejor sensibilidad, lo que permite la detección de diferencias más sutiles entre las muestras. Debido a que el dispositivo emplea un formato estándar de 96 pocillos, es compatible con equipos de investigación general y tecnologías HTS. Considere un estudio que requiere la evaluación de 100 muestras, asumiendo que un investigador promedio puede procesar

        30 portaobjetos de vidrio en el transcurso de varios días. Dado que cada muestra debe realizarse por triplicado, se necesitaría aproximadamente un mes para completar dicho estudio, que también sufriría inevitablemente la variación de una muestra a otra. Por el contrario, procesar 100 condiciones, cada una por triplicado, con este chip requiere solo unas pocas placas y se puede realizar en tres días. Esta importante mejora en el rendimiento abre la puerta a estudios que antes eran inalcanzables.

        El protocolo que se presenta aquí describe los procedimientos básicos para realizar el ensayo cometa estándar y los pasos modificados necesarios para utilizar la plataforma CometChip. Con la capacidad de medir tanto los niveles de daño inherente al ADN como la respuesta de reparación subsiguiente, el ensayo es muy relevante para una variedad de aplicaciones biológicas y clínicas. La información sobre el impacto de exposiciones químicas específicas en el genoma facilita la prevención y el tratamiento de enfermedades. Además, también existe un interés significativo en determinar las variaciones en la sensibilidad al daño del ADN y la capacidad de reparación entre los individuos 23,24. Esta técnica proporciona el rendimiento necesario para estudios a gran escala. El conocimiento de las variaciones interindividuales es fundamental para identificar a las personas susceptibles y para diseñar terapias individualizadas o estrategias de prevención. En conjunto, la tecnología que se presenta aquí proporciona una plataforma de análisis de daño de ADN objetiva y cuantitativa de alto rendimiento que tiene el potencial de convertirse en una metodología estándar en un futuro próximo.

        Divulgaciones

        El CometChip ha sido licenciado a Trevigen, Inc. basado en una presentación de patente que incluye Wood, Weingeist, Bhatia y Engelward.

        Expresiones de gratitud

        Este trabajo fue apoyado principalmente por 5-UO1-ES016045 con soporte parcial de 1-R21-ES019498 y R44-ES021116. DMW fue apoyado por la Beca de Capacitación del NIEHS en Toxicología Ambiental T32-ES007020. El equipo fue proporcionado por el Centro de Ciencias de la Salud Ambiental P30-ES002109.


        Introducción

        Tanto el sistema inmunológico innato (la capacidad inherente de detectar y responder rápidamente a las infecciones) como la respuesta al daño del ADN (DDR), que reacciona a las amenazas a nuestro genoma, funcionan como sistemas de vigilancia esenciales para preservar la integridad de los organismos. La evidencia emergente indica que estos dos sistemas son interdependientes (Hartlova et al, 2015) y que los defectos en estos dos sistemas se encuentran en el corazón de muchas enfermedades como infecciones, autoinmunidad, cáncer y trastornos asociados al envejecimiento, incluida la neurodegeneración (Hartlova et al, 2015 Erttmann et al, 2016). Los factores moleculares implicados en la intercomunicación entre el DDR y el sistema inmunológico innato, así como los mecanismos subyacentes, siguen estando poco definidos.

        El cGAS cíclico GMP-AMP sintasa es bien conocido como sensor inmune innato que examina el citosol para detectar la presencia de ADN microbiano (Gao et al, 2013b Sol et al, 2013), así como el autoadn liberado del núcleo en condiciones de estrés genómico (Hartlova et al, 2015) o de mitocondrias estresadas (West et al, 2015). Tras el reconocimiento del ADN bicatenario (dsDNA), cGAS cataliza la ciclación de ATP y GTP en el segundo mensajero cíclico GMP – AMP (2′3′-cGAMP) (Ablasser et al, 2013 Civril et al, 2013 Cena et al, 2013 Gao et al, 2013a, 2013b Li et al, 2013 Sol et al, 2013 Zhang et al, 2013). Posteriormente, cGAMP se une a su adaptador STING (Stimulator of Interferon Genes) (Ishikawa & Barber, 2008), lo que lleva a la activación de respuestas inmunitarias innatas posteriores. Las disfunciones en la vía cGAS-STING se han relacionado con muchos trastornos que incluyen infecciones, enfermedades inflamatorias, neurodegeneración y cáncer (Barber, 2015 Chen et al, 2016 ).

        El cGAS generalmente se considera una proteína citosólica, pero se acumula transitoriamente en el núcleo después de la disolución de la membrana nuclear mitótica (Yang et al, 2017 Gentili et al, 2019 Zierhut et al, 2019). Además, también se ha informado que cGAS se transloca activamente desde el citosol al núcleo tras el daño del ADN (Liu et al, 2018) pero también se localiza en la membrana plasmática en algunos tipos de células (Barnett et al, 2019). A pesar de estos informes, la localización subcelular y la función de cGAS en diferentes condiciones biológicas siguen siendo objeto de acalorados debates (Gekara & Jiang, 2019).

        Las roturas de ADN de doble hebra (DSB) son lesiones potencialmente muy perjudiciales. Si se repara de manera inadecuada, el DSB da como resultado deleciones o translocaciones cromosómicas que culminan en trastornos asociados a la inestabilidad del genoma que incluyen tumorigénesis, envejecimiento acelerado y otras enfermedades (Jackson y Bartek, 2009). La reparación de DSB se produce a través de dos vías principales: unión de extremos no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016). El NHEJ es una vía de reparación propensa a errores activa durante todo el ciclo celular, que implica la ligadura de los extremos del ADN y, a menudo, conduce a mutaciones por deleción o inserción (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016). Por otro lado, la HR es un proceso de reparación preciso activo en las células en proliferación y se produce principalmente durante las fases del ciclo celular S y G2, en las que compromete la cromátida hermana no dañada para reparar la rotura de la plantilla para restaurar la secuencia de ADN original (Chapman et al, 2012 Ceccaldi et al, 2016). Para un resultado saludable, la activación de estas vías se calibra cuidadosamente para asegurar la eliminación oportuna de las roturas del ADN dañadas, pero, si el daño del ADN es excesivo, para promover la inducción de la muerte celular para erradicar las células genéticamente alteradas (Vitale et al, 2011). Las moléculas reguladoras involucradas en este delicado equilibrio no se conocen completamente. En este estudio, identificamos un nuevo regulador de la reparación del ADN: cGAS. Demostramos que cGAS está constantemente presente en el núcleo como una proteína unida a la cromatina donde actúa como un regulador negativo de la reparación del ADN mediada por recombinación homóloga, acelerando así la generación de micronúcleos y la muerte de células bajo estrés genómico. Mostramos que esta función cGAS no canónica es independiente del eje STING.


        Discusión

        Los resultados de este estudio indican que durante la EP de las células C2C12, se generan ROS en la superficie de las células, que no inducen daño a largo plazo del ADN genómico. El ADN plasmídico, que está presente fuera de las células durante la EP, neutraliza las ROS generadas y, por lo tanto, se inactiva. La generación de ROS es proporcional a la amplitud de los pulsos eléctricos y puede ser eliminada por antioxidantes, como la vitamina C o el tempol. Cuando se usan antioxidantes durante la electrotransferencia de genes, la eficiencia de transfección de los mioblastos C2C12 aumenta, específicamente, 1,6 veces por tempol. los en vivo, eficiencia de transfección de M. tibialis cranialis en ratones también aumenta con tempol, 1,4 veces.

        Ya se ha informado de la generación de ROS después de EP de células de ovario de hámster chino. 38, 39, 42, 43 Gabriel y Teissie 42 demostraron en células de ovario de hámster chino que las ROS se generan en la capa externa de la membrana celular en la tapa, que está electropermeabilizada. Los ROS generados fueron inducidos por la exposición de las células a 5 pulsos eléctricos de 500 & # x02009Vcm & # x022121, una duración de 1 & # x02009ms, frecuencia 1 & # x02009Hz y fueron detectados por (Pam) -Afluoresceína con microscopía de video de fluorescencia en el nivel de una sola celda. Este fenómeno, la generación de ROS después de EP de las células, también se detectó con lucigenina y fue dependiente de los parámetros de EP, como la amplitud de los pulsos eléctricos, la duración del pulso y el número de pulsos. 39 Nuestro estudio que utilizó lucigenina para la detección de ROS confirma los resultados publicados anteriormente, pero en diferentes líneas celulares (mioblastos C2C12), con parámetros de pulso utilizados para la electrotransferencia de genes (6 & # x000d7 500 & # x02009Vcm & # x022121, 5 & # x02009ms, 1 & # x02009Hz). 28 En este modelo específico de células musculares, demostramos que se generan más ROS al aumentar la amplitud de los pulsos eléctricos utilizados. La complementariedad de los resultados entre los dos métodos de detección diferentes (Pam) -Afluoresceína, que detecta las ROS en la membrana, y lucigenina, que detecta las ROS en la suspensión cerca de la superficie celular, indican que las ROS también se generan en o en la membrana celular durante el proceso EP en células C2C12. Además, varios estudios han informado de la inducción de genes para moléculas captadoras de radicales después de EP. 35, 36, 37

        Sin embargo, nadie ha podido presentar pruebas sólidas de la generación de ROS dentro del citoplasma después de la EP de las células. Hay alguna indicación de Shil, 44 que utilizó diacetato de 2 & # x02032,7 & # x02032, -diclorodihidrofluoresceína para la detección de ROS y, en condiciones experimentales diferentes a las nuestras, mostró un aumento en la generación de ROS intracelulares con el aumento de la amplitud de los pulsos eléctricos. Se obtuvieron resultados similares después de la radiación ionizante pero en un grado & # x0223c50 & # x00025 más alto.

        En nuestro estudio, la presencia de ROS intracelulares estuvo implicada indirectamente por la medición del daño del ADN genómico. La indicación de que el daño del ADN es generado por ROS y no directamente por EP está respaldada por el hecho de que el daño al ADN genómico no pudo detectarse inmediatamente después de la exposición de las células a EP, como lo demuestra el ensayo 8-oxoG. Se detectó daño en el ADN genómico después de un intervalo post-EP más largo utilizando el ensayo Comet. El daño del ADN genómico fue mínimo en comparación con el daño causado por el hidroperóxido de terc-butilo, que se utilizó como control positivo, y fue transitorio (detectado solo a intervalos de 15 y 30 & # x02009min), mostrando una reparación eficaz del ADN dentro de los 60 & # x02009min después de la EP. Además, demostramos que la exposición del ADN plasmídico a diferentes parámetros eléctricos no resultó en la fragmentación del ADN plasmídico. Goldberg obtuvo resultados similares, quien demostró que la exposición de ADN genómico aislado a EP de parámetros eléctricos utilizados para la electrotransferencia de genes no induce daño / fragmentación directa del ADN. 45

        El ADN plasmídico, que está presente durante la EP, neutralizó las ROS generadas.La oxidación del ADN en presencia de ROS que se generan durante el proceso metabólico normal en las células es un fenómeno bien conocido que ocurre naturalmente en todas las células. 40 Si la célula está expuesta a estrés oxidativo, aumenta la oxidación del ADN. Si el ADN plasmídico utilizado para la electrotransfección reacciona con las ROS generadas durante la EP, la detección de ROS por lucigenina debería, por tanto, reducirse. Demostramos que la quimioluminiscencia de lucigenina derivada de ROS se redujo cuando el ADN plasmídico estaba presente alrededor de las células durante la EP. La adición de 10 & # x02009 & # x003bcg de ADN plasmídico a las células evitó por completo la detección de ROS por lucigenina después de EP. Observamos el mismo efecto en la detección de ROS mediante la adición de antioxidantes como vitamina C y tempol a las células expuestas a EP. A la vista de estos datos, podemos asumir que los ROS generados interactuaron con el ADN plasmídico presente durante la EP de las células.

        En el siguiente paso, intentamos mejorar la eficiencia de la transfección mediante el uso de antioxidantes. La electrotransfección es un proceso de múltiples pasos 1 que requiere la formación de complejos de membrana de ADN-célula para una transfección efectiva. 46 La interacción entre las ROS generadas durante la aplicación de pulsos eléctricos y el ADN plasmídico complejado con la membrana celular podría, por lo tanto, afectar la eficiencia de la transfección. La adición de eliminadores de ROS, antioxidantes, a las células antes de la EP podría neutralizar las ROS generadas tan pronto como se formen y el ADN plasmídico en los complejos ADN-membrana celular no se vería afectado. En consecuencia, se podría mejorar la eficacia de la electrotransfección. De hecho, nuestro in vitro Los datos indican que la transfección de pEGFP-N1 en la línea celular C2C12 aumentó en 60 & # x00025 cuando se añadió tempol antes de EP, lo que indica que, al modular las ROS generadas, podemos afectar la eficacia de la transfección. Las ROS generadas debido a EP en la superficie celular deben afectar al ADN plasmídico muy rápidamente, ya que no hubo aumento en la eficiencia de transfección si se añadió tempol después de EP. Se ha informado de un efecto positivo de los antioxidantes, como el ácido ascórbico, sobre los niveles de expresión después de la electrotransfección en células vegetales, 47 pero hasta donde sabemos, no se ha informado de un aumento de la eficiencia de la electrotransfección en células animales. in vitro o en vivo después (debido a) la adición de antioxidantes.

        En vivo, en el músculo del ratón, tempol aumentó la eficiencia de la transfección en un 40 & # x00025. La eficacia de la transfección aumentó cuando se mezcló tempol con ADN plasmídico y se inyectaron juntos en el M. tibialis cranialis, que se expuso inmediatamente después a EP. El aumento fue evidente solo a una concentración de tempol de 12 m. El área transfectada aumentó pero no la cantidad de GFP en las células, lo que indica que se transfectaron más fibras musculares cuando el antioxidante estaba presente, mientras que la cantidad de ADN plasmídico introducido en una sola fibra no cambió en comparación con el control. En conjunto, eso significa que se indujo una mayor expresión de GFP (número de proteínas expresadas). Una dosis más baja probablemente no fue lo suficientemente alta para eliminar las ROS generadas suficientes para afectar la eficiencia de la transfección. A una dosis más alta, el efecto positivo del tempol sobre la eliminación de las ROS generadas por EP probablemente fue contrarrestado por la formación adicional de ROS causada por la peroxidación de lípidos iniciada por tempol, 48 resultando en un nivel similar de eficiencia de transfección como en los músculos de control expuestos a EP solo. Observamos el mismo efecto in vitro.

        Tempol se usa ampliamente como promotor del metabolismo de muchas ROS. Se ha utilizado en muchos estudios diferentes. in vitro y en vivo. In vitro se ha demostrado que puede preservar las mitocondrias frente al daño oxidativo. En vivo En muchos modelos preclínicos, se ha demostrado que tempol mejoró la supervivencia en varios modelos de choque en ratones, protegiendo muchos órganos, incluidos el corazón y el cerebro, del daño por isquemia / reperfusión, reduciendo las consecuencias del estrés oxidativo y la inflamación después de la radiación, reduciendo la presión arterial. etcétera. Sin embargo, en humanos, el compuesto solo se ha utilizado como agente tópico para prevenir la alopecia inducida por radiación. 48, 49 Hasta donde sabemos, el tempol no se ha utilizado como agente para aumentar la eficacia de la transfección. Las dosis de tempol utilizadas en nuestro estudio fueron más bajas que las dosis tóxicas informadas para ratones y ratas 49 y no se registraron efectos secundarios.

        El antioxidante tempol es, por tanto, un compuesto prometedor, que también se puede utilizar para mejorar la eficacia de la electrotransfección en los tejidos. El músculo es fácil de transfectar, sin embargo, existen otros tejidos, como la piel y, especialmente, los tumores, en los que una mayor eficacia de transfección daría como resultado un mejor efecto clínico. Se están investigando varios enfoques, especialmente en tumores, para aumentar la eficacia de la transfección, como la selección de parámetros de pulso, la modulación de la matriz extracelular, el intervalo de tiempo entre la inyección de ADN y la aplicación de EP, la preparación de plásmidos, etc. 15, 16, 18, 27, 28, 29, 50 En el presente estudio, demostramos la importancia de la generación de ROS después de EP en la eficiencia de la transfección y demostramos que el uso de tempol puede mejorar significativamente la electrotransfección en un tejido modelo y músculo.


        Discusión

        Aquí, hemos demostrado que cGAS es una proteína unida a la cromatina que restringe la HR y que esta función es independiente de su actividad enzimática o de la vía canónica STING-IFN-I. Mecánicamente, mostramos que cGAS dificulta la invasión de la hebra de ADN mediada por RAD51, un paso crítico en la HR, y que esta característica está relacionada con su capacidad para autooligomerizarse, compactando así el ADN bicatenario unido en complejos de orden superior resistentes a la invasión de los filamentos RAD51. . Este modo de regulación de la frecuencia cardíaca es quizás análogo al de proteínas como la histona enlazadora H1 que también promueve la compactación del ADN e impide la invasión de la plantilla de dsDNA homóloga por los filamentos RAD51 (Downs et al, 2003 Hashimoto et al, 2007 Murga et al, 2007 Machida et al, 2014). Este mecanismo es diferente al de Liu. et al (2018), que implica la translocación activa de cGAS desde el citosol al núcleo para impedir la HR a través de interacciones específicas con proteínas de reparación del ADN, incluidas PARP1 y H2AX. Por el contrario, encontramos que cGAS es una proteína unida a cromatina y que el co-aislamiento de cGAS con estas proteínas se deriva de asociaciones indirectas a través de puentes de cromatina unidos. Además, nuestro análisis de mutantes de cGAS, incluido el cGAS ΛDNA-Y215E que imita la fosforilación propuesta por Liu et al (2018) para controlar la importación nuclear de cGAS demuestra que las interacciones cGAS-ADN son el principio para la localización nuclear de cGAS y la inhibición de la reparación del ADN-HR.

        ¿Cuál es la relevancia biológica de la atenuación de la frecuencia cardíaca mediada por cGAS? Postulamos que en condiciones homeostáticas, cGAS generalmente puede funcionar como un regulador negativo para suprimir reordenamientos indeseables del genoma, incluida la translocación cromosómica, deleción, inversión o pérdida de heterocigosidad. Por otro lado, al inhibir la HR en las células en proliferación, como hemos demostrado, cGAS acelera la desestabilización del genoma y la muerte de las células bajo estrés genómico agudo. Si bien restringe la propagación de células con genomas defectuosos y, por lo tanto, potencialmente cancerosas, esta función de cGAS también contribuiría a los efectos nocivos del daño del ADN. Por ejemplo, aquí hemos demostrado que cGAS acelera la ablación de la médula ósea inducida por irradiación γ en vivo.

        La demostración en este documento de que el cGAS está unido a la cromatina y es experto en compactar el ADN en un estado de orden superior abre la puerta a más estudios para examinar si, además de su función reguladora de recursos humanos, el cGAS nuclear también afecta a otros procesos sensibles a los cambios en la dinámica de la cromatina. . Un tema igualmente importante es cómo se bloquea la actividad sintasa del cGAS unido a la cromatina para evitar la inmunopatología. Es probable que estén en juego múltiples mecanismos concurrentes. Un ejemplo es el ARN circular cia-cGAS recientemente informado que se une y bloquea el cGAS (Xia et al, 2018). Además, postulamos que, en contraste con el dsDNA desnudo, la unión al dsDNA en el contexto de la matriz de cromatina compleja puede ser desfavorable para la actividad de cGAS sintasa. También es posible que la inactividad del cGAS nuclear se deba en parte a modificaciones postraduccionales que aún no se han aclarado.

        Las desregulaciones en la respuesta al daño del ADN y el sistema inmunológico son el núcleo de muchas aflicciones humanas, incluidas infecciones, autoinmunidad, neurodegeneración, cáncer y trastornos asociados al envejecimiento. cGAS se ha implicado en muchas de estas condiciones de salud. La función dual de cGAS en el citosol como un sensor inmune innato y un regulador negativo de la reparación del ADN en el núcleo subraya la posición central de cGAS en las conversaciones cruzadas entre el sistema inmune innato y la respuesta al daño del ADN. Este trabajo abre nuevas vías para futuras investigaciones sobre cómo se regulan las funciones citosólicas y nucleares del cGAS y su impacto en la salud y la enfermedad. Por ejemplo, debido a que cGAS promueve tanto la tumorigénesis (Ahn et al, 2014 Dou et al, 2017 Bakhoum et al, 2018) e inmunidad antitumoral (Deng et al, 2014 Woo et al, 2014 Harding et al, 2017 Wang et al, 2017), señalar el alcance y el contexto biológico en el que las distintas funciones subcelulares de cGAS contribuyen a estos procesos, y cómo estas funciones de cGAS pueden manipularse, será beneficioso para lograr el resultado deseado de daños en el ADN y antiinmunitarios basados ​​en el sistema inmunológico. terapias tumorales.


        Contenido

        Tinción in vivo (también llamado tinción vital o tinción intravital) es el proceso de teñir tejidos vivos. Al hacer que ciertas células o estructuras adquieran colores contrastantes, su forma (morfología) o posición dentro de una célula o tejido se puede ver y estudiar fácilmente. El propósito habitual es revelar detalles citológicos que de otro modo no serían evidentes; sin embargo, la tinción también puede revelar dónde tienen lugar ciertas sustancias químicas o reacciones químicas específicas dentro de las células o tejidos.

        In vitro la tinción implica colorear células o estructuras que se han eliminado de su contexto biológico. A menudo, ciertas manchas se combinan para revelar más detalles y características que una sola mancha. En combinación con protocolos específicos para la fijación y preparación de muestras, los científicos y médicos pueden utilizar estas técnicas estándar como herramientas de diagnóstico consistentes y repetibles. Una contratinción es una tinción que hace que las células o estructuras sean más visibles, cuando no son completamente visibles con la tinción principal.

        • El cristal violeta tiñe tanto los organismos Gram positivos como los Gram negativos. El tratamiento con alcohol elimina el color violeta cristal de los organismos gram negativos únicamente. La safranina como contratinción se usa para colorear los organismos gram negativos que se decoloraron con el alcohol.

        Mientras están ex vivo, muchas células continúan viviendo y metabolizándose hasta que se "fijan". Algunos métodos de tinción se basan en esta propiedad. Las tinciones excluidas por las células vivas pero absorbidas por las células ya muertas se denominan tinciones vitales (p. Ej., Azul tripán o yoduro de propidio para las células eucariotas). Las que entran y tiñen las células vivas se denominan tinciones supravitales (p. Ej., Azul de metileno nuevo y azul de cresilo brillante para la tinción de reticulocitos). Sin embargo, estas manchas son eventualmente tóxicas para el organismo, algunas más que otras. En parte debido a su interacción tóxica dentro de una célula viva, cuando las tinciones supravitales ingresan a una célula viva, pueden producir un patrón característico de tinción diferente de la tinción de una célula ya fija (p. Ej., Apariencia de "reticulocitos" versus "policromasia" difusa). Para lograr los efectos deseados, los tintes se utilizan en soluciones muy diluidas que van desde 1: 5 000 a 1: 500 000 (Howey, 2000). Tenga en cuenta que se pueden utilizar muchos tintes tanto en células vivas como en células fijas.

        Un microscopio común utilizado en la tinción es el microscopio de campo brillante. El microscopio de campo brillante se clasifica como microscopio óptico debido al iluminador que produce luz para crear un fondo brillante. Estos microscopios suelen ser binoculares, lo que significa que hay dos oculares que suelen tener un aumento de diez veces. Cuando se observan organismos teñidos con un aumento de cien veces, se necesita aceite para ayudar a crear una vista más clara debido a la distorsión de la resolución de la refracción de la luz, que se vuelve increíblemente pronunciada con un aumento alto. [1]

        Los pasos preparatorios involucrados dependen del tipo de análisis planeado. Es posible que se requieran algunos o todos los siguientes procedimientos.

        Montajes húmedos: los montajes húmedos se utilizan para ver organismos vivos y se pueden hacer con agua y ciertas manchas. El líquido se agrega al portaobjetos antes de agregar el organismo y se coloca un cubreobjetos sobre la muestra en el agua y la tinción para ayudar a contenerla dentro del campo de visión. [1]

        Fijación–Que a su vez puede constar de varios pasos– tiene como objetivo preservar al máximo la forma de las células o tejidos implicados. A veces, la fijación por calor se usa para matar, adherir y alterar la muestra para que acepte las manchas. La mayoría de los fijadores químicos (productos químicos que provocan la fijación) generan enlaces químicos entre proteínas y otras sustancias dentro de la muestra, aumentando su rigidez. Los fijadores comunes incluyen formaldehído, etanol, metanol y / o ácido pícrico. Se pueden incrustar trozos de tejido en cera de parafina para aumentar su resistencia mecánica y estabilidad y para que sea más fácil cortarlos en rodajas finas. [2] Mordaz: Estos son agentes químicos que tienen el poder de producir tintes para teñir materiales que de otra manera no se pueden manchar.


        Daño y reparación del ADN inducido por peróxido de hidrógeno mediante la diferenciación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano.

        Antes de la década de 1980, el tejido adiposo se consideraba solo un depósito de almacenamiento pasivo de energía. Sin embargo, cuando se confirmó su participación en el metabolismo de las hormonas sexuales, se reconoció al tejido adiposo como un órgano endocrino importante [1]. Se produjo un avance sustancial cuando Zuk et al. Describieron por primera vez una nueva fuente de células madre adultas, llamadas células madre derivadas de tejido adiposo. [2] como células multipotentes autorrenovables [3]. Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (hADMSC) se aíslan de los tejidos adiposos (grasa) mediante lipoaspiración o biopsia. Los lipoaspirados representan una mezcla heterogénea de tipos de células, que incluyen adipocitos, células endoteliales, músculo liso, pericitos y células progenitoras [2]. Estas propiedades hacen de las hADMSC una herramienta potencial para la terapia en las clínicas [4] y, en particular, para el trasplante de células autólogas. Sin embargo, la baja tasa de supervivencia y el aumento de la muerte celular después de la implantación en el tejido lesionado sugieren que las hADMSC son dañadas por el microambiente local probablemente debido al estrés oxidativo sostenido con la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [5, 6]. Es bien sabido que las ROS desempeñan un papel en el crecimiento y la homeostasis de las MSC incluso cuando se generan como subproductos del metabolismo energético normal. Químicamente, el peróxido de hidrógeno ([H2] [O2]) es un ROS poco reactivo en ausencia de iones de metales de transición, sin embargo, porque en los sistemas biológicos se produce de manera ubicua y presenta una mitad relativamente larga. life, [H2] [O2] cumple los requisitos previos para servir como mensajero intracelular y actuar como molécula de señalización celular [7]. En términos químicos, [H2] [O2] puede actuar como un agente oxidante suave o como un agente reductor suave, pero no oxida fácilmente la mayoría de las moléculas biológicas, incluidos los lípidos, el ADN y las proteínas. a menos que estos últimos tengan grupos tiol hiperreactivos o residuos de metionina [8]. Debido a su modo de acción, [H2] [O2] puede inducir distintas respuestas dependiendo del tipo de célula. En este estudio, exploramos la capacidad de [H2] [O2] para inducir daño y reparación del ADN en hADMSCs cuando proliferan y en diferentes etapas de diferenciación de adipocitos. Aunque todas las células vivas cuentan con una gran cantidad de mecanismos de reparación del ADN para abordar diferentes lesiones del ADN y preservar la integridad genómica, se espera que las células madre mesenquimales tengan una fuerte respuesta al daño del ADN debido a sus notables habilidades de autorrenovación y diferenciación en diferentes tipos de células funcionales. En el presente estudio, investigamos específicamente si la respuesta al daño del ADN generado oxidativamente se modula durante la diferenciación adipogénica de hADMSC. Mostramos que las hADMSC reparan las roturas del ADN y los sitios lábiles a los álcalis de manera muy eficiente cuando proliferan, pero que su capacidad de reparación disminuye durante la diferenciación de los adipocitos. Curiosamente, los adipocitos mantienen su capacidad para reparar sitios de ADN glicosilasa (Fpg) de formamidopirimidina, incluyendo 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoguanina), 8-oxoadenina, aflatoxina B1-fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxi-uracilo [9, 10].

        2.1, Cultivo celular de hADMSC. Se cultivaron hADMSC normales (ATCC [R] PCS-500-011 [TM]) en un pase temprano (pase 4). Se prepararon cultivos celulares usando medio Gibco MesenPRO RS ™ (número de catálogo 12746-012) preparado de acuerdo con las especificaciones del proveedor y se incubaron a 37 ° C y 5% C [O2]. Se realizaron cambios de medio cada 48 horas y se trataron a

        Confluencia del 85%. Para la recolección, los cultivos se trataron con 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco, número de cat. 25300-054) a 37 ° C y 5% de C [O2] durante 3 minutos (tiempo suficiente para obtener un total suspensión del cultivo). Luego se transfirieron a PBS y se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos. Posteriormente fueron manipulados en función de la prueba a realizar.

        2.2. Se utilizaron marcadores de superficie hADMSC, anti-CD45, anti-CD146, anti-CD105 y anti-CD90 (kit de citometría de flujo multicolor de células madre mesenquimales humanas, número de catálogo FMC002 de R & ampD Systems) para la determinación inmunofenotípica de hADMSC antes y después del adipocito diferenciación, siguiendo las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Terapia Celular [11]. Se siguió el protocolo indicado por el proveedor. Las muestras de células se lavaron con tampón de tinción y luego se bloquearon. A continuación, se añadió el anticuerpo o el correspondiente anticuerpo de control de isotipo. La incubación se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y se eliminó cualquier exceso de anticuerpo lavando con tampón de tinción antes del análisis. Las adquisiciones se realizaron en un citómetro de flujo Blue / Red Attune (BD Biosystems).

        2.3. Tratamiento con peróxido de hidrógeno, se trataron hADMSCs a una densidad de 4000 / [cm2]. El tratamiento en bolo de [H2] [O2] (0, 50, 100, 150 y 200 pM) duró 2 horas, y el tiempo de recuperación en medio fresco fue de 24 h después del tratamiento. Para ser precisos, las correspondientes dosis tóxicas incipientes de [H2] [O2] fueron 0, 152,5, 305, 457,5 y 600 nmol de [H2] [O2] ] / mg de proteína celular.

        Las células con diferentes duraciones de diferenciación (días 6, 12 y 14) se trataron durante 2 horas con [H2] [O2] 100 pM (305 nmol / mg de proteína celular), y el tiempo de recuperación fue 24 h postratamiento en medio fresco.

        Las células se recolectaron con tripsina-EDTA, la suspensión celular obtenida se utilizó para realizar la prueba de actividad lisosómica, determinación de daño del ADN (roturas y lesiones oxidativas) y capacidad de reparación del ADN.

        2.4. Prueba de actividad lisosómica. Se usó una prueba de actividad lisosómica para determinar la viabilidad celular y se realizó usando la tinción FDA-Et-Br (diacetato de fluoresceína-bromuro de etidio). La suspensión de células se mezcló 1: 1 con solución colorante y el análisis se realizó mediante microscopía de fluorescencia (Olympus BMX-60 con un filtro UM61002). La FDA es absorbida por células que a través de la actividad de la esterasa transforman la FDA no fluorescente en un metabolito verde fluorescente. Los núcleos de las células muertas se tiñen luego con bromuro de etidio y se visualizan como fluorescencia roja.

        2.5. Especies reactivas de oxígeno, esta técnica se basa en la oxidación dependiente de ROS de dihidrorrodamina 123 (DHR123, Calbiochem, número de cat. 309825) a rodamina 123 (Sigma-Aldrich, número de cat. R-8004). Se cultivaron hADMSC o células de adipocitos en las condiciones requeridas. A continuación, se eliminó el medio y se lavó con PBS. Las células se recogieron y se contaron en un contador de células automatizado Moxi (ORFLO, Montana, EE. UU.). Se recogieron alícuotas equivalentes a 2 x [105] células y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos. Se vertió el sobrenadante y se vertieron 180 μl de tampón A (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgS [O4] 0,8 mM x 7 [H2] O, Ca [Cl2] 1,8 mM .2], glucosa 5 mM y HEPES 15 mM) y 20 µl de dihidrorrodamina 123 (1 mM) se añadieron al sedimento. Esta mezcla se colocó en una placa de 96 pocillos y se leyó usando un lector de fluorescencia (BioTek FLx8000) a una longitud de onda de 505 nm. Los resultados se interpolaron en una curva de rodamina 123 en tampón A a concentraciones de 0-10 µM. Los datos se expresaron como nmol de rodamina 123/2 x [105] células.

        2.6. Roturas de ADN y daño oxidativo del ADN, el daño del ADN se determinó mediante un ensayo de electroforesis en gel de células individuales alcalinas para evaluar la presencia de roturas de ADN producidas, que incluyen roturas de hebras simples y dobles, así como sitios lábiles a los álcalis en células hADMSC que proliferan o durante la diferenciación ( control, tratamiento con [H2] [O2] y 24 h postratamiento) [12, 13]. Para cada condición experimental, se mezclaron al menos 10.000 células con 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) al 0,5%. Las células se cargaron en portaobjetos de microscopio en capas previas con 200 µl de agarosa de punto de fusión normal al 0,5% y se cubrieron con una tercera capa de agarosa LMP al 0,5%. Brevemente, después de la lisis de las células a 4 [grados] C durante al menos 1 h en un tampón que consta de NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM y Tris 10 mM, pH 10, complementado con DMSO al 10% y Triton X- 100, los portaobjetos se colocaron en una cámara de electroforesis horizontal con solución tampón de funcionamiento (NaOH 300 mM, [Na2] EDTA 1 mM, pH & gt 13). Los portaobjetos permanecieron en el tampón de electroforesis durante 20 minutos para permitir que el ADN se desenrolle y revele los sitios lábiles a los álcalis (sitios AP). La electroforesis se realizó durante 20 min a 300 mA y 25 V,

        0,8 V / cm. Todos los pasos se realizaron en la oscuridad para evitar la luz directa. Después de la electroforesis, los portaobjetos se retiraron suavemente y se enjuagaron con tampón de neutralización (Tris 0,4 M, pH 7,5) a temperatura ambiente durante 15 min, se deshidrataron con etanol absoluto durante 15 min y se secaron al aire. Se añadió bromuro de etidio (20 µl de solución de 20 mg / ml) a cada portaobjetos y se colocó un cubreobjetos sobre el gel. Las células individuales se visualizaron con un aumento de 20x con un microscopio Olympus BX-60 con accesorios de fluorescencia (filtro de excitación de 515-560 nm, filtro de barrera de 590 nm) y se determinó el daño del ADN usando el software Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Para evaluar la migración del ADN, se puntuaron 50 nucleoides por portaobjetos (300 nucleoides en total por condición) para cada condición experimental. Los datos se dividieron en cinco categorías según la puntuación del momento de la cola de oliva (OTM). Se contó el número total de nucleoides en cada categoría y se multiplicó por un valor asignado de 0 a 4 según la clase de daño. Se calculó la suma de todas las categorías y se consideró el índice de daño. Se esperaba que la puntuación general variara entre 0 y 400 unidades arbitrarias. Alternativamente, se utilizó la puntuación OTM obtenida por el software.

        El daño oxidativo del ADN se identificó mediante la incubación con formamidopirimidina ADN glicosilasa (Fpg) para revelar 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoguanina), 8-oxoadenina, aflatoxina B1-fapy-guanina, 5-hidroxi-citosina y 5 -hidroxiuracilo [9, 10]. Brevemente, después del tratamiento, las células sumergidas en LMP agarosa al 1% se colocaron en capas sobre portaobjetos de microscopio recubiertos previamente con agarosa de punto de fusión normal al 1% y se sumergieron en tampón de lisis durante al menos 1 ha 4 ° C. A continuación, los portaobjetos se aclararon con solución tampón (Tris-base 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,6) durante 5 minutos. Las lesiones oxidativas fueron digeridas por Fpg (Trevigen, CA, EE. UU.), En condiciones ideales de pH y temperatura sugeridas por el proveedor. Se colocaron cubreobjetos sobre los portaobjetos y se incubaron durante 30 min a 37 ° C en una atmósfera humidificada. Se incluyó un conjunto de portaobjetos con células de todas las condiciones experimentales en tampón (sin enzima) para confirmar que las roturas de la cadena de ADN eran específicas de la enzima. Después de la incubación enzimática, los portaobjetos se enjuagaron con solución tampón (base Tris 50 mM, EDTA 200 mM, pH 7,6) y se sometieron a electroforesis cometa convencional (

        0,8 V / cm) durante 20 min sin desenrollar la incubación. La deshidratación, la tinción y el análisis se realizaron como se describió anteriormente.

        Para determinar la capacidad de reparación del ADN, aplicamos

        [expresión matemática no reproducible] (1)

        2.7. Diferenciación de adipocitos. Cultivos de hADMSC (pase 4) alcanzados

        Confluencia del 80%. Luego se pasaron a una placa a una densidad de 18.000 células / [cm2] en Medio MesenPRO RS ™ Gibco (número de catálogo 12746-012). Las células se incubaron a 37 ° C y 5% C [O2] durante 48 h antes de iniciar la diferenciación. A continuación, se realizó un lavado con PBS para eliminar los componentes del medio anterior y se añadió el kit de diferenciación de adipogénesis StemPro®, Gibco (número de catálogo A10070-01). Los cambios de medio se establecieron cada 72 hy se incubaron a 37 ° C y 5% C [O2] hasta el día 14 de diferenciación de adipocitos. Para la cosecha, los cultivos de los días 6, 12 y 14 se trataron con tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco, número de catálogo 25200-056) a 37 ° C y 5% C [O2] durante 3 minutos. Con la ayuda de un raspador de plástico se obtuvo una suspensión de cultivo, que se transfirió a PBS para centrifugar a 300 xg durante 5 minutos. Posteriormente fueron manipulados en función de la prueba a realizar.

        2.8. hFATP-1. Se utilizó anti-hFATP-1 (proteína transportadora de ácidos grasos humanos 1) (número de catálogo IC3304P de R & ampD Systems) como marcador de superficie de la diferenciación de adipocitos [14]. Determinación de hFATP-1 antes y después de la diferenciación de adipocitos. Se siguió el protocolo indicado por el proveedor. Se usó una solución de saponina (0,1% p / v de saponina y 0,05% de Na [N3] en PBS) para la permeabilización. A continuación, se añadió el anticuerpo o el correspondiente anticuerpo de control de isotipo. La incubación se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y se eliminó cualquier exceso de anticuerpo lavando con tampón de tinción antes del análisis. Las adquisiciones se realizaron en un citómetro de flujo Blue / Red Attune (BD Biosystems).

        2.9. Análisis del ciclo celular. El ciclo celular se evaluó usando un agente intercalante de ADN (yoduro de propidio IP) y RNasa A para disminuir la inespecificidad (Muse Cell Cycle Kit, número de catálogo MCH100106). Después de la recolección, las células se lavaron con PBS y luego se fijaron con etanol al 70% durante al menos 48 h. A continuación, las células se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos y se lavaron con PBS. Se añadió el IP y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, la adquisición se realizó mediante un citómetro FACScan (BD Biosystems) de la unidad de citofluorometría del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. A continuación, se determinó la fase del ciclo celular de las poblaciones celulares de acuerdo con el contenido desoxirribonucleico.

        2.10. Tinción Oil Red O. Para confirmar la diferenciación de adipocitos, las hADMSC se sembraron en placas de 12 pocillos. La diferenciación se inició cuando la confluencia fue del 80%. Las tinciones correspondientes se realizaron el día 14 de diferenciación. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron con paraformaldehído al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron dos lavados con PBS, y se añadió Oil Red O (Trevigen nº de cat. 5010-024-05) preparado según el proveedor seguido de incubación durante 30 minutos con agitación suave y protección de la luz. A continuación, se llevaron a cabo dos lavados adicionales y se añadió PBS para la visualización del microscopio invertido (Olympus IX50-S8F2). Para la cuantificación, luego se eliminó el PBS, y el colorante se extrajo con isopropanol y se incubó durante 10 minutos con agitación y protección de la luz. El sobrenadante se colocó finalmente en una celda de cuarzo (Quartz Spectrophotometer Cell Semi Micro, 9-Q-10mm, Bio-Rad Laboratories), y se midió la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech) a 500 nm usando isopropanol como blanco para obtener la acumulación relativa de lípidos.

        2.11. Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con el software SigmaStat 3.5 y SigmaPlot 10.0. Se utilizaron pruebas no paramétricas para los análisis de electroforesis en gel de celda única, Kruskal-Wallis (ANOVA unidireccional en rangos) se utilizó para todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (prueba de Dunn), y para los datos con distribución normal, se realizaron pruebas t de Student para evaluar actividad lisosomal, niveles de ROS, marcadores de superficie y ciclo celular.

        3.1. Inmunofenotipo de hADMSC y caracterización de la diferenciación de adipocitos. Las células madre mesenquimales (MSC) se definen funcionalmente por su capacidad de autorrenovación y su capacidad para diferenciarse en múltiples tipos de células (adipocitos, condrocitos y osteocitos), que se caracterizan fenotípicamente como positivas para CD105 y CD90 y negativas para CD146 y CD45. . El porcentaje de células que presentan estos marcadores de superficie característicos se muestra en la Figura 1 (a). También se presenta el porcentaje de células positivas para la proteína transportadora de ácidos grasos humanos 1 (hFATP1) para mostrar la fuente del tejido, así como el grado de diferenciación adipogénica. La distribución de células a lo largo del ciclo celular confirma además que se logra una diferenciación eficiente como lo demuestra el aumento en el porcentaje de células en G1 y una disminución en el porcentaje de células en las fases S y G2 / M en adipocitos en comparación con los indiferenciados. células (hADMSC) (Figura 1 (b)). Además, la acumulación relativa de lípidos medida por la tinción de grasa corporal con Oil Red O (Figuras 1 (e) -1 (h)) muestra la acumulación de lípidos después de 14 días (cuando la diferenciación de adipocitos es completa) en comparación con la de hADMSC (Figura 1 (I)).

        3.2. Daño del ADN inducido por [H2] [O2] y capacidad de reparación en hADMSC. Las hADMSC expuestas a [H2] [O2] durante 2 h mostraron una respuesta dependiente de la dosis en la prueba de viabilidad metabólica así como en el ensayo de nivel de ROS. En particular, se observó una ligera disminución en la actividad de esterasa a concentraciones superiores a 100 [micro] M y fue paralela a un aumento en el nivel de ROS (Figura 2 (a)). El daño del ADN inducido por [H2] [O2] como roturas del ADN y sitios lábiles a los álcalis, así como lesiones oxidativas, muestra una clara respuesta dependiente de la dosis (Figura 2 (b)). Se observa una inducción relativamente mayor de roturas del ADN y sitios lábiles a los álcalis con respecto a las lesiones oxidativas del ADN. El daño del ADN puede conducir a la inestabilidad del genoma cuando no se repara. Por lo tanto, determinamos la capacidad de reparación del ADN a través del nivel de daño persistente del ADN, tanto a través de roturas del ADN como de lesiones oxidativas del ADN, después de 24 h postratamiento (Figuras 3 (a) y 3 (b), imágenes representativas en el Material Suplementario 1). El análisis de la tasa de reparación se muestra en las Figuras 3 (c) y 3 (d). En particular, en las hADMSC, las rupturas del ADN inducidas por [H2] [O2] se repararon de manera más eficiente que las lesiones oxidativas (reparación del 77% frente al 45% para las rupturas del ADN y las lesiones oxidativas del ADN, respectivamente, tras la exposición a 200 [micro] M [H2] [O2]) (Figuras 3 (c) y 3 (d)). En particular, 24 h después del tratamiento con 100 [micro] M [H2] [O2], una concentración que podría alcanzarse en las CMM injertadas, la reparación fue completa para ambos tipos de lesiones.

        3.3. Roturas de ADN y acumulación de lesiones oxidativas mediante diferenciación de adipocitos. El daño del ADN determinado como rupturas a través de la diferenciación de adipocitos muestra un aumento en función del tiempo de diferenciación con un aumento significativo ya después de 6 días (hADMSC 6D) (Figura 4 (a), imágenes en la Figura complementaria 2). Del mismo modo, las lesiones de ADN oxidativo también aumentaron, aunque este aumento fue significativo en las etapas finales de diferenciación, desde el día 12, y hasta la diferenciación completa (14 días) (Figura 4 (b), imagen en Figura complementaria 2). Como se observa en el caso de las hADMSC, el nivel de roturas del ADN es relativamente más alto que el de los sitios sensibles a Fpg. Además, demostramos el contraste entre el daño del ADN basal y las lesiones oxidativas según categorías que muestran adipocitos indiferenciados (U) y diferenciados terminalmente (D) (Figura 4 (c)) e incremento de los niveles de ROS (Figura 4 (d), imágenes de cometas en la Figura complementaria 2).

        3.4. Daño del ADN inducido por [H2] [O2] y capacidad de reparación a través de la diferenciación de adipocitos. La relevancia del daño del ADN acumulado a través de la diferenciación de adipocitos se evaluó mediante la respuesta de los adipocitos a [H2] [O2] y la medición de la capacidad de reparación del ADN 24 h después del tratamiento. La exposición a [H2] [O2] 100 pM no afecta la viabilidad de hADMSC (Tabla 1) por lo tanto, esta condición experimental fue seleccionada para monitorear la inducción y reparación del daño del ADN (Figuras 5 (a) y 5 (b), imágenes en la Figura complementaria 3). La capacidad de [H2] [O2] para inducir roturas del ADN ha mostrado un comportamiento similar durante la diferenciación a pesar de que los valores eran más altos que en las hADMSC indiferenciadas (Figura 5 (a)) mientras tanto, la capacidad de [ H2] [O2] para inducir lesiones oxidativas del ADN fue mayor sólo en las últimas etapas de diferenciación de adipocitos (hADMSC 12D y adipocitos) (Figura 5 (b)).

        La capacidad de reparación del ADN indica que mientras las roturas se reparan por completo en las hADMSC indiferenciadas, las reparaciones de este tipo de daño en los adipocitos caen drásticamente al 10% (Figura 5 (c)). Se observaron cambios menos dramáticos para la reparación de lesiones oxidativas con tasas de reparación del 92% y 50% en hADMSC y adipocitos indiferenciados, respectivamente (Figura 5 (d)).

        Las hADMSC representan una fuente potencial de MSC para la terapia celular [4]. Como era de esperar, estas células mantienen la capacidad de diferenciarse en condrocitos, osteoblastos o adipocitos, como lo demuestra la expresión de marcadores de superficie específicos [11, 14]. Además, expresan la proteína transportadora de ácidos grasos humanos 1 (hFATP-1), que es estimulada por la insulina y facilita el transporte de ácidos grasos a través de la membrana celular para promover la acumulación de ácidos grasos de cadena larga (LCFA). Esto explica la formación de vesículas grasas durante la diferenciación de adipocitos (Figura 1). En particular, encontramos un aumento en la expresión de [CD146.sup.-] en hADMSCs en comparación con los adipocitos, que también se conoce como molécula de adhesión de melanoma y podría explicar el aumento de las características de capacidad de adhesión de los adipocitos. Se espera que el daño al ADN se elimine de manera eficiente en las células madre [15, 16] y, de hecho, las hADMSC reparan de manera eficiente las roturas del ADN y las lesiones oxidativas del ADN. Nuestros resultados se obtuvieron utilizando un pase celular temprano (4º pase) y están en línea con otros estudios que emplearon células madre derivadas de tejido adiposo obtenidas mediante liposucción de médula ósea o femoral / abdominal [17, 18].

        Para proporcionar nuevos conocimientos sobre el uso de hADMSC en terapia celular, investigamos su respuesta al daño oxidativo generado en el ADN inducido por un flujo fisiológico de peróxido de hidrógeno. Experimentalmente in vitro, la reproducción del flujo de peróxido de hidrógeno es compleja, sin embargo, está más cerca de lo que es probable que experimenten las células in vivo. En este trabajo, solo estudiamos el efecto desencadenado por una dosis única de 100 µM. Estas células, así como su contraparte diferenciada, parecen ser relativamente resistentes a [H2] [O2] porque no se observó citotoxicidad hasta 100 [micro] M (Tabla 1 y Figura 2 (a)), una dosis que es citotóxica en una amplia variedad de animales, plantas y células bacterianas en cultivo [8, 13]. En términos de capacidad de reparación del ADN, las hADMSC son completamente competentes en la reparación de roturas y lesiones oxidativas inducidas por niveles de peróxido de hidrógeno de hasta 100 [micro] M. Por encima de esta dosis (& gt 100 [micro] M), se observa una inhibición significativa de la reparación del ADN (Figura 3), lo que sugiere que el control del entorno ROS es un factor clave para la supervivencia de las células madre. Algunos estudios informan que las células madre y las MSC requieren reparación de DSB (rotura de doble hebra) para abordar el daño del ADN [13, 15, 18]. Khan y col. recientemente sugirieron que solo las células con una respuesta eficiente al daño del ADN pueden ingresar a la diferenciación adipogénica, propusieron que el SNEV (factor de evasión de la senescencia) regula la adipogénesis, actuando como un punto de control para la acumulación de daño del ADN en células madre derivadas de adipocitos humanos después del tratamiento agudo con hidrógeno peróxido [17]. Por lo tanto, una conversación cruzada entre DDR y diferenciación proporcionaría a las células madre un estricto control de la estabilidad genética antes de experimentar la autorrenovación y la diferenciación [18, 19]. Aquí, abordamos cómo las hADMSCs responden a una agresión oxidativa ([H2] [O2] 100 [micro] M) cuando proliferan y durante la diferenciación de adipocitos. La respuesta al daño del ADN endógeno así como al daño del ADN inducido por [H2] [O2] refleja una disminución gradual en la capacidad de reparación durante el programa de diferenciación. Esta disminución de la capacidad de reparación es más marcada que los cambios en los niveles de ROS intracelulares, que sólo se modifican ligeramente. De manera similar, se ha informado previamente de una disminución en la capacidad de reparación del daño oxidativo durante la miogénesis, así como durante la diferenciación neuronal [13, 20]. Adicionalmente, queremos enfatizar que nuestro protocolo solo refleja los sitios sensibles al Fpg, ya que solo hacemos la digestión enzimática inmediatamente después de la lisis celular y realizamos el cambio electroforético es decir, no realizamos incubación alcalina para desenrollar esto evita la generación de los sitios AP junto con las lesiones oxidativas digeridas por el Fpg. Cuando se analiza la capacidad de reparación a lo largo de la adipogénesis en función del tipo de lesión del ADN, surge un escenario interesante: mientras que la reparación de la rotura del ADN está completamente afectada, la eliminación de los sitios sensibles a Fpg disminuye pero permanece activa (reducción del 50%) en los adipocitos. Las diversas lesiones de la base del ADN se eliminan mediante enzimas reparadoras específicas para evitar consecuencias nocivas.Los sitios abásicos son reparados por APE1 para evitar el bypass mutagénico, el estancamiento de la horquilla de replicación o la conversión a roturas de doble hebra. La 7-metilguanina y la 3-metiladenina se reparan mediante la N-metilpurina ADN glicosilasa para generar la formación de un sitio básico, la apertura del anillo a FaPy-G, el estancamiento de la replicación o la inestabilidad cromosómica. Los SSB son reparados por la maquinaria de reparación de rotura de hebra única (SSBR) para evitar el colapso de la horquilla de replicación o la conversión a DSB. La 8-oxoguanina es la lesión de ADN oxidado mutagénico más común y es reparada por OGG1 para evitar el apareamiento incorrecto de bases mutagénicas. Sin embargo, las lesiones de ADN generadas por oxidación no solo son un factor de riesgo mutagénico, sino también un marcador regulador (para una revisión, ver [21]). Por tanto, la acumulación de lesiones oxidativas del ADN también puede ser de gran preocupación para las células que no se replican, como los adipocitos diferenciados terminalmente que tienen que mantener la integridad de los genes esenciales para su función. Esto puede explicar por qué la reparación de las lesiones del ADN generadas oxidativamente permanece activa (aunque reducida) en los adipocitos. Si la reparación acoplada a la transcripción de las lesiones de la base oxidada [22, 23] está involucrada, merece una mayor investigación.

        En medicina regenerativa, el uso de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano es extenso; sin embargo, se sabe poco sobre su respuesta al daño del ADN y, en particular, a las especies reactivas de oxígeno (ROS) que están presentes en el microambiente de implantación. El papel de estos ROS en el microambiente se puede abordar en parte de forma experimental mediante el tratamiento de un bolo de peróxido de hidrógeno. El presente estudio es la primera evidencia de roturas de ADN y daño oxidativo del ADN acumulado por adipogénesis, en concordancia con el aumento de biomarcadores adipogénicos como hFATP-1, CD 146 y formación de gotitas lipídicas. Además, mostramos la mayor vulnerabilidad al peróxido de hidrógeno en la diferenciación adipogénica y algunas particularidades interesantes en la capacidad de reparación del ADN que surgen en función de las lesiones específicas del ADN. Si bien la reparación de la rotura del ADN está completamente afectada, la eliminación de los sitios sensibles a Fpg disminuye pero permanece activa (reducción del 50%) en los adipocitos. La eliminación de las lesiones oxidativas del ADN tiene una función principalmente protectora; sin embargo, nuestra propuesta es que todos los sitios sensibles a Fpg restantes realicen las funciones reguladoras en la transducción de señales y la regulación transcripcional requerida por células especializadas, como los adipocitos diferenciados terminalmente.

        Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este manuscrito.

        Este trabajo se deriva de la estancia sabática de Mahara Valverde en el Istituto Superiore di Sanita, Roma y fue realizado con el apoyo de PASPA-DGAPA-UNAM. Jonathan Lozano-Salgado recibió una beca CONACyT. Los autores agradecen al Dr. Carlos Castellanos por el apoyo a la adquisición de citometría.

        Figura complementaria 1: daño del ADN inducido por [H2] [O2] y capacidad de reparación en hADMSC. 2 h de tratamiento con peróxido de hidrógeno utilizando 0 a 200 [micro] M y capacidad de reparación presentada como restos de daño en el ADN después de 24 h postratamiento. Imágenes de cometas con un aumento de 4x adquiridas por Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Los detalles metodológicos se muestran en la sección Material y métodos. Figura complementaria 2: acumulación de daño en el ADN a través de la diferenciación de adipocitos de hADMSC. Seguimiento de diferenciación en el día 0 = hADMSC, día 6 = hADMSC 6D, día 12 = hADMSC 12D y día 14 = adipocitos. Imágenes de cometas con un aumento de 4x adquiridas por Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Los detalles metodológicos se muestran en la sección Material y métodos. Figura complementaria 3: Daño del ADN inducido por [H2] [O2] y capacidad de reparación a través de la diferenciación de adipocitos. El tratamiento con peróxido de hidrógeno utilizando 100 pM durante 2 horas y la capacidad de reparación se presentó como restos de daño en el ADN a las 24 horas del tratamiento. Seguimiento de diferenciación en el día 0 = hADMSC, día 6 = hADMSC 6D, día 12 = hADMSC 12D y día 14 = adipocitos. Imágenes de cometas con un aumento de 4x adquiridas por Komet 5.0 (Kinetic Imaging Ltd.). Los detalles metodológicos se muestran en la sección Material y métodos.

        [1] A. Bajek, N. Gurtowska, J. Olkowska, L. Kazmierski, M. Maj y T. Drewa, "Células madre derivadas de tejido adiposo como herramienta en terapias basadas en células", Archivum Immunologiae et Therapiae Experimental, vol. 64, no. 6, págs. 443-454, 2016.

        [2] P. A. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno et al., "Células multilinaje del tejido adiposo humano: implicaciones para las terapias basadas en células", Tissue Engineering, vol. 7, no. 2, págs. 211-228, 2001.

        [3] P. A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian et al., "El tejido adiposo humano es una fuente de células madre multipotentes", Biología molecular de la célula, vol. 13, no. 12, págs. 4279-4295, 2002.

        [4] C.-J. Li, L.-Y. Sun y C.-Y. Pang, "Protección sinérgica de N-acetilcisteína y ácido ascórbico 2-fosfato en células madre mesenquimales humanas contra mitoptosis, necroptosis y apoptosis", Scientific Reports, vol. 5, no. 1, artículo 9819, 2015.

        [5] K. Froelich, J. Mickler, G. Steusloff et al., "Aberraciones cromosómicas y roturas monocatenarias de ácido desoxirribonucleico en células madre derivadas de tejido adiposo durante la expansión a largo plazo in vitro", Citoterapia, vol. 15, no. 7, págs. 767-781, 2013.

        [6] K. B. Choo, L. Tai, K. S. Hymavathee et al., "Senescencia prematura inducida por estrés oxidativo en células madre mesenquimales derivadas de gelatina de Wharton", Revista Internacional de Ciencias Médicas, vol. 11, no. 11, págs. 1201-1207, 2014.

        [7] R. Breton-Romero y S. Lamas, "Señalización de peróxido de hidrógeno en células endoteliales vasculares", Redox Biology, vol. 2, págs. 529-534, 2014.

        [8] B. Halliwell, M. V. Clement y L. H. Long, "Peróxido de hidrógeno en el cuerpo humano", FEBS Letters, vol. 486, no. 1, págs. 10-13, 2000.

        [9] J. Tchou, V. Bodepudi, S. Shibutani et al., "Especificidad de sustrato de la proteína Fpg. Reconocimiento y escisión del ADN dañado por oxidación", The Journal of Biological Chemistry, vol. 269, no. 21, págs. 15318-15324, 1994.

        [10] Z. Hatahet, YW Kow, AA Purmal, RP Cunningham y SS Wallace, "Nuevos sustratos para enzimas antiguas. La 5-hidroxi-2f -desoxicitidina y la 5-hidroxi-2, -desoxiuridina son sustratos para la endonucleasa III de Escherichia coli y formamidopirimidina ADN N-glicosilasa, mientras que 5-hidroxi-2, -desoxiuridina es un sustrato para uracilo ADN N-glicosilasa, "The Journal of Biological Chemistry, vol. 269, no. 29, págs. 18814-18820, 1994.

        [11] P. Bourin, BA Bunnell, L. Casteilla et al., "Células estromales de la fracción vascular estromal derivada del tejido adiposo y cultivo de células madre / estromales derivadas del tejido adiposo expandidas: declaración conjunta de la Federación Internacional de Terapéutica y ciencia (IFATS) y la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), "Citoterapia, vol. 15, no. 6, págs.641-648, 2013.

        [12] E. Rojas, M. C. López y M. Valverde, "Metodología y aplicaciones del ensayo de electroforesis en gel de celda única", Revista de cromatografía B: Ciencias y aplicaciones biomédicas, vol. 722, no. 1-2, págs. 225-254, 1999.

        [13] P. Ramos-Espinosa, E. Rojas y M. Valverde, "Respuesta diferencial al daño del ADN a los rayos UV y al peróxido de hidrógeno dependiendo de la etapa de diferenciación en un modelo de neuroblastoma", NeuroToxicology, vol. 33, no. 5, págs. 1086-1095, 2012.

        [14] L. Badimon, B. Onate y G. Vilahur, "Células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo y su potencial reparador en la cardiopatía isquémica", Revista Española de Cardiologia, vol. 68, no. 7, págs. 599-611, 2015.

        [15] E. D. Tichy y P. J. Stambrook, "Reparación del ADN en células madre embrionarias murinas y células diferenciadas", Experimental Cell Research, vol. 314, no. 9, págs. 1929-1936, 2008.

        [16] P. Fortini, C. Ferretti y E. Dogliotti, "La respuesta al daño del ADN durante la diferenciación: vías y consecuencias", Mutation Research, vol. 743-744, págs. 160-168, 2013.

        [17] A. Khan, H. Dellago, L. Terlecki-Zaniewicz y col., "[SNEV.sup.hPrp19 / hPso4] regula la adipogénesis de las células del estroma adiposo humano", Stem Cell Reports, vol. 8, no. 1, págs.21-29, 2017.

        [18] L. Oliver, E. Hue, Q. Sery et al., "Respuesta relacionada con la diferenciación a las roturas del ADN en células madre mesenquimales humanas", Stem Cells, vol. 31, no. 4, págs. 800-807, 2013.

        [19] C. R. R. Rocha, L. K. Lerner, O. K. Okamoto, M. C. Marchetto y C. F. M. Menck, "El papel de la reparación del ADN en la pluripotencia y diferenciación de las células madre humanas", Mutation Research, vol. 752, no. 1, págs.25-35, 2013.

        [20] L. Narciso, P. Fortini, D. Pajalunga et al., "Las células musculares diferenciadas terminalmente son defectuosas en la reparación del ADN por escisión de bases e hipersensibles a la lesión por oxígeno", PNAS, vol. 104, no. 43, págs. 17010-17015, 2007.

        [21] M. Seifermann y B. Epe, "Modificaciones de bases generadas oxidativamente en el ADN: no solo factor de riesgo carcinogénico sino también marca reguladora", Free Radical Biology & amp Medicine, vol. 107, págs. 258-265, 2017.

        [22] E. Parlanti, M. D'Errico, P. Degan et al., "La conversación cruzada entre vías en la reparación de 8-oxo-7,8-dihidroguanina en células humanas y de ratón", Free Radical Biology & amp Medicina, vol. 53, no. 11, págs. 2171-2177, 2012.

        [23] G. Spivak, "Reparación acoplada a la transcripción: una actualización", Archives of Toxicology, vol. 90, no. 11, págs. 2583-2594, 2016.

        Mahara Valverde [ID], (1,2) Jonathan Lozano-Salgado, (1) Paola Fortini, (2) Maria Alexandra Rodriguez-Sastre, (1) Emilio Rojas, (1) y Eugenia Dogliotti (2)

        (1) Instituto de Investigaciones Biomedicas, Universidad Nacional Autónoma de México, C.U. 04510, México

        (2) Departamento de Medio Ambiente y Salud, Istituto Superiore di Sanita, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma, Italia

        La correspondencia debe dirigirse a Mahara Valverde [email protected]

        Recibido el 9 de diciembre de 2017 Revisado el 19 de junio de 2018 Aceptado el 26 de julio de 2018 Publicado el 10 de octubre de 2018

        Editor académico: Heinrich Sauer

        Leyenda: Figura 3: Capacidad de reparación del ADN del tratamiento con [H2] [O2] en células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (hADMSC). Daño de ADN inducido y remanente después de 24 h postratamiento (PT), expresado como momento de la cola de oliva (OTM) correspondiente a roturas de ADN y sitios lábiles a los álcalis en (a) (media [+ o -] SD). Sitios de ADN-Fpg (7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoguanina), 8-oxoadenina, aflatoxina B1-fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxi-uracilo) en (b) (media [+ o -] SD). Porcentaje de capacidad de reparación de ADN de roturas de ADN y sitios lábiles a álcalis en (c) (porcentaje [+ o -] DE) y porcentaje de capacidad de reparación de sitios de ADN-Fpg en (d) (porcentaje [+ o -] DE). 0 PT = control PT 50 PT = 50 [micro] M [H2] [O2] PT 100 PT = 100 [micro] M [H2] [O2] PT 150 PT = 150 [micro] M [H2] [O2] PT y 200 PT = 200 [micro] M [H2] [O2] PT. Todos los datos se obtuvieron en 3 experimentos independientes por duplicado (N = 3). Kruskal-Wallis se realizó con ANOVA de una vía en rangos, y todos los procedimientos de comparación múltiple por pares se realizaron con la prueba de Dunn. Las diferencias entre el daño inducido y el daño remanente se obtuvieron según (a) y (b), * p & lt0.05 y ** p & lt0.01. Se aplicó la prueba t de Student versus control para los datos en (c) y (d), * p & lt0.05 y ** p & lt0.01. Imágenes en la Figura complementaria 3.

        Leyenda: Figura 4: acumulación de daño en el ADN a través de la diferenciación de adipocitos de hADMSC. El daño del ADN correspondiente a roturas de ADN y sitios lábiles a los álcalis acumulados durante 14 días de diferenciación de adipocitos se expresó como momento de la cola de oliva (OTM), (a) (media [+ o -] SD). Acumulación de daño oxidativo de ADN, correspondiente a sitios de ADN-Fpg (7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoguanina), 8-oxoadenina, aflatoxina B1fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxi-uracilo) expresada como OTM, se representa en (b) (media [+ o -] SD). El daño del ADN basal (roturas + sitios lábiles a los álcalis) y el daño oxidativo del ADN basal (sitios sensibles a Fpg) de hADMSC (U = indiferenciado) y adipocitos (D = diferenciado) se representan en categorías de daño (0, sin daño a 4, la más alta daño) en (c). Los niveles intracelulares de ROS en hADMSC y adipocitos se muestran en (d) (media [+ o -] SD). Los datos representan 3 o 4 experimentos independientes con duplicados. Se utilizaron pruebas no paramétricas para análisis de electroforesis en gel de celda única, Kruskal-Wallis (ANOVA unidireccional en rangos) y todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (prueba de Dunn). Diferencias frente a hADMSC (indiferenciadas), * p & lt 0,05. Imágenes en la Figura complementaria 4.


        La planta medicinal india Giloe (Tinospora cordifolia) induce efectos citotóxicos al dañar el ADN celular en las células HeLa: un estudio de ensayo de cometas

        La ciencia ambiental atraviesa una crisis terrible y drástica. Tinospora cordifolia o giloe se utiliza en el sistema de medicina ayurvédica para el tratamiento de muchas enfermedades. Nuestros estudios anteriores han demostrado que giloe ejerce un efecto citotóxico in vitro e in vivo, lo que nos estimuló a comprender el mecanismo de muerte celular en el que las células HeLa reciben diversas concentraciones de giloe. Por lo tanto, se estudió la inducción de daño del ADN molecular por diferentes concentraciones de extracto de diclorometano de giloe, Tinospora cordifolia (TCE) en células HeLa mediante ensayo cometa alcalino y el daño del ADN inducido por TCE se ha expresado como momento de la cola de oliva (OTM). La incubación de células HeLa con TCE durante 4 h causó un mayor daño en el ADN, como lo indica el aumento de OTM, en comparación con el tratamiento de 2 h y, por lo tanto, el tiempo de exposición de 4 h se consideró como una duración óptima para el tratamiento con TCE. La exposición de las células HeLa a 0, 1, 2, 4, 6 u 8 & mug / ml TCE dio como resultado una elevación dependiente de la concentración en el daño del ADN y la concentración más baja de 1 & mug / ml TCE aumentó el daño inicial del ADN aproximadamente en 10 veces, mientras que 8 μg / ml de TCE, la concentración más alta probada causó una elevación aproximada de 68 veces en el daño del ADN, en comparación con el control no tratado.

        Introducción

        Los fitocéuticos se han utilizado en sistemas medicinales tradicionales para el cuidado de la salud en India y China desde el advenimiento de sus civilizaciones. Los fitocéuticos y otros productos naturales continúan desempeñando un papel importante en la atención sanitaria humana en los países desarrollados y en desarrollo. Las estimaciones de la Organización Mundial de la Salud indican que aproximadamente el 80% de los seres humanos en todo el mundo utilizan principalmente medicamentos tradicionales para su atención primaria de la salud [1]. Los productos naturales y botánicos son fácilmente accesibles y económicamente menos costosos que los compuestos sintéticos. También se ha creído que son tóxicos conocidos como lo ha sido su uso desde el advenimiento de la historia humana [2, 3]. Esta ha sido la razón principal de su popularidad entre la población humana. A pesar de que las plantas tienen una larga historia de uso en el tratamiento del cáncer, muchas, si no todas, las afirmaciones sobre la eficacia de dicho tratamiento se ven con escepticismo porque el cáncer, como una enfermedad específica, está mal definido en términos del folclore y los sistemas medicinales tradicionales. También es bien sabido que algunos de los fármacos modernos para el tratamiento del cáncer más conocidos, incluidos los alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, taxol, fotofilotoxinas y topotocan, etc., se han aislado originalmente de varias especies de plantas y tienen una larga historia de uso tradicional [3]. . Los fitocéuticos ofrecen como alternativa a los compuestos sintéticos y una gran promesa en el tratamiento del cáncer ya que son prácticamente no tóxicos o tienen menores implicaciones tóxicas que las moléculas sintéticas [4]. Los extractos crudos de plantas como Alstonia scholaris, y Aegle marmelos Se ha informado que muestran una marcada actividad inhibidora de tumores. in vitro y en vivo [5-7]. De manera similar, se ha informado que el extracto de Aphanamixis polystachya muestra una marcada actividad antitumoral y mejora el efecto de la radiación en ratones portadores de tumores antes [8,9].

        Los productos a base de hierbas se utilizan en diferentes formas para la salud humana. Las hierbas se utilizan en forma de extractos crudos o mezcladores de extractos crudos como lo practican los curanderos tradicionales o, alternativamente, las moléculas activas de diversos ingredientes botánicos se aíslan y se utilizan para el tratamiento de diversas dolencias humanas, incluido el cáncer, que es comúnmente practicado por los modernos. sistema de medicina [4,10]. Tinospora cordifolia Miers, perteneciente a la familia Menispermaceae, se conoce comúnmente como guduchi o giloe es una preparación herbal no tóxica, que ha sido ampliamente utilizada en el sistema de medicina ayurvédica por su tónico general, antiinflamatorio, antibacteriano, antiviral, antipalúdico, antileprótico, hipoglucemiante, propiedades inmunomoduladoras y afrodisíacas [11-17]. Se encontró que diferentes extractos de giloe protegen contra la hepatotoxicidad inducida por tetracloruro de carbono en ratas [18]. Se ha descubierto que alivia la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. en vivo [19,20]. También se ha informado que Giloe es antimutagénico y activo contra el virus del VIH [21,22]. Se ha utilizado clínicamente en el tratamiento del cáncer de garganta humano [23]. Se ha descubierto que Giloe es un farmacóforo no tóxico y estudios anteriores de este laboratorio han informado de que el extracto de diclorometano de giloe no es tóxico hasta una dosis de 1,2 g / kg en ratones [24,25]. De manera similar, también se ha encontrado que el extracto metanólico de giloe no es tóxico hasta una dosis de 3,5 g en ratones y ratas [26]. Se ha informado que el extracto alcohólico de giloe atenúa la urotoxicidad inducida por ciclofosfamida. en vivo [27]. Se ha informado que el uso de diferentes extractos de giloe destruye las células de cáncer de cuello uterino de una manera dependiente de la concentración [28, 29]. Se ha informado que Giloe aumenta el efecto de destrucción celular de la radiación. en vivo y in vitro antes [25,30]. Un estudio reciente ha demostrado que el extracto de diclorometano de giloe aumenta el efecto de la radiación al elevar el daño del ADN inducido por la radiación según lo evaluado por el ensayo cometa [31]. También se ha encontrado que el extracto crudo de otra especie de giloe, Tinosposa crispa, ejerce un efecto citotóxico sobre las células HeLa, MCF-7, MDAMB-231 y 3T3. in vitro [32].

        La predicción de la respuesta a la terapia es de suma importancia para el tratamiento del cáncer y la detección temprana de la respuesta a la terapia permite a los médicos diseñar regímenes adecuados para una mejor curación del tumor. Se han utilizado varios métodos para predecir la respuesta del tumor, incluidas las imágenes y la expresión génica [33,34]. Sin embargo, el método más eficaz será el que pueda detectar el daño del ADN en células cancerosas individuales. También reconoció que los fármacos contra el cáncer más activos y eficaces son los que dañan el ADN celular y, posteriormente, reducen el potencial clonogénico de las células. Por tanto, parece prudente estimar el efecto dañino del ADN de los agentes antineoplásicos en las células normales y cancerosas [35]. El ensayo cometa es una técnica simple que permite la determinación de la cantidad de daño en el ADN (roturas de cadena simple y doble y cambios conformacionales) en una sola célula expuesta a agentes que dañan el ADN después de eliminar la mayor parte del material que no es de ADN y la aplicación. de una corriente eléctrica débil al ADN restante incrustado en una matriz de gel de agarosa [36]. Por lo general, las células enteras se impregnan en un gel de agarosa, se lisan y se tratan en el lugar con álcali para convertir el ADN en monocatenario antes de someter el gel a corriente eléctrica. La aplicación de un campo eléctrico apropiado hace que el ADN genómico migre fuera del núcleo hacia la agarosa. Posteriormente, el ADN se tiñe con el colorante fluorescente intercalante, bromuro de etidio, que permite la visualización del ADN bajo un microscopio equipado con un accesorio de fluorescencia. Bajo el microscopio de fluorescencia, la combinación del ADN que ha permanecido en el núcleo (cabeza) y el ADN que ha migrado (cola) fuera del núcleo hace que las células individuales parezcan un cometa y de ahí el nombre ensayo cometa [36]. El daño del ADN se estima cuantitativamente bajo el microscopio midiendo la longitud y la intensidad del cometa en relación con la señal del ADN nuclear no migrante en comparación con los estándares [36,37].

        Se ha informado que el extracto de Giloe induce micronúcleos y aberraciones cromosómicas de una manera dependiente de la concentración en las células HeLa en nuestros estudios anteriores [28, 38]. Sin embargo, queda por dilucidar el mecanismo de acción del extracto de giloe sobre la muerte celular. El ensayo cometa alcalino puede detectar roturas de hebras simples y dobles, sitios lábiles a los álcalis que se expresan como roturas de hebras simples y roturas de hebras simples asociadas con la reparación por escisión incompleta [36]. Por lo tanto, se ha intentado dilucidar el daño del ADN molecular causado por el extracto de giloe en células HeLa mediante un ensayo cometa alcalino y correlacionarlo con la supervivencia celular.

        Materiales y métodos

        Drogas y químicos

        El extracto de tallo de cloruro de metileno de Giloe, Tinospora cordifolia (TCE) fue proporcionado por Kr & uumlger Pharmaceuticals (Bombay, India). Medio Esencial Mínimo (MEM), L-glutamina, sulfato de gentamicina, suero de ternero fetal, agarosa de punto de fusión normal y bajo (LMA, Cat No. A-4718), ácido etilendiamina tertracético (EDTA), Triton-X y base Trizma , fueron suministrados por Sigma Aldrich Chemical Co., Bangalore, India. El dimetilsulfóxido (DMSO) y otros productos químicos de rutina se obtuvieron de Ranbaxy fine Chemicals, Mumbai, India.

        Preparación de la solución de la droga

        La solución de TCE se preparó disolviendo 5 mg / ml de TCE en dimetilsulfóxido (DMSO) y diluida en MEM de tal manera que se obtengan concentraciones de 1, 2, 4, 6 u 8 & mug / ml, respectivamente, inmediatamente antes de su uso. . La concentración de DMSO nunca superó el 0,2%. Todas las soluciones de fármacos se prepararon de nuevo inmediatamente antes de su uso.

        Línea celular y cultivo

        Las células HeLa S3 se obtuvieron del Centro Nacional de Ciencia Celular, Pune, India, y se utilizaron durante todo el estudio. El tiempo de duplicación de las células HeLa S3 es de 20 y más de 2 h. Las células se cultivaron rutinariamente en matraces de cultivo de 25 cm 2 (Cellstar, Greiner, Alemania) con las tapas sueltas que contenían medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina al 1% y sulfato de gentamicina 50 μg / ml a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO2 en aire humidificado en un CO2 incubadora (NuAir, Plymouth, EE. UU.).

        Diseño experimental

        Normalmente, se inocularon 5 veces 105 células HeLa de crecimiento exponencial en múltiples matraces de cultivo (Techno Plastic Products, Trasading & eumln, Suiza). Se dejó que las células alcanzaran la fase de meseta. Los cultivos celulares o las células impregnadas en agarosa (los detalles se dan en la sección de ensayo cometa) se dividieron en los siguientes grupos según el tratamiento:

        Grupo MEM: Las células de este grupo se trataron con 2 µl / ml de DMSO.

        Grupo TCE: Este grupo de células se trató con 1, 2, 4, 6 u 8 µg / ml de TCE.

        Selección del tiempo óptimo

        Se realizó un experimento separado para determinar la duración óptima del tratamiento con TCE, donde las células HeLa incluidas en agarosa de cualquiera de los grupos se trataron con DMSO o 1, 2, 4, 6 u 8 & mug / ml de TCE durante dos o cuatro horas para evaluar el daño del ADN.

        Cinética de reparación del ADN

        Se llevó a cabo un experimento separado para evaluar el daño del ADN inducido por varias dosis de TCE a las 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 10, 12, 16, 18 o 24 h después del tratamiento con TCE. El diseño experimental fue esencialmente similar al descrito anteriormente excepto que las células HeLa se expusieron a TCE durante 4 h.

        Ensayo clonogénico

        Se realizó un ensayo clonogénico para correlacionar la supervivencia celular con el daño del ADN [39]. Brevemente, se inocularon 200 células HeLa en varias placas de cultivo individuales (Cellstar, Greiner, Alemania) que contenían 5 ml de medio libre de fármaco por triplicado para cada concentración de TCE. Las células se expusieron a 0, 1, 2, 4, 6 u 8 µg / ml de TCE durante 4 horas y se dejaron crecer durante 11 días posteriores al tratamiento. Las colonias obtenidas después de 11 días se tiñeron con violeta cristal al 1% en metanol y los grupos que contenían 50 o más células se puntuaron como una colonia. Se determinó la eficacia de la siembra en placa de las células y la fracción superviviente se ajustó a un modelo cuadrático lineal SF = exp & ndash (& alphaD + & betaD 2).

        Ensayo cometa alcalino

        El daño en el ADN de ambos experimentos se evaluó mediante un ensayo cometa alcalino como se describió anteriormente [36, 40]. El ensayo cometa se llevó a cabo incrustando las células en agarosa, seguido de lisis en tampón alcalino y sometiendo finalmente el gel a una corriente eléctrica. La aplicación de corriente eléctrica extrajo el ADN cargado del núcleo, lo que provocó la migración de los fragmentos de ADN relajados y rotos lejos del núcleo que el ADN intacto, que permanece en el núcleo. Las imágenes resultantes parecían cometas estelares, y se midió la intensidad de la fluorescencia de cada cometa para determinar la extensión del daño en el ADN [36,41]. El daño del ADN en las células HeLa se determinó impregnando las células en agarosa en portaobjetos de microscopio y tratándolas con DMSO (grupo MEM) o TCE durante 2 o 4 h (estudio de tiempo óptimo) o 4 h (cinética de reparación del ADN). Brevemente, los portaobjetos helados de un lado se cubrieron con 100 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (preparada en PBS libre de Ca 2+ y Mg 2+ a 37ºC). Los portaobjetos recubiertos de agarosa se cubrieron con un cubreobjetos y se colocaron sobre hielo para permitir la solidificación de la agarosa, luego se retiraron los cubreobjetos. Las alícuotas de 1 ml que contenían 1 x 105 células HeLa recolectadas en medio de cultivo se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Las células sedimentadas se resuspendieron en 80 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% que se colocó en capas sobre la primera capa y se dejó solidificar bajo un cubreobjetos sobre hielo. Para los portaobjetos de reparación, se mezclaron volúmenes iguales de suspensión celular (en MEM) y LMA al 1,2% (disuelto en MEM), se colocaron en capas y se dejaron solidificar bajo un cubreobjetos nuevo sobre hielo. Todos los pasos se llevaron a cabo bajo luz difusa para evitar daños adicionales en el ADN.

        Los portaobjetos helados impregnados con células se mantuvieron durante 2 h en el tampón de lisis frío que contenía NaCl 2,5 M, Na 100 mM2EDTA, base Trizma 10 mM (pH 10) y Triton X-100 al 1% (añadido de nuevo) para solubilizar las proteínas celulares dejando el ADN como nucleoides. Después de la lisis celular, los portaobjetos se drenaron del tampón de lisis y se colocaron en un tanque de electroforesis en gel horizontal lleno con tampón de electroforesis nuevo que contenía NaOH 300 mM, Na2EDTA 1 mM (pH 13) hasta un nivel de

        0,25 cm por encima de los portaobjetos. Los portaobjetos se dejaron en el tampón durante 20 minutos para permitir que el ADN se desenrollara. La electroforesis se realizó durante 20 min a 1,25 V cm-1 y 300 mA en frío. Los portaobjetos se drenaron y se inundaron lentamente con tres cambios de tampón de neutralización (base Trizma 0,4 M, pH 7,5) durante 5 min cada uno. Posteriormente, las células se tiñeron con 50 µl de bromuro de etidio (2 mg / ml) y se cubrieron con un cubreobjetos para su análisis inmediato bajo un microscopio de fluorescencia.

        El ADN teñido con bromuro de etidio en cada portaobjetos se visualizó con 40 aumentos utilizando un microscopio de fluorescencia como & ldquocomets & rdquo con una cabeza y una cola fluorescentes distintas (Figura 1). Las imágenes del cometa se adquirieron utilizando un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX51, Olympus Microscopes, Tokio, Japón) equipado con un filtro de excitación de 515-535 nm, un filtro de barrera de 590 nm y una cámara CCD (dispositivo cargado con acoplamiento) (CoolSNAP-Procf Kit de cámara digital en color Ver 4.1, Cibergenética de medios, Silver Spring, Maryland, EE. UU.). Por lo general, se recopilaron datos de un total de 100 células por portaobjetos para obtener un resultado representativo de la población celular [42]. Las imágenes de cometas así capturadas se analizaron utilizando el software Komet (versión 5.5, Kinetic Imaging Ltd, Bromborough, Reino Unido). El momento medio de la cola de la aceituna (OTM) se seleccionó como el parámetro que mejor refleja el daño del ADN y se calculó como% del ADN de la cola x Longitud del momento de la cola. La longitud del momento de la cola se midió desde el centro de la cabeza hasta el centro de la cola. El OTM se midió a partir de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales contenía medidas quintuplicadas y se presentó como Media y plusmn SEM (Error estándar de la media).

        Figura 1: Imagen de cometa representativa de la célula HeLa tratada con TCE. Izquierda: sin tratar y derecha: células HeLa tratadas con TCE.

        análisis estadístico

        Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). La significancia entre todos los grupos se determinó mediante ANOVA de una vía y se aplicó la prueba post-hoc de Bonferroni & rsquos para comparaciones múltiples. Los experimentos se repitieron para confirmar los resultados. Los resultados son el promedio de cinco experimentos individuales. Se aplicó la prueba de homogeneidad para averiguar la variación entre cada experimento. Los datos de cada experimento no difirieron significativamente entre sí y, por lo tanto, todos los datos se combinaron y se calcularon las medias. Un valor de p & lt0.05 se consideró estadísticamente significativo.

        Resultados

        Los resultados se expresan como el momento medio de la cola de olivo (OTM) y más el SEM en Tablas 1 y 2 y supervivencia celular en Figuras 2-4.

        Concentración (y microg / ml) Momento de la cola de oliva (SEM medio y plusmn)
        Tiempo de incubación
        2 h 4 h
        DMSO 0,761 y másmn 0,061 0.84 y másmn 0.045
        TCE (y microg / ml) 1 5,24 y más de 0,052 8,61 y más de 0,024
        2 8,64 y más de 0,041 11,55 y más mn 0,061
        4 13,51 y más de 0,082 17,57 y más de 0,044
        6 25,11 y másmn 0,04 29,39 y másmn 0,031
        8 43,23 y plusmn 0,074 58,92 y másmn 0,064

        Tabla 1: Efecto de diferentes tiempos de tratamiento sobre el daño del ADN medido como momento de la cola de olivo (OTM) en células HeLa expuestas a diversas concentraciones de extracto de giloe (TCE).

        tiempo de tratamiento
        (h)
        Momento de la cola de oliva (SEM medio y plusmn)
        DMSO TCE (y microg / ml)
        1 2 4 6 8
        0 0,86 y más de 0,051 8,63 y más de 0,023 a 11,58 y más de 0,061 a 17,64 y más de 0,044 a 28,91 y más de 0,031 a 59.02 y másmn 0.064 a
        0.25 0.88 y másmn 0.041 8,69 y más de 0,024 a 11,81 y más de 0,047 a 18.06 y másmn 0.033 a y secta 29,22 y plusmn 0,051 a 60,31 y másmn 0,066 a *
        0.5 0,91 y más de 0,056 9,42 y más de 0,052 a * 12,27 y más de 0,025 a * 19,37 y más de 0,035 a * 31,38 y másmn 0,054 a * 66,44 y más de 0,062 a *
        1 0,92 y más de 0,052 9,66 y más de 0,0524 a * 13,37 y másmn 0,047 a * 20,22 y más de 0,036 a * 33,55 y más de 0,053 a * 69,12 y plusmn 0,063 a *
        2 0,92 y más de 0,041 10,33 y más de 0,054 a * 14,40 y más de 0,048 a * 21,47 y más de 0,047 a * 35,14 y más de 0,051 a * 73,30 y más de 0,074 a *
        4 0,92 y más de 0,035 12,45 y más de 0,025 a * 16,55 y más de 0,046 a * 23,28 y más de 0,052 a * 38,20 y más de 0,051 a * 75,92 y más de 0,064 a *
        6 0,92 y más de 0,035 12,54 y más de 0,056 a * 17.24 y más de 0.051 a * 25,24 y más de 0,042 a * 39,72 y más de 0,057 a * 81,32 y másmn 0,062 a *
        10 0,93 y más de 0,042 11,98 y más de 0,054 a * 17,56 y más de 0,052 a * 25,81 y más de 0,045 a * 40,38 y más de 0,048 a * 81,64 y másmn 0,063 a *
        12 0,90 y más de 0,035 11,82 y más de 0,054 a * 17.21 y más de 0.052 a * 24,73 y más de 0,035 a * 41,12 y más de 0,049 a * 81.02 y másmn 0.061 a *
        16 0,89 y más de 0,056 10,8 y más de 0,056 a * 17,13 y más de 0,045 a * 24,12 y más de 0,025 a * 41,34 y más de 0,047 a * 80,22 y másmn 0,061 a *
        18 0,89 y másmn 0,054 10,21 y más de 0,047 a * 16,57 y más de 0,048 a * 23,91 y más de 0,027 a * 40,57 y más de 0,048 a * 79,13 y más de 0,059 a *
        24 0.88 y másmn 0.013 10.07 y más 0.054 a * 16.02 y más de 0.049 a * 22,57 y más de 0,034 a * 39,67 y másmn 0,043 a * 78.04 y más de 0.057 a *

        Tabla 2: Alteración en el daño del ADN en células HeLa expuestas a diversas concentraciones de extracto de giloe (TCE) en diferentes tiempos de postratamiento.

        Figura 2: Efecto de diversas concentraciones de extracto de diclorometano de giloe (TCE) sobre la supervivencia de las células HeLa. Círculos abiertos: MEM y Círculos cerrados: TCE.

        Figura 3: Correlación del daño del ADN (10 h) con la supervivencia celular de células HeLa tratadas con diferentes concentraciones de extracto de diclorometano de giloe (TCE).

        Figura 4: Espectro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) de berberina aislado de extracto de diclorometano de giloe (TCE).

        Selección de la duración óptima del tratamiento

        El tratamiento de las células HeLa con DMSO durante 2 o 4 h no indujo daños en el ADN de la línea de base de forma significativa. Sin embargo, el tratamiento de las células HeLa con diferentes concentraciones de TCE aumentó significativamente el daño del ADN (p & lt0.0001) 2 h después del tratamiento con TCE, como indica el aumento de OTM. El aumento de la duración del tratamiento con TCE de las células HeLa hasta 4 h aumentó aún más el daño del ADN en comparación con 2 h (tabla 1). Dado que se observó un mayor daño en el ADN durante el tratamiento de 4 h, se realizaron más estudios utilizando este tiempo de exposición al TCE.

        Cinética de reparación del ADN

        El tratamiento con DMSO no alteró significativamente el daño del ADN inicial en las células HeLa en diferentes momentos posteriores al tratamiento (Tabla 2). Las células HeLa tratadas con una concentración más baja de 1 & mug / ml de TCE acentuaron el daño del ADN de la línea de base aproximadamente en 10 veces, que fue significativamente mayor en comparación con el tratamiento con DMSO solo en todos los tiempos posteriores al tratamiento (Tabla 2). Un aumento adicional en la concentración de TCE dio como resultado una elevación dependiente de la concentración en el daño del ADN y se observó el aumento máximo en el daño del ADN para el tratamiento con TCE de 8 μg / ml. El daño del ADN se elevó significativamente en las células HeLa con cada concentración de TCE cuando se hicieron comparaciones entre varias concentraciones de TCE (p & lt0,001).

        La evaluación del daño del ADN después del tratamiento con diversas concentraciones de TCE mostró una elevación continua en el daño del ADN hasta 6 h, posteriormente se observó una disminución significativa para 1 & mug / ml que indica la reparación del ADN dañado. El aumento en la concentración de TCE hasta 2 & ndash8 & mug / ml dio como resultado una mayor elevación en el daño del ADN a las 10 h, excepto para el TCE 6 & mug / ml, donde el daño del ADN fue máximo a las 16 h después del tratamiento con TCE. A pesar de este aumento, las diferencias entre las 10 y las 16 h posteriores al tratamiento no fueron estadísticamente significativas. A partir de entonces, se observó una disminución no significativa en el daño del ADN hasta 24 h después del tratamiento.

        Ensayo clonogénico

        La integridad reproductiva de las células HeLa no se vio afectada por el tratamiento con DMSO, como lo demuestran los cambios no significativos en la supervivencia de las células HeLa (Figura 2). El uso de varias concentraciones de TCE dio como resultado una disminución dependiente de la concentración en la clonogenicidad de las células HeLa como se evidencia por una disminución continua en la supervivencia celular y se obtuvo una fracción de supervivencia más baja (SF) de 0.25 para 8 & mug / ml (Figura 2). El efecto del TCE fue mayor que el del tratamiento con DMSO en todas las concentraciones. El IC50 se encontró que era de aproximadamente 5.2 & mug / ml.

        Respuesta biológica

        Para averiguar la relación entre la supervivencia celular y el daño del ADN, la supervivencia celular se ha representado en X, mientras que el daño del ADN en los ejes Y, respectivamente. El aumento del daño del ADN dio como resultado una reducción correspondiente en la supervivencia celular, lo que indica una relación inversa entre la supervivencia celular y el daño del ADN. Esta relación entre la supervivencia celular y el daño del ADN fue cuadrática lineal (figura 3).

        Discusión

        Los productos botánicos y naturales se han aceptado tradicionalmente como remedios debido a la creencia popular de que producen menos efectos secundarios adversos [2,38]. Por lo tanto, comprender los posibles efectos beneficiosos o adversos de los productos botánicos y naturales ampliamente utilizados por la población humana es muy importante como medida de seguridad para la salud pública. A pesar de que la farmacorresistencia es un impedimento común y principal para el tratamiento exitoso del cáncer mediante quimioterapia, generalmente no es posible predecir el grado o el momento de aparición de la resistencia tumoral en la mayoría de los regímenes de quimioterapia. El ensayo cometa o electroforesis en gel unicelular (SCGE) se ha convertido en uno de los métodos estándar para evaluar el daño del ADN, con aplicaciones en pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano, epidemiología molecular, así como investigación fundamental en daño y reparación del ADN [36]. Los desarrollos recientes en la evaluación del daño del ADN mediante el ensayo cometa a nivel de una sola célula sugieren que esta técnica podría proporcionar un método para identificar el potencial para monitorear la respuesta de las células tumorales a muchos agentes anticancerosos. en el lugar [43]. En principio, este ensayo podría aplicarse a cualquier tumor accesible que esté siendo tratado con agentes quimioterapéuticos que provoquen un daño manifiesto en el ADN [44]. El ensayo cometa o SCGE se ha utilizado para la detección y cuantificación rápidas del daño del ADN en células individuales [36, 45]. Este ensayo se basa en la lisis alcalina de ADN lábil en los sitios de daño del ADN, donde las células se inmovilizan en una matriz de gel de agarosa delgada en portaobjetos, lisis suave y aplicación de corriente eléctrica a la matriz de agarosa durante la electroforesis. La aplicación de corriente eléctrica hace que el ADN relajado desenrollado migre fuera de los confines del núcleo celular, que se puede visualizar después de teñir con un fluorocromo de ácido nucleico. Las células que han sufrido daños en el ADN aparecen como cometas fluorescentes, con colas de fragmentación o desenrollamiento del ADN [36]. En el presente estudio, el potencial del extracto de diclorometano de giloe (T. cordifolia) para inducir daño en el ADN se investigó en células HeLa cultivadas.

        La estimación del daño del ADN reveló un aumento dependiente de la concentración en el daño del ADN y se pudo discernir un daño máximo del ADN en las células tratadas con TCE durante 4 horas en comparación con las tratadas solo durante dos horas. Por lo tanto, este tiempo de tratamiento se eligió para estudios adicionales. El aumento de la migración de ADN en las células HeLa observado después de 4 h de tratamiento con TCE puede ser probablemente una suma de genotoxicidad o citotoxicidad inducida por TCE. Estudios anteriores han demostrado que el tratamiento con TCE condujo a un aumento en la frecuencia de micronúcleos y aberraciones cromosómicas en las células HeLa de una manera dependiente de la concentración y los resultados actuales se ajustan a nuestros hallazgos anteriores de que el efecto citotóxico del TCE puede deberse al daño al genoma celular. a nivel molecular [25,28,38]. Se ha descubierto que la berberina, un alcaloide de isoquinolina aislado de TCE, aumenta el daño del ADN molecular hasta 4 h después del tratamiento en células HeLa antes [46]. De manera similar, se ha informado que Agaricus blazei, un hongo, aumenta el daño del ADN hasta 4 h después del tratamiento antes en ratas [47]. El tratamiento con TCE dio como resultado una elevación dependiente de la concentración en el daño del ADN en las células HeLa y la concentración más baja de 1 & mug / ml de TCE aumentó el daño del ADN de la línea de base aproximadamente en 10 veces. Este aumento en el daño del ADN está directamente relacionado con la disminución de la supervivencia celular en el presente estudio.El daño creciente del ADN por TCE en las células HeLa causó una reducción correspondiente en la supervivencia celular y se observó una reducción máxima en la supervivencia para TCE 8 & mug / ml, lo que indujo una mayor cantidad de daño al ADN. La inducción dependiente de la concentración del daño del ADN por TCE resultó posteriormente en una disminución correspondiente en la supervivencia celular de las células HeLa en el presente estudio. Anteriormente se ha informado de una observación idéntica en la que el aumento de OTM (daño del ADN) iba acompañado de una disminución correspondiente en la supervivencia celular [48-51]. También se ha informado que la berberina acentúa el daño del ADN de una manera dependiente de la concentración en las células HeLa [46]. La evaluación del daño del ADN en las células HeLa en varios tiempos de tratamiento post-TCE reveló una elevación dependiente del tiempo en el daño del ADN hasta 10 h después del tratamiento y una disminución marginal pero no significativa a partir de entonces hasta 24 h después del tratamiento, el último después del tratamiento. tiempo de tratamiento evaluado. Esto indica que las células HeLa tratadas con diversas concentraciones de TCE hicieron un intento inútil de reparar el daño del ADN 10 h después del tratamiento, ya que las diferencias entre 10 y 24 h después del tratamiento no fueron estadísticamente significativas. Se ha informado de un efecto idéntico con el alcaloide berberina presente en el TCE [46]. El tratamiento con bleomicina también aumentó de forma continua el OTM sin signos de reparación del ADN dañado en las células V79 hasta 6 h después del tratamiento [41]. En el presente estudio, las células con ADN dañado mostraron una mayor migración de fragmentos de ADN (cola de cometa) desde el núcleo (cabeza de cometa), que también puede ser una característica de la fragmentación del ADN asociada con la muerte celular necrótica / apoptótica [45,49]. Por el contrario, estudios anteriores han informado de la reparación del daño del ADN después de 1 h después del tratamiento en ratas tratadas con Agaricus blazei y líneas celulares de cáncer de vejiga después de la irradiación [44,47-49].

        La evaluación de la respuesta biológica da una indicación directa de la asociación del daño del ADN con la citotoxicidad y en el presente estudio se ha observado una correlación directa entre el daño del ADN y la muerte celular [28, 30, 31, 40]. Se ha informado que el tratamiento con TCE aumenta el daño del ADN molecular inducido por la radiación y, posteriormente, reduce la supervivencia de las células HeLa antes [31]. Se ha demostrado que la berberina presenta una relación idéntica entre el daño del ADN y la supervivencia celular [46]. De manera similar, se ha informado que la supervivencia celular y el daño del ADN están inversamente correlacionados en las células V79 tratadas con belomicina [40]. Se ha informado de un efecto similar para la inducción de micronúcleos (un biomarcador del daño del ADN) y la muerte celular antes [25,28,52-55].

        Se desconoce el mecanismo exacto de inducción del daño del ADN por TCE. El aumento del daño del ADN puede no atribuirse a un solo mecanismo, sin embargo, varios mecanismos putativos pueden haber sido responsables de la inducción del daño del ADN por TCE. El TCE puede haber inducido radicales libres y reducido el estado antioxidante de las células mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que causan daño al ADN celular. Estos radicales libres podrían haber causado daño al ADN por hidrólisis, oxidación y ataque electrofílico. Se ha informado que Giloe aumenta los radicales superóxido, el peróxido de hidrógeno y el TNF & alfa [15]. La inducción de la peroxidación de lípidos en células HeLa expuestas a TCE puede ser otro mecanismo de inducción del daño del ADN, donde los peróxidos de lípidos así producidos habrían atacado el ADN molecular provocando un mayor daño al ADN celular [56,57]. Se ha descubierto que el TCE aumenta la peroxidación de lípidos en células HeLa cultivadas anteriormente [29]. La berberina, un alcaloide es un componente principal del TCE y se ha informado que causa fragmentación del ADN internucleosómico, lo que puede haber llevado a la formación de un complejo con el ADN e inhibir la actividad de la enzima topoisomerasa II. in vitro [58,59]. La importancia de la topoisomerasa II radica en que actúa pasando un segmento intacto de ADN dúplex a través de una ruptura transitoria de doble hebra, que genera en una doble hélice separada y la inhibición de la topoisomerasa II conduce a la estabilización de las rupturas de la doble hebra del ADN y puede posteriormente induce un efecto citotóxico [60-62]. El TCE puede haber suprimido la actividad de la topoisomerasa II provocando la estabilización de las roturas transitorias de la cadena de ADN, lo que podría haber aumentado el daño del ADN y aliviado la supervivencia de las células HeLa en el presente estudio. Se ha informado que el tenipósido, un potente inhibidor de la ADN topoisomerasa II, estabiliza las roturas de la doble hebra del ADN sin permitir que se reúnan, lo que lleva a la muerte celular y también induce micronúcleos de una manera dependiente de la concentración [52,63]. La activación transcripcional de NF- & kappaB y COX-II se ha indicado en la reducción de la apoptosis y el aumento de la supervivencia celular [64,65]. El TCE puede haber suprimido la expresión de NF- & kappaB y COX-II en HeLa, dando como resultado la supervivencia celular reducida. Recientemente, se ha informado que la berberina, un alcaloide de isoquinolina y otros fitoquímicos presentes en el extracto de giloe, suprimen la transactivación de NF- & kappaB y STAT3 [66,67]. La inhibición de la expresión de COX-II por giloe [68] apoya esta afirmación.

        De nuestro estudio se desprende claramente que los efectos citotóxicos de giloe se deben a su capacidad para inducir daño en el ADN, como lo demuestra el aumento de OTM. Esto puede deberse a la presencia de berberina, alcaloide isoquinolina, que se ha aislado del extracto de cloruro de metileno de giloe (Figura 4). La berberina también se ha aislado de giloe anteriormente [69]. Se ha informado que la berberina causa daños en el ADN de las células HeLa [46].

        Conclusiones

        El tratamiento de las células HeLa con diferentes concentraciones de giloe resultó en un aumento dependiente de la concentración en el daño del ADN molecular y la muerte de las células HeLa. La muerte celular eficaz por TCE puede deberse a la inducción de daño del ADN y la pérdida de la capacidad de reparación del ADN de las células HeLa. La giloe puede haber producido estrés oxidativo por formación aumentada de radicales libres, generación de ROS, inducción de peróxidos lipídicos y su intercalación con el ADN nucleosómico. Giloe puede haber inhibido la acción de la topoisomerasa II dando como resultado el aumento del daño del ADN. La inhibición de STAT3, NF- & kappaB y COX-II también puede haber contribuido a un aumento del daño del ADN. Este mayor daño al ADN podría haber sido la principal causa del efecto citotóxico de giloe. La presencia de alcaloides isoquinolínicos berberina como componente activo puede haber contribuido al aumento del daño del ADN y los efectos citotóxicos subsiguientes del giole en el presente estudio.


        N- bencenosulfonamida

        Especie: rata Cepa: Wistar Sexo: macho Detalles sobre animales de prueba o sistema de prueba y condiciones ambientales: ANIMALES DE PRUEBA
        - Fuente: TOXI-COOP ZRT., Cserkesz u. 90., H-1103 Budapest, Hungría
        - Edad al inicio del estudio: 56 a 61 días al inicio del tratamiento
        - Peso al inicio del estudio: 247,6 - 263,2 g
        - Asignados a los grupos de prueba al azar: sí, todos los animales se clasificaron de acuerdo con el peso corporal por computadora y se agruparon de acuerdo con los rangos de peso.
        - Alojamiento: 3 animales / jaula en el grupo de control positivo 2 animales / jaulas
        - Dieta: ssniff® SM R / M-Z + H dieta completa para ratas y ratones (ssniff Spezialdiäten GmbH, D-59494 Soest Alemania), ad libitum.
        - Agua: agua del grifo, ad libitum.
        - Periodo de aclimatación: 6 días

        CONDICIONES AMBIENTALES
        - Temperatura (° C): 21,1 - 23,6
        - Humedad (%): 35 - 64
        - Cambios de aire (por hora):> 10
        - Fotoperíodo (horas de oscuridad / horas de luz): 12/12

        Administración / exposición

        Dosis / concentraciones abrir todo cerrar todo

        Dosis / concentraciones 1

        Dosis / concentraciones 2

        Dosis / concentraciones 3

        Exámenes

        Tejidos y tipos de células examinados: hígado y estómago glandular Detalles del tejido y preparación del portaobjetos: CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LA DOSIS:
        Para la selección de la dosis, se tomó en consideración la propuesta de guía y la información obtenida de un estudio de toxicidad oral aguda realizado previamente del elemento de prueba en ratas (LD50> 2000 mg / kg de peso corporal) y el estudio de toxicidad de dosis repetidas. Sobre la base de esta información, la dosis máxima será de 2000 mg / kg de peso corporal / día y, además de la dosis máxima, se seleccionarán dos dosis adicionales, es decir, 1000 y 500 mg / kg de peso corporal / día.
        Para la identificación correcta de la dosis máxima tolerada (MTD) cuando no se produce muerte, evidencia de dolor, sufrimiento o angustia, se realizó una prueba de búsqueda de rango en el laboratorio de pruebas, utilizando la misma especie, cepa, sexo y régimen de tratamiento que se utilizará. en el estudio principal.
        En la prueba de búsqueda de rango (basada en la información disponible) se trataron dos animales (ratas macho, CRL (WI) BR de origen Wistar) con el elemento de prueba mediante administración oral a 10 ml / kg de volumen de tratamiento de peso corporal a la concentración de 2000 mg / kg pc / día. El tratamiento se realizó en dos días consecutivos con intervalo de 24 h. Al nivel de concentración elegido, no se observó mortalidad ni ningún signo clínico, ningún sufrimiento de los animales, por lo que se eligió 2000 mg / kg de peso corporal / día como el nivel de dosis más alto en el presente estudio.

        TIEMPOS DE MUESTREO:
        En esta prueba en particular, el muestreo se realizó 3-4 horas después del segundo tratamiento (los animales se sacrificaron de acuerdo con la legislación vigente sobre bienestar animal y los principios de las 3R y se aislaron las células de los tejidos diana) y se tuvo cuidado de realizar la necropsia de todos los animales en al mismo tiempo después de la última dosis.

        DETALLES DE LA PREPARACIÓN DE LA DIAPOSITIVA:
        - Preparación de células individuales de hígado:
        Se extrajo una porción del lóbulo lateral izquierdo del hígado y se lavó en el tampón de picado frío hasta que se eliminó la mayor cantidad de sangre posible y luego se colocó en tampón de picado (solución salina equilibrada de Hank (HBSS) helada que contiene EDTA 20 mM y DMSO al 10% ), picada con unas tijeras finas para liberar las células. La suspensión celular se mantuvo en hielo durante aproximadamente 30 segundos para permitir que sedimentaran los grumos grandes. El sobrenadante se pipeteó en un tubo Eppendorf y se usó para deslizamientos de cometas.

        - Preparación unicelular del estómago glandular:
        El estómago se abrió y se lavó rápidamente para liberarlo de los alimentos utilizando solución salina tamponada con fosfato fría. El estómago de bosque se extrajo y se desechó. A continuación, se colocó el estómago glandular en tampón de picado frío y se incubó en hielo durante 15-30 minutos. Después de la incubación, el epitelio de la superficie se raspó suavemente unas dos veces con una hoja de bisturí. Esta capa se descartó y la mucosa gástrica se enjuagó con tampón de picado frío. A continuación, se raspó cuidadosamente el epitelio del estómago 4-5 veces con una hoja de bisturí. La suspensión de células obtenida se mantuvo en hielo durante aproximadamente 30 segundos para permitir que sedimentaran los grumos grandes. El sobrenadante se pipeteó en un tubo Eppendorf y se usó para deslizamientos de cometas.

        - Preparación de los portaobjetos del ensayo Comet:
        La preparación de los portaobjetos se realizó dentro de una hora después de la preparación de células individuales. Se prepararon al menos tres portaobjetos para cada animal para cada muestra de tejido, con al menos 5 animales por grupo de dosis. En resumen, al menos 15 portaobjetos por tratamiento por tejido para los grupos de tratamiento y control de vehículo y al menos 12 portaobjetos por tejido para los controles positivos. Los portaobjetos se codificaron adecuadamente.

        Pretratamiento de portaobjetos:
        Los portaobjetos convencionales (superfrost) se sumergieron en agarosa caliente con un punto de fusión normal al 0,5% en agua. Después de retirar suavemente la parte inferior de los portaobjetos, se limpiaron con el fin de eliminar el exceso de agarosa. A continuación, se colocaron los portaobjetos sobre una superficie plana y se dejaron secar.

        Incrustar las células:
        Antes del uso, se añadió un volumen de 130 μL de agarosa de punto de fusión normal (NMA) al 0,5% en un portaobjetos de microscopio con capas previas de NMA al 0,5% y cubierto con un cubreobjetos de vidrio. Los portaobjetos se colocaron en una bandeja hasta que la agarosa se endureció (aproximadamente 5 minutos). Después de los aislamientos celulares, cada suspensión celular se mezcló con 0,5% o 1,0% de agarosa de bajo punto de fusión (LMPA). Después de eso, se agregaron 75 μL (aproximadamente 3 x 10 ^ 4 células) de esta mezcla en el portaobjetos del microscopio después de deslizar suavemente el cubreobjetos.
        Los portaobjetos de microscopio se cubrieron con un nuevo cubreobjetos. Después de que la mezcla de células LMPA se endurezca, se dejaron caer 70 μL adicionales de NMA en el portaobjetos del microscopio después de un deslizamiento suave del (segundo) cubreobjetos y se colocó un nuevo cubreobjetos adicional sobre el portaobjetos. Después de que se endureció la capa repetida de NMA, se retiró el cubreobjetos.

        - Lisis:
        Después de que se solidificara la capa superior de agarosa y se retirara el último cubreobjetos de vidrio, los portaobjetos se sumergieron en una solución de lisis enfriada durante al menos 1 hora (pero preferiblemente durante la noche) a 2-8ºC (en el refrigerador) en la oscuridad. Después del período de incubación, los portaobjetos se enjuagaron para eliminar los detergentes y sales residuales antes de la etapa de desenrollado con álcali. Este procedimiento de enjuague se realizó en tampón de electroforesis.

        MÉTODO DE ANÁLISIS:
        - Desbobinado y Electroforesis:
        Los portaobjetos se retiraron de la solución de lisis y se colocaron aleatoriamente en una unidad de electroforesis en gel horizontal. La unidad se llenó con solución de electroforesis recién preparada hasta que las superficies de los portaobjetos se cubrieron completamente con la solución (hasta aproximadamente 1-2 mm por encima de los portaobjetos).
        Durante el desenrollado y la electroforesis se utilizó un diseño equilibrado para colocar los portaobjetos en el tanque de electroforesis para mitigar los efectos de cualquier tendencia o efecto de borde dentro del tanque y minimizar la variabilidad de un lote a otro.
        Los portaobjetos se dejaron durante 30 min. para que el ADN se relaje. A continuación, se llevó a cabo la electroforesis durante 30 min. aplicando un voltaje constante de 25 V y una corriente eléctrica de aproximadamente 300 mA. La corriente se registró al inicio y al final del período de electroforesis. Todos estos pasos se protegieron de la luz del día para evitar la aparición de daños adicionales en el ADN. La temperatura de la solución de electroforesis a través del desenrollado y la electroforesis se mantuvo a baja temperatura, es decir, 2-10 ° C usando un enfriador especial, y se registró una vez durante el procedimiento.

        - Neutralización y conservación de portaobjetos:
        Después de la electroforesis, los portaobjetos se retiraron de la unidad de electroforesis, se cubrieron con solución de neutralización, se dejaron reposar cubiertos durante aproximadamente 5 minutos, luego se secaron y se volvieron a cubrir con solución de neutralización. Este procedimiento se repitió dos veces. Posteriormente, los portaobjetos se expusieron durante 5 minutos adicionales a etanol absoluto para conservar todos los portaobjetos.

        - Tinción:
        Los portaobjetos se secaron al aire y luego se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se puntuaron para cometas. Justo antes de puntuar el ADN, los portaobjetos se tiñeron con 50 μL de bromuro de etidio 2 μg / ml.

        - Evaluación de diapositivas:
        Los portaobjetos codificados se tiñeron y se puntuaron a ciegas. Los cometas se midieron mediante una cámara digital conectada a un sistema analizador de imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación apropiado con un aumento de 200X. Para el análisis de imágenes se utilizó el Komet 6.0 F (Andor Technology).
        Para cada muestra de tejido, se puntuaron al azar cincuenta células por portaobjetos, es decir, 150 células por animal (750 células analizadas por tratamiento con elemento de prueba, por control de vehículo y 600 por controles positivos).
        Las roturas de la hebra de ADN en el ensayo del cometa se midieron mediante criterios de valoración independientes como el% de ADN de la cola, el momento de la cola y la longitud de la cola.
        El momento de la cola de olivo (OTM), expresado en unidades arbitrarias, se calcula multiplicando el porcentaje de ADN (fluorescencia) en la cola por la longitud de la cola en μm. La longitud de la cola se mide entre el centro de la cabeza del cometa y el final de la cola del cometa.
        El% de ADN de la cola está determinado por la intensidad del fragmento de ADN en la cola expresada como un porcentaje de la intensidad total de la célula.
        Además, se examinó cada portaobjetos para detectar la presencia de células fantasma. Las células fantasma se excluyeron de la recopilación de datos de análisis de imágenes, sin embargo, determinar su frecuencia es útil para la interpretación de los datos. Las células fantasma se registraron para cada portaobjetos por animal, por tipo de tratamiento y por tejido.
        Criterios de evaluación: La sustancia problema es claramente negativa si:
        - ninguna de las concentraciones de prueba muestra un aumento estadísticamente significativo en comparación con el control negativo concurrente
        - no hay aumento relacionado con la concentración cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada
        - todos los resultados están dentro de la distribución de los datos históricos de control negativo para especies, vehículo, vía, tejido y número de administración dados
        - Se demuestra evidencia directa o indirecta que respalda la exposición o la toxicidad del tejido o tejidos diana.

        La sustancia problema es claramente positiva si:
        - al menos una de las concentraciones de prueba presenta un aumento estadísticamente significativo en comparación con el control negativo concurrente
        - el aumento está relacionado con la dosis cuando se evalúa con una prueba de tendencia adecuada
        - cualquiera de los resultados está fuera de la distribución de los datos históricos de control negativo para determinadas especies, vehículos, vías, tejidos y número de administración. Estadística: Se verificó la normalidad y homogeneidad de la varianza de los datos con los métodos de prueba estadísticos adecuados.

        Resultados y discusión

        Resultados de la prueba

        Información adicional sobre resultados: RESULTADOS DEL ESTUDIO DE BÚSQUEDA DE RANGO
        - Dosis: 2000 mg / kg pc / día.
        - Signos clínicos de toxicidad en animales de ensayo: Al nivel de concentración elegido, no se observó mortalidad ni ningún signo clínico, ningún sufrimiento de los animales.

        RESULTADOS DEL ESTUDIO DEFINITIVO
        - Idoneidad de los niveles de dosis y la vía: La dosis más alta (2000 mg / kg pc / día) se selecciona de acuerdo con los criterios requeridos por la directriz OCDE 489. Se eligió la exposición por vía oral ya que se consideró que esta vía era la vía de exposición más relevante.
        - Evaluación estadística: La significación estadística de los valores de% de ADN de la cola, la longitud de la cola, los valores de OTM y el número de células fantasma se llevó a cabo utilizando el método estadístico apropiado, utilizando el software SPSS PC +. La heterogeneidad de la varianza entre los grupos se verificó mediante la prueba de homogeneidad de la varianza de Bartlett. Cuando no se detectó heterogeneidad significativa, se llevó a cabo un análisis de varianza unidireccional. En caso de un análisis positivo, se utilizó la prueba de rango múltiple de Duncan para evaluar la importancia de las diferencias entre grupos. Cuando se encontró una heterogeneidad significativa, la distribución normal de los datos se examinó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Si los datos no tenían una distribución normal, se utilizó el método no paramétrico del análisis de varianza unidireccional de Kruskal-Wallis. En caso de un resultado de análisis positivo, las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba U de Mann-Whitney.

        Cualquier otra información sobre los resultados incl. mesas

        Resultados de las mediciones analíticas:

        El análisis de las formulaciones (para el control de cada concentración y homogeneidad) se realizó mediante un método de HPLC con detección UV utilizando un método analítico previamente validado. Según los resultados del estudio de validación disponible, el elemento de prueba demostró ser suficientemente estable en formulaciones de metilcelulosa al 1% a niveles de concentración de 50 y 200 mg / ml al menos durante 1 día en el refrigerador (5 ± 3 ° C). El elemento de prueba en formulaciones de metilcelulosa al 1% se consideró homogéneo. Los valores de concentración medidos se mantuvieron dentro del ± 10% del rango nominal en todas las concentraciones.

        Resumen y conclusión del solicitante

        El propósito del ensayo cometa (ensayo de electroforesis en gel de una sola célula) era evaluar el potencial mutagénico del elemento de prueba midiendo su capacidad para inducir daño al ADN en los órganos y tejidos diana, según lo especificado y solicitado por la ECHA.Las formulaciones se prepararon antes de cada tratamiento. El artículo de prueba se formuló en el vehículo en concentraciones nominales de 200, 100 y 50 mg / ml (niveles de dosis correspondientes: 2000, 1000 y 500 mg / kg de peso corporal), se aplicó y se refirió a lo largo del estudio. El análisis de las formulaciones (para el control de cada concentración y homogeneidad) se realizó mediante un método analítico previamente validado. Los valores de concentración medidos permanecieron dentro del ± 10% del rango nominal en todos los niveles de concentración examinados.

        La sustancia de prueba se administró por vía oral por sonda dos veces: una vez el día 0 y 24 horas después a las dosis del elemento de prueba y los controles negativos. Los animales de control positivo se trataron mediante sonda oral una vez durante el experimento el día 1. Los tejidos diana fueron el estómago, el duodeno y el hígado. El tiempo de muestreo fue de 3-4 horas después del segundo tratamiento (dosis y control de vehículo) y de 3-4 horas después del tratamiento (control positivo). Los animales se sacrificaron y se aislaron las células de los tejidos diana. La citotoxicidad se determinó en una pequeña muestra de cada suspensión de células aisladas siguiendo la técnica de exclusión del colorante azul tripán, directamente después del muestreo. Antes de la puntuación, el ADN se tiñó con 50 μl de bromuro de etidio de 20 μg / ml.Los cometas se midieron a través de una cámara digital conectada a un sistema analizador de imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación apropiado con un aumento de 200X. Para el análisis de imágenes se utilizó Komet 6.0 F (Andor Technology). Además, se examinó cada portaobjetos para determinar la presencia de células fantasma (posible indicador de toxicidad y / o apoptosis). Las células fantasma se excluyeron de la recopilación de datos de análisis de imágenes. Los números de animales tratados fueron 6 animales en los grupos de dosis y 4 animales del grupo de control negativo en el grupo de control positivo. Las células de 5 animales se analizaron en los grupos de dosis y el grupo de control negativo y las células de 3 animales se analizaron en el grupo de control positivo. Para cada muestra de tejido, se puntuaron al azar cincuenta células por portaobjetos, es decir, 150 células por animal (750 células analizadas por tratamiento con elemento de prueba, por control de vehículo y 450 por control positivo).

        Se cumplieron todos los criterios de validez con respecto a los tratamientos de control negativo y positivo, así como el número de células analizadas y los niveles de dosis investigados. No se observó mortalidad durante los tratamientos y el período de expresión en ningún grupo de dosis hasta la dosis límite de 2000 & # 160 mg / kg de peso corporal / día y en los controles. No se observaron síntomas tóxicos ni ningún signo clínico durante los tratamientos en ninguna dosis o grupo de control. En el aislamiento de tejido se observó una apariencia y anatomía normales de los órganos diana (estómago, duodeno e hígado) en todos los animales de los grupos de dosis y control. Sin embargo, a la dosis más alta examinada de 2000 & # 160 mg / kg de peso corporal / día en tres animales se notaron timpanitis leves en el tracto gastrointestinal. Los pesos corporales medios aumentaron en todos los grupos de dosis, así como en los grupos de control negativo y positivo. Los aumentos de peso corporal estuvieron en el rango de 0.98 - 4.09 & # 160% cuando se compararon los valores de peso justo antes del primer tratamiento y justo antes del sacrificio. En las mediciones de detección de citotoxicidad (utilizando el método de exclusión del colorante azul tripán) no se observó citotoxicidad en ningún elemento de prueba ni en los tratamientos del elemento de control en ningún tejido diana. En los grupos tratados con el artículo de prueba examinado, el número de células fantasma en las muestras de estómago, duodeno e hígado permaneció casi en el mismo intervalo y no difirió estadísticamente significativamente del del control del vehículo. Se notó un aumento estadísticamente significativo de células fantasma en todos los tejidos después del tratamiento con EMS. Las células fantasma son un posible indicador de citotoxicidad y / o apoptosis. Según la literatura, el aumento de la frecuencia de células fantasma también puede indicar células con daño severo en el ADN (genotoxicidad). Para ser consciente de los resultados de mutagenicidad y la experiencia anterior del laboratorio, el número relativamente mayor de células fantasma en el control positivo, el tratamiento con EMS se considera un posible indicador de genotoxicidad. Las roturas de la hebra de ADN en el ensayo del cometa se midieron mediante criterios de valoración independientes como el% de ADN de la cola, la longitud de la cola y el Momento de la cola de oliva (OTM). Los valores de la mediana (y los valores medios de la mediana) se calcularon en todos los parámetros examinados y evaluados. La mediana de los valores de% de ADN de la cola de cada dosis permaneció en el rango de control del vehículo en los tejidos examinados. En las muestras de estómago e hígado, los valores ligeramente diferentes (más altos o más bajos) no difirieron estadísticamente de manera significativa de los del control del vehículo hasta la dosis límite de 2000 mg / kg de peso corporal / día. En la muestra de duodeno a 1000 mg / kg de peso corporal / día se observó un valor medio del% de ADN de la cola ligeramente inferior, que difería estadísticamente significativamente del del control del vehículo. está vinculado a un valor más bajo que se encuentra dentro del rango de datos de control histórico. Los valores de longitud de la cola determinados en las muestras de duodeno e hígado no mostraron diferencias estadísticamente significativas. En las muestras de estómago, los valores de la longitud de la cola a las dosis del elemento de prueba 500 y 1000 mg / kg de peso corporal / día fueron estadísticamente significativamente más bajos que el valor de la longitud de la cola del control del vehículo. Los significados estadísticos obtenidos en los valores de la longitud de la cola de las muestras de estómago se consideraron no relevantes para la evaluación de la mutagenicidad, ya que el significado está vinculado a un valor más bajo que está dentro del rango de datos de control histórico. Los valores del Momento de la Cola de Oliva determinados en las células del estómago, el duodeno y el hígado de los grupos tratados con el elemento de prueba no difirieron estadísticamente de manera significativa de los del control del vehículo.

        El elemento de prueba investigado es negativo y no mostró actividad genotóxica en los tejidos examinados.

        La información sobre sustancias registradas proviene de expedientes de registro a los que se les ha asignado un número de registro. Sin embargo, la asignación de un número de registro no garantiza que la información en el expediente sea correcta o que el expediente cumpla con el Reglamento (CE) nº 1907/2006 (el Reglamento REACH). Esta información no ha sido revisada ni verificada por la Agencia ni por ninguna otra autoridad. El contenido está sujeto a cambios sin previo aviso.
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        Ver el vídeo: Baños, sacudir, lavado, diferenciación y viraje. Tinción Histológica. (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Mayne

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  2. Darcio

    La notable idea

  3. Fitzgibbon

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  5. Delmer

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  6. Duarte

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  7. Calum

    Gracias, la publicación está realmente escrita con sensatez y, al punto, hay algo que aprender.



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