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¿Hay situaciones en las que los resultados in vivo funcionen mejor de lo que hubieran mostrado los resultados in vitro?

¿Hay situaciones en las que los resultados in vivo funcionen mejor de lo que hubieran mostrado los resultados in vitro?



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Básicamente, si tengo resultados deficientes en la línea celular in vitro pero decidí probarlos in vivo en un ratón de todos modos, ¿cuáles son las posibilidades de obtener mejores resultados en el modelo de ratón vivo in vivo que nunca hubiera conocido de otra manera a partir de los resultados in vitro?

Se agradecen los enlaces


Diferencias entre in vitro y en vivo ¡Los resultados son (desafortunadamente) muy comunes!

De alguna manera, todo falló ensayos clínicos (Y muchos ensayos preclínicos) son ejemplos a gran escala de la discrepancia entre prometedores in vitro y real en vivo resultados, lo que también destaca el hecho de que incluso de una en vivo sistema (por ejemplo, ratones) al otro (por ejemplo, humanos), puede haber diferencias biológicas significativas e impredecibles. Es todo lo contrario a tu caso, en el que esperas una mejora a la hora de pasar a animales vivos, pero también es más común.

Por esencia, tu in vitro la cultura no podrá recapitular procesos clave como:

  • Señales proporcionadas por la matriz extracelular natural. Sus células probablemente se cultivan en poliestireno, pero ese sustrato está lejos de la complejidad de las moléculas naturales que rodean a las células. en vivo: rigidez, moléculas de señalización inmovilizadas ...
  • Información proporcionada por otros tipos de células. Los órganos están formados por muchas subpoblaciones dinámicas (células madre, células inmunitarias, etc.), algunas desconocidas, que interactúan y controlan el comportamiento celular a escala de tejido.
  • Información fluctuante como ciclos biológicos y comportamientos (ritmo circadiano, sueño, ingesta de alimentos ...)
  • Muchos otros como, por ejemplo, procesos inmunes, (des) activación de moléculas pequeñas por enzimas en órganos no relacionados (hígado) o plasma ...

Todos estos factores pueden cambiar su resultado de maneras impredecibles, haciéndolos mejores o peores. Pero, y eso es importante, la mayoría de las veces, los sistemas biológicos complejos tienden a empeorar las cosas, ya que introducen ruido adicional, efectos de amortiguación, etc., por lo que la mayoría de las veces, las cosas no serán tan buenas en un animal real como en una placa de Petri. Puede mejorar, seguro, ¡pero es extremadamente improbable!

Esa es una de las principales razones por las que la gente in vitro trabajar primero: es más rápido, más barato y más ético, y el fracaso in vitro Suele ser un buen predictor de fallas posteriores. en vivo.

¡Por favor, no escoja una respuesta que le diga lo contrario! Es más fácil y reconfortante pensar que todo va a funcionar si simplemente se pasa a los animales, sí, pero lo más probable es que pierda tiempo, dinero y vidas de animales para obtener resultados idénticos. Mi consejo (no solicitado) es construir un mejor in vitro modelo, eso reducirá las posibles diferencias entre los resultados celulares y los modelos animales: ¿puede imitar un entorno biológicamente relevante agregando una matriz de proteína / azúcar a sus células? ¿Puede encontrar células primarias que se comporten de forma más natural que las líneas celulares inmortalizadas? ¿Puedes realizar cultivos celulares mixtos para mejorar la adecuación de tu modelo a la realidad? Si hace todo esto, sus resultados deberían ser mucho más confiables y tendrá una mejor idea de qué esperar. en vivo.


Modelado de absorción de PBPK: establecimiento de In vitro–En vivo Enlace: perspectiva de la industria

El establecimiento de una in vitroen vivo correlación (IVIVC) se considera el estándar de oro para establecer en vivo la relevancia de un método de disolución y utilizar los datos de disolución en el contexto de cuestiones de bioequivalencia reglamentaria, incluido el desarrollo de especificaciones de disolución. Sin embargo, varias publicaciones recientes, incluidas encuestas de la industria y revisiones de agencias reguladoras, han indicado una baja tasa de éxito para IVIVC, especialmente para formulaciones de liberación inmediata. En los últimos años, el uso de la farmacocinética de base fisiológica (PBPK) y el modelado de la absorción, como herramienta para facilitar el desarrollo de formulaciones, ha atraído cada vez más atención. Este manuscrito proporciona una perspectiva de la industria sobre los desafíos actuales con el establecimiento de IVIVC y la posible oferta de modelos de absorción y PBPK para aumentar su impacto. Se utilizan estudios de casos de formulaciones de liberación inmediata y de liberación prolongada de cinco compañías farmacéuticas para demostrar cómo la IVIVC de base fisiológica (PB-IVIVC) puede facilitar la comprensión del producto farmacéutico y para informar la evaluación de bioequivalencia y las especificaciones clínicamente relevantes. Finalmente, se proponen las mejores prácticas de PB-IVIVC y una estrategia para el desarrollo y aplicación del modelo.

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ARTÍCULO BREVE INFORME DE INVESTIGACIÓN

Alain Trautmann 1 & # x0002A, Hugues Gascan 2 y Raouf Ghozzi 3 & # x0002A
  • 1 Universit & # x000E9 de Paris, Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR8104, París, Francia
  • 2 Institut de G & # x000E9n & # x000E9tique et D & # x000E9veloppement de Rennes (IGDR), Rennes, Francia
  • 3 Centre Hospitalier de Lannemezan, Lannemezan, Francia

Recientemente, se ha propuesto el disulfiram como un tratamiento prometedor para las personas que padecen síntomas persistentes de la enfermedad de Lyme. El disulfiram tiene varios objetivos moleculares distintos. La más conocida es la alcohol deshidrogenasa, una enzima clave para desintoxicar el organismo tras la ingestión de alcohol. Otros objetivos y modos de acción del disulfiram, que pueden presentar efectos secundarios problemáticos, se mencionan con menos frecuencia. los Federación Francesa contra las Enfermedades Transmitidas por Garrapatas (Acrónimo francés, FFMVT), que asocia a tres organizaciones principales de pacientes de Lyme, MD y PhD, ha sido alertado recientemente sobre eventos tóxicos graves y persistentes en un paciente que sufre de una forma de enfermedad de Lyme de diseminación tardía después de la ingesta de disulfiram. FFMVT reaccionó lanzando una convocatoria nacional para examinar si podían identificarse otros pacientes en Francia que siguieron un tratamiento similar y qué beneficios o efectos secundarios podrían notificarse. Se han recopilado las declaraciones de 16 pacientes que toman disulfiram y se presentan aquí. Trece de 16 pacientes informaron eventos tóxicos y siete de 16 informaron beneficios para al menos parte de sus síntomas. Según las observaciones recopiladas, parece demasiado pronto para promover el disulfiram como un nuevo tratamiento prometedor hasta que se hayan explorado las razones subyacentes a las toxicidades informadas y se hayan publicado los resultados de un ensayo clínico doble ciego bien realizado. El presente estudio subraya la importancia de tener en cuenta los resultados informados por los pacientes en la enfermedad de Lyme.


Introducción

Las nanopartículas de óxido de cerio (CeNP) poseen una potente actividad antioxidante atribuible a una estructura reticular cristalina con vacantes de oxígeno para la adquisición o liberación de electrones durante la fluctuación de un estado Ce +3 a un Ce +4 (Reed et & # xa0al., 2014) . En células libres y in vitro modelos celulares / tisulares, esta actividad catalítica imita la función de las enzimas endógenas catalasa (Pirmohamed et & # xa0al., 2010) y superóxido dismutasa (SOD) (Korsvik et & # xa0al., 2007) para neutralizar una variedad de especies reactivas de oxígeno ( ROS), incluyendo óxido nítrico (Dowding et & # xa0al., 2012), superóxido (Pirmohamed et & # xa0al., 2010) y peroxinitrito (Dowding et & # xa0al., 2013). Al igual que otros nanomateriales, los CeNP se pueden producir mediante una variedad de métodos de síntesis, produciendo diferentes tamaños de partículas, cargas superficiales y potenciales zeta. Además, la funcionalización de partículas con estabilizadores y materiales de recubrimiento altera potencialmente una variedad de factores, incluida la actividad catalítica (Lee et & # xa0al., 2013 Dunnick et & # xa0al., 2015), tendencias de agregación (Ould-Moussa et & # xa0al., 2014), formación de corona que favorece las partículas con un negativo in vitro potencial zeta (Patil et & # xa0al., 2007), probabilidad de captación celular (Patil et & # xa0al., 2007) y patrón de biodistribución, que también varía con la vía de administración y el tamaño de partícula (Yokel et & # xa0al., 2009 Hardas et & # xa0al., 2010 Hirst et & # xa0al., 2013 Yokel et & # xa0al., 2013).

Aunque se han investigado los efectos toxicológicos de la exposición accidental y ocupacional a las CeNP, las CeNP se han aplicado cada vez más a modelos de enfermedades, en particular aquellas que involucran estrés oxidativo (Heckman et & # xa0al., 2013 Bailey et & # xa0al., 2016 DeCoteau et & # xa0al., 2016 Kwon et & # xa0al., 2016 Naz et & # xa0al., 2017). Recientemente se ha demostrado que la administración de CeNP es eficaz en modelos de lesión cerebral traumática (Bailey et & # xa0al., 2016), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (DeCoteau et & # xa0al., 2016), daño pulmonar inducido por radiación (Xu et & # xa0al., 2016), lesión hepática crónica (Or & # xf3 et & # xa0al., 2016) o renal (Manne et & # xa0al., 2015a), peritonitis (Manne et & # xa0al., 2015b), y obesidad (Rocca et & amp; # xa0al., 2015). Aunque es tentador extrapolar la aplicabilidad de estos resultados a todos Los CeNP, incluso dentro de estos pocos estudios, las partículas utilizadas oscilan entre 3 & # x201380 nm de tamaño, exhibieron cantidades variables de agregación y se administraron en dosis que van desde 0,0007 mg / kg (Xu et & # xa0al., 2016) a 20 mg / kg (DeCoteau et & # xa0al., 2016) para ratones y de 0,05 mg / kg (Bailey et & # xa0al., 2016) a 0,5 mg / kg (Rocca et & # xa0al., 2015) para ratas. Por lo tanto, aunque diferentes formulaciones de CeNP han mostrado actividad antioxidante, la investigación paralela de la actividad catalítica y la eficacia biológica de los CeNP reforzaría nuestra comprensión de cómo las características únicas de los CeNP influyen en su función.

Estudiamos CeNP personalizados (CNRx) con características distintas de otras formulaciones de nanoceria. Estos CeNP son relativamente pequeños a 1,5 & # x20133,0 nm y están estabilizados con citrato y EDTA. Aunque los nanomateriales típicamente adsorben una gran cantidad de proteínas en su corona (Monopoli et & # xa0al., 2012), solo un número relativamente pequeño de proteínas se adhiere a los CNRx CeNPs (Heckman et & # xa0al., 2014): un perfil de moléculas que promover la captación mediada por receptores (ApoE) y la transcitosis (albúmina). Estos CeNP exhiben catalasa y actividad similar a la SOD in vitro, lo que permite la reducción de los niveles de ROS en cortes de cerebro de hipocampo murino expuestos ex vivo a condiciones isquémicas (Estevez et & # xa0al., 2019). Además, los CeNP se oponen a los cambios inducidos por peróxido o isquemia en el potencial de oxidación-reducción del tejido cerebral (DeCoteau et & # xa0al., 2016). Esta actividad antioxidante se traduce en en vivo eficacia en modelos murinos de esclerosis múltiple mediada por estrés oxidativo [encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)] (Heckman et & # xa0al., 2013) y ELA (DeCoteau et & # xa0al., 2016). Los ratones inducidos con EAE tratados por vía intravenosa con CNRx CeNP exhibieron una gravedad de la enfermedad clínica reducida y una función motora retenida similar a los ratones tratados con un fármaco prescrito actualmente, Fingolimod. Los niveles intracelulares reducidos de ROS detectados en el cerebro de los animales tratados apoyan un mecanismo de protección antioxidante (Heckman et & # xa0al., 2013).

A pesar de la eficacia de los CeNP personalizados de CNRx en el modelo EAE, el tratamiento de ratones EAE con otra formulación de CeNP no proporcionó protección contra los síntomas ni preservó la función motora, a menos que se administrara junto con el fármaco inmunomodulador lenalidomida (Eitan et & # xa0al., 2015). Esta formulación de CeNP se caracterizó por un radio hidrodinámico de 34 + / & # x2212 6,8 nm (en solución acuosa) (Eitan et & # xa0al., 2015), un tamaño que puede haber impedido la entrada al cerebro (el contenido cerebral de ceria fue no presentado) y, por lo tanto, puede ser al menos parcialmente responsable de la falta de resultados biológicos beneficiosos en este contexto. Sin embargo, la falta de análisis de deposición de tejido y la caracterización de los niveles de ROS o el daño en los cerebros de los ratones tratados hace que sea difícil precisar la razón precisa por la que esta otra formulación de CeNP no pudo prevenir el desarrollo de EAE en este estudio.

Por lo tanto, para conciliar los efectos diferenciales observados de distintas formulaciones de CeNP, realizamos un experimento de EAE para probar la eficacia terapéutica de varias formulaciones de CeNP en paralelo. In vitro La caracterización de CeNP personalizados Cerion NRx (CNRx CeNP) (Heckman et & # xa0al., 2013), Nanophase CeNP (NP CeNP) y Treibacher Industrie CeNP (TI CeNP) indicó características físicas distintas pero una actividad antioxidante razonablemente similar para los tres tipos de CeNP en sistemas libres de células, tejido cerebral isquémico y macrófagos activados. Sin embargo, solo los CNRx CeNP exhibieron en vivo eficacia, al proteger a los ratones EAE contra la progresión de los síntomas y los déficits motores. Estas observaciones demuestran que los efectos biológicos observados con un tipo de CeNP no se pueden generalizar necesariamente a todos formas de CeNP y, además, que in vitro Los efectos biológicos pueden no traducirse en los efectos correspondientes. en vivo.


Las consecuencias más amplias de los estudios mal diseñados

Muchos de los problemas que afectan al diseño experimental en la investigación con animales no son únicos. El trabajo preliminar del grupo de Sena, por ejemplo, ha encontrado que los estudios preclínicos in vitro a menudo sufren más que los estudios en animales debido a un diseño experimental deficiente. "Tuve una estudiante de pregrado trabajando conmigo que hizo un proyecto piloto que analizaba el diseño de un estudio in vitro, y ninguno de los estudios que miró en su muestra fue aleatorio, y ninguno de ellos fue cegado", dice Sena, señalando que el menor nivel de escrutinio y el menor costo asociados con la investigación in vitro podrían ser factores contribuyentes.

Sin embargo, los costos asociados con estudios mal diseñados se magnifican para la investigación con animales debido a las difíciles cuestiones éticas que plantean, y están comenzando a tener consecuencias reales para la comunidad científica a medida que aumenta la conciencia pública sobre ellos. En Suiza, por ejemplo, junto con procedimientos de licencia de animales más rigurosos, la presión política está aumentando para reducir o eliminar la experimentación con animales. Este abril, el gobierno federal anunció que celebraría un referéndum nacional sobre la prohibición total de los experimentos con animales después de que una campaña para tal votación, lanzada por un grupo de ciudadanos suizos, obtuviera más de 100.000 signatarios. La medida ha generado críticas de la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza y de las universidades suizas, un grupo de instituciones de educación superior, que dicen que la aprobación de un proyecto de ley de este tipo obstaculizaría la investigación. Se espera que la votación tenga lugar alrededor de 2022.

El debate debería actuar como una llamada de atención para los investigadores que trabajan con animales, dice Würbel. “[Los científicos] necesitan convencer a la gente de que lo que [ellos] están haciendo es útil, válido y se toman en serio las preocupaciones éticas”, explica. "Pero solo puede hacer esto de manera convincente si se asegura de que la ciencia sea rigurosa y de que ha hecho todo lo posible para asegurarse de que el daño impuesto a los animales sea lo mínimo posible".


Modelos de leucemogénesis que involucran a FLT3

Varios modelos han investigado el papel potencial de la señalización de FLT3 en la leucemogénesis. La transfección de líneas celulares dependientes de factores no malignos con formas activadas constitutivamente de FLT3 da como resultado un crecimiento independiente del factor y leucemia cuando estas células se inyectan en ratones singénicos. 18 Sin embargo, la transfección retroviral de células primarias de la médula ósea murina con mutaciones FLT3 no causa leucemia, sino que da como resultado una enfermedad mieloproliferativa (MPD) oligoclonal fatal con un tiempo medio de desarrollo de 40 a 60 días. 19 La falta de policlonalidad podría ser una pista de que los sitios de inserción retroviral podrían estar activando otros genes que podrían estar contribuyendo al fenotipo de MPD. Cuando las mutaciones de FLT3 se combinan con otras alteraciones genéticas, se produce una transformación completa en leucemia. Por ejemplo, cuando las mutaciones FLT3 / ITD se utilizan para infectar retroviralmente BM de ratones transgénicos MRP8 PML-RARα que modelan APL, la transformación completa a leucemia aguda ocurre con un tiempo de retraso reducido en comparación con la enfermedad que ocurre en ratones sin infección FLT3 / ITD. (desde una mediana de 250 días sin hasta 105 días con FLT3 / ITD). 20 Además, estos ratones tienden a tener la hiperleucocitosis que caracteriza a la LMA M3 en pacientes con mutaciones FLT3 / ITD. Una vez más, la enfermedad es oligoclonal, lo que implica que los sitios de inserción retrovirales también podrían contribuir. Otras alteraciones genéticas que resultan en leucemia cuando se combinan con mutaciones de FLT3 a través de la infección retroviral de la médula ósea murina incluyen: NUP98-Hox, AML1-ETO, MLL-ENL y MLL-SEPT6.

También se han informado modelos de ratones transgénicos que expresan mutaciones de FLT3. Cuando un FLT3 / ITD se expresa transgénicamente bajo el control del promotor vav, da como resultado MPD con una latencia de la enfermedad de 6 a 12 meses en la mayoría de las líneas fundadoras, así como enfermedad linfoide B o T en otras dos líneas fundadoras. 21 El gran retraso en el desarrollo de MPD podría implicar que otras alteraciones son necesarias para cooperar con la señalización de FLT3 / ITD para dar MPD o neoplasias linfoides.

También hay alguna evidencia de un modelo murino de que la activación constitutiva de FLT3 de tipo salvaje puede contribuir a la leucemogénesis. Esto proviene de un experimento en el que el trasplante de ratones irradiados letalmente con células madre / progenitoras de médula ósea murina transducidas con una construcción que expresa FL desarrolló leucemias linfoides o mieloides después de un largo período de retraso. 22


Abstracto

Los biólogos han estado intrigados durante mucho tiempo por la posibilidad de que las células puedan cambiar su identidad, un fenómeno conocido como plasticidad celular. El descubrimiento de que las células terminalmente diferenciadas se pueden convencer experimentalmente para que se vuelvan pluripotentes ha revitalizado el campo, y estudios recientes han demostrado que los cambios en la identidad celular no se limitan al laboratorio. Específicamente, ciertas células adultas retienen la capacidad de desdiferenciarse o transdiferenciarse en condiciones fisiológicas, como parte de la respuesta normal a la lesión de un órgano. Estudios recientes han destacado hasta qué punto la plasticidad celular contribuye a la homeostasis tisular, hallazgos que tienen implicaciones para la terapia basada en células.


Introducción

Lavarse las manos con agua y / o jabón es un método importante y económico para prevenir la transmisión de infecciones porque es eficaz para eliminar los contaminantes, incluidas las bacterias o virus patógenos, de las manos. 1-3 En la actualidad, la industria produce una variedad de jabones comerciales descritos como "antibacterianos" o "antimicrobianos". El jabón antibacteriano se refiere al jabón que contiene ingredientes con actividad antimicrobiana activa. El jabón normal, por otro lado, no contiene tales ingredientes. 3 Millones de consumidores en los EE. UU. Usan jabón de manos antibacteriano y productos de gel de baño, 4 gastando casi $ 1 mil millones al año: la expectativa es que estos productos brinden más protección contra los patógenos que el jabón común. 5

En diciembre de 2013, el Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER) de la FDA de EE. UU. Propuso una enmienda a la monografía final tentativa (TFM) de 1994 con respecto a los productos antisépticos de venta libre. 6 Este indicaba que los fabricantes de jabones de manos antibacterianos destinados a ser usados ​​con agua deben demostrar que son más seguros y más efectivos que el agua y el jabón común cuando se trata de prevenir enfermedades y / o la propagación de infecciones. Si el fabricante no puede proporcionar evidencia científica para respaldar las afirmaciones, estos productos deberán reformularse o etiquetarse nuevamente para permanecer en el mercado.

Triclosán (C12H17Cl3O2 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenil éter) es el ingrediente antiséptico activo más común utilizado en el jabón. El triclosán es un agente antimicrobiano fenoxifenol desarrollado por primera vez a principios de la década de 1960 y se ha utilizado ampliamente como agente antibacteriano o antifúngico desde la década de 1970. 3 Se agrega a diversos productos de cuidado personal y cosméticos, incluyendo jabón, pasta de dientes, lociones y champús, así como a otros productos, como ropa, utensilios de cocina, muebles y juguetes, con el objetivo de reducir o prevenir la contaminación y el crecimiento bacteriano. 7, 8 La mayoría de los jabones de manos líquidos comercializados como "antibacterianos" contienen triclosán como ingrediente activo. 9 Un estudio realizado en 2001 encontró que aproximadamente el 76% de los jabones líquidos para manos y el 29% de los jabones en barra contenían triclosán. 10

El triclosán tiene actividad antibacteriana contra bacterias, hongos y virus, de hecho, hay pocas dudas de que el compuesto tiene actividad antimicrobiana. 11, 12 Sin embargo, el uso de triclosán sigue siendo controvertido porque se han informado varios efectos adversos, que incluyen alergias, resistencia a los antibióticos, alteración endocrina, toxicidad aguda / crónica y bioacumulación; un estudio incluso identificó impurezas cancerígenas. 9, 11, 13-19 Además, la eficacia del jabón antibacteriano no ha sido concluyente y quedan dudas sobre si el jabón antibacteriano es más eficaz que el jabón común. Se han realizado dos revisiones de la literatura sobre la eficacia del jabón antibacteriano. 9, 20 Aiello et al. 9 concluyeron que los jabones antibacterianos que contienen triclosán no eran más efectivos que el jabón común. Por otro lado, Montville y Schaffner 20 concluyeron que los jabones antibacterianos producían reducciones significativamente mayores en los recuentos bacterianos que los jabones simples, aunque las diferencias eran pequeñas (alrededor de 0,5 diferencia de reducción logarítmica). Estas preocupaciones sobre la seguridad y la eficacia han proporcionado el trasfondo para el dictamen propuesto por la FDA. 6

La mayoría de los estudios examinaron la actividad antibacteriana del triclosán determinando su CMI. 12, 21-26 Sin embargo, la FDA sostiene que la prueba de MIC no es relevante al evaluar la efectividad de los ingredientes antisépticos, ya que la prueba de MIC requiere un tiempo de exposición prolongado (al menos 1 día) claramente, esto no replica el tiempo de exposición típico de consumidor de productos que contienen antimicrobianos. 6 La FDA recomendó recientemente que se utilice el "ensayo de muerte en el tiempo modificado" para proporcionar evidencia de la eficacia de los ingredientes antisépticos activos y que la concentración del compuesto y el tiempo de contacto deben reflejar situaciones de la vida real. 6 Además, recomendaron que in vitro los estudios deben realizarse utilizando cepas de referencia y aislamientos clínicos representativos [20 cepas (nueve géneros) 10 Gram-positivas y 10 Gram-negativas]. 6 Los nueve géneros son los siguientes: Campylobacter, Enterococcus, Escherichia, Listeria, Salmonela, Estafilococo, Estreptococo, Shigella y Pseudomonas (Tabla 1).

Las 20 cepas bacterianas propuestas por la FDA de EE. UU. Que se probaron en el presente estudio

Cepa bacteriana . Número ATCC.
Gram positivas
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativos
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonela Enteritidis 13076
Salmonela Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931
Cepa bacteriana . Número ATCC.
Gram positivas
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativos
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonela Enteritidis 13076
Salmonela Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931

Las 20 cepas bacterianas propuestas por la FDA de EE. UU. Que se probaron en el presente estudio

Cepa bacteriana . Número ATCC.
Gram positivas
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativos
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonela Enteritidis 13076
Salmonela Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931
Cepa bacteriana . Número ATCC.
Gram positivas
Enterococcus faecalis19433
Enterococcus faecalis29212
Staphylococcus aureus6538
Staphylococcus aureus29213
MRSA 33591
MRSA 33592
Streptococcus pyogenes14289
Streptococcus pyogenes19615
Listeria monocytogenes7644
Listeria monocytogenes19115
Gram-negativos
Campylobacter jejuni33291
Campylobacter jejuni49943
Escherichia coli11775
Escherichia coli25922
Pseudomonas aeruginosa15442
Pseudomonas aeruginosa27853
Salmonela Enteritidis 13076
Salmonela Typhimurium 14028
Shigella sonnei9290
Shigella sonnei25931

Hasta donde sabemos, ningún estudio publicado ha examinado la eficacia antibacteriana del triclosán en el jabón contra las 20 cepas enumeradas. Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron: (i) examinar los efectos bactericidas del triclosán en los jabones contra las 20 cepas a temperatura ambiente (22 ° C) y en agua tibia (40 ° C) después de un corto tiempo de exposición (20 s) (in vitro estudio) y (ii) comparar la capacidad del jabón común y el jabón antibacteriano para eliminar / inactivar Serratia marcescens inoculado artificialmente en manos humanas (en vivo estudio).


CIRCULARIZACIÓN IN VITRO

La amplia ocurrencia de circRNAs en vivo y el estudio de sus propiedades estructurales y funcionales han provocado la demanda de métodos que permitan la preparación eficiente de ARN circulares in vitro. Hay una variedad de protocolos químicos y enzimáticos disponibles, pero la mayoría son más adecuados para ARN de tamaño pequeño y mediano. Aquellos en la mayoría de los casos se pueden sintetizar químicamente asegurando extremos 5 'y 3' homogéneos. In vitro la transcripción a menudo se asocia con heterogeneidad terminal, lo que reduce drásticamente el rendimiento de la ligación para la circularización. Esto puede superarse mediante el uso de protocolos especiales (60). Sin embargo, la circularización de ARN más grandes sigue siendo un desafío. Aquí, en particular, los intrones modificados del grupo I con intrones y exones permutados (estrategia PIE) se han mostrado muy prometedores. En general, las estrategias de ligadura de férulas químicas o enzimáticas se adaptan más fácilmente a cualquier secuencia de interés, mientras que los métodos catalizados por PIE y ARN relacionado adolecen de limitaciones de secuencia. El plegamiento adecuado del ARN junto con los requisitos de secuencia en el sitio activo de los catalizadores de ARN son restricciones serias asociadas con estos procedimientos. Sin embargo, también hay ejemplos impresionantes de la preparación de grandes moléculas de ARN circulares.

Ligadura / síntesis química

La ligadura química de cadenas de ácido nucleico fue pionera en Shabarova et al. utilizando bromuro de cianógeno (BrCN) junto con derivados de morfolino como el ácido 2- (N-morfolino) -etanosulfónico (MES) para unir dos hebras de ADN que llevan grupos terminales 5′-hidroxilo y 3′-fosfato (61) (comparar la Figura 4 ).

Circularización del ARN por ligación química con bromuro de cianógeno en presencia de un derivado de morfolino como activador. R = CH3 CH2CH2ASI QUE3H.

Circularización del ARN por ligación química con bromuro de cianógeno en presencia de un derivado de morfolino como activador. R = CH3 CH2CH2ASI QUE3H.

Más tarde, se utilizaron otros agentes de condensación como la etil-3- (3'-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para apoyar la formación de enlaces fosfodiéster; sin embargo, el BrCN parece ser el reactivo más utilizado (62, 63). Las estrategias de ligación química también son útiles para los experimentos de circularización (64, 65) (Figura 4), siempre que los dos extremos de una hebra de ácido nucleico lineal se acerquen mucho (compárese con la Figura 5). Esto se logra típicamente mediante una férula de oligonucleótidos que interactúa con los dos extremos y, por lo tanto, permite la circularización. Naturalmente, la ligadura intermolecular es una reacción competitiva severa que, sin embargo, puede suprimirse trabajando con pequeñas concentraciones del ácido nucleico que se va a circularizar. Una reacción secundaria aún más grave asociada con la ligadura química de las cadenas de ARN en comparación con el ADN es la formación de enlaces 2 ', 5'-fosfodiéster en lugar del 3', 5'-fosfodiéster natural. Para evitar este problema, a menudo se utilizan oligonucleótidos con un resto 2'-desoxi azúcar en el extremo 3 'del oligonucleótido que se va a circularizar (65, 66) (Datos suplementarios, Protocolos S1 y S2).

Estrategias de yuxtaposición de extremos reactivos para ligadura enzimática. Se logra la preorientación de 5′-py 3′-OH del sustrato de ARN (a) por hibridación con una férula. Esta estrategia se puede utilizar para la ligación con ligasa de ADN T4 (se requiere férula de ADN), ligasa de ARN T4 1 (se requiere férula de ARN) y ligasa de ARN T4 2 (férula de ADN o ARN) (68) (B) mediante oligonucleótidos auxiliares lineales y en horquilla (87) (C) por una tablilla de brecha que, tras la hibridación, deja los dos o tres nucleótidos terminales de ambos extremos monocatenarios en la unión de ligación (88) (D) por estructuras intrínsecas favorables (es decir, pliegues con mancuernas (17)). Las estrategias (b), (d) y (c) son favorables para la ligación con la ligasa 1 de ARN de T4. Todas las estrategias pueden usarse también para la ligación química de ARN. Nótese que en este caso un grupo 3'-fosfato y un grupo 5'-OH son favorables.

Estrategias de yuxtaposición de extremos reactivos para ligadura enzimática. Se logra la preorientación de 5′-py 3′-OH del sustrato de ARN (a) por hibridación con una férula. Esta estrategia se puede utilizar para la ligación con ligasa de ADN T4 (se requiere férula de ADN), ligasa de ARN T4 1 (se requiere férula de ARN) y ligasa de ARN T4 2 (férula de ADN o ARN) (68) (B) mediante oligonucleótidos auxiliares lineales y en horquilla (87) (C) por una tablilla de brecha que tras la hibridación deja los dos o tres nucleótidos terminales de ambos extremos de una sola hebra en la unión de ligadura (88) (D) por estructuras intrínsecas favorables (es decir, pliegues con mancuernas (17)). Las estrategias (b), (d) y (c) son favorables para la ligación con la ligasa 1 de ARN de T4. Todas las estrategias pueden usarse también para la ligación química de ARN. Nótese que en este caso un grupo 3'-fosfato y un grupo 5'-OH son favorables.

En 1999, Micura et al. informó de un enfoque para la síntesis en fase sólida de ARN circulares de 2 a 21 nucleótidos de longitud (67). El procedimiento combina la química estándar de la fosforamidita para el ensamblaje de cadenas y la química del fosfotriéster para el cierre del anillo. Un elemento clave del procedimiento es el nucleósido de inicio que se une mediante un fosfodiéster 3 'al soporte polimérico. Una vez finalizado el ensamblaje de la cadena, la destritilación final genera un grupo hidroxilo 5 'terminal para el ataque nucleofílico sobre el fosfodiéster 3' terminal único, lo que conduce a la circularización mientras el oligonucleótido todavía está unido al polímero. La posterior escisión de los grupos cianoetilo permite la separación selectiva de los ARN circulares. Esto es posible, porque solo los circRNAs se unen a través de fosfotriésteres a través de un o-clorofenilo a la resina y, por lo tanto, puede eliminarse selectivamente mediante tratamiento con piridin-2-aldoximato de tetrametilguanidinio. Los oligoribonucleótidos no circularizados o mal enlazados restantes no se eliminan debido a sus enlaces fosfodiéster más estables. Este método permitió la producción de ARN circulares con un rendimiento promedio del 15% (67).

Ligadura enzimática

Se han desarrollado varios protocolos para la ligadura enzimática de oligonucleótidos sintéticos (68). Normalmente, se utilizan tres polinucleótidos ligasas diferentes, capaces de ligar mellas en construcciones de ARN monocatenario y / o bicatenario: ADN ligasa T4 (T4 Dnl), ARN ligasa 1 T4 (T4 Rnl 1) y ARN ligasa 2 T4 (T4 Rnl). 2), todos codificados en el genoma del bacteriófago T4 (69, 70). Catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre los grupos terminales 5′-fosfato (donante) y 3′-hidroxilo (aceptor) en el ADN o ARN en una reacción dependiente de ATP.

Independientemente de la preparación química o enzimática del precursor lineal, el extremo 5 'debe fosforilarse para proporcionar la funcionalidad requerida para la ligación. La fosforilación se puede realizar química o enzimáticamente (71) seguida directamente por la reacción de circularización (72) (Datos suplementarios, Protocolos S3 y S4). En el caso de sustratos de ARN preparados enzimáticamente, el trifosfato 5 'terminal resultante de la in vitro La reacción de transcripción debe eliminarse antes de la fosforilación por una polinucleótido quinasa. Para eludir los dos pasos enzimáticos de desfosforilación y refosforilación, cebado con GMP in vitro La transcripción por T7 RNA polimerasa es una forma elegante de obtener sustratos de RNA lineales 5′-monofosforilados (73, 74), que pueden usarse directamente para la circularización del RNA (16, 75). En la mayoría de las publicaciones, se describen protocolos para la ligasa de ADN de T4, así como la circularización de ARN cortos (& lt500 nt) mediada por ligasa de ARN. Los sustratos grandes en escalas de kb requieren diferentes estrategias, debido a desafíos estructurales. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, para la circularización de ARN grandes, los protocolos que utilizan la estrategia PIE (que se describe a continuación) pueden ser la mejor alternativa.

ADN ligasa T4

Cuando se usa ADN ligasa de T4, el sitio de ligación debe ubicarse dentro de una región bicatenaria del ácido nucleico. Las regiones monocatenarias no están ligadas. Se puede usar una férula de oligonucleótidos para crear la región bicatenaria requerida alrededor del sitio de ligación y, además, para asegurar la yuxtaposición de los extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo en el ADN o ARN dúplex (76) (Figura 5a). Es evidente que la temperatura, la estequiometría y la longitud de la férula deben ajustarse para cada sustrato. Si el ARN está muy estructurado, pueden resultar ventajosas férulas más largas hasta un apareamiento de bases de longitud completa (77). However, this enhances the risk of unfavorable structures in the splint itself. The temperature optimum for the enzyme is 16°C accordingly ligations are carried out preferentially at lower temperatures. T4 DNA ligase-mediated RNA ligation was pioneered by Moore and Sharp ( 78, 79), and ever since has been used in a number of protocols. The method was shown suitable also for RNA circularization. A representative example is the circularization of a 453-nt long RNA that, in its circular form, was successfully translated in vitro ( 16) (Supplementary data, Protocol S5).

T4 RNA ligase 1

T4 RNA ligase 1 assists in the formation of 3′, 5′-phosphodiester bonds in single-stranded RNA molecules. Already in the early 1970s it has been shown that the enzyme can be used to produce a single-stranded circular product from a linear precursor with 3′-hydroxyl and 5′-phosphate termini ( 80). As mentioned above, intermolecular ligation is competing with ring formation. However, under suitable conditions, circularization can be made the predominant event. RNA chains with a minimal length of six to eight nucleotides could be circularized ( 81, 82) (Supplementary data, Protocol S6). T4 RNA ligase 1 has different preferences for donor and acceptor nucleotides at the ligation site: A > G ≥ C > U for the 3′-terminal nucleotide acceptor, and pC > pU > pA > pG for the 5′-terminal nucleotide donor ( 83, 84).

T4 RNA ligase 1 was used for circularization in a number of applications with short and long RNAs as substrates (for exemplary protocols see Supplementary data (Protocols S7 ( 81) and S8 ( 85)). An impressive example is the circularization of a linear RNA strand to yield an authentic infectious circular RNA of the citrus exocortis viroid strain A (CEV-A) ( 86). Furthermore, circular hammerhead ribozymes were synthesized from linear oligoribonucleotides using T4 RNA ligase 1 ( 87). The authors observed that circularization efficiency is strongly dependent on the nature of the RNA substrate some of the linear RNAs could not be efficiently circularized under standard conditions. For those RNA substrates, helper deoxyoligonucleotides, preventing the RNA substrate from folding into unsuitable structures, were used (Figure 5b). In the presence of the helper strands, circular ribozymes as small as 15 nucleotides in length could be efficiently synthesized at concentrations as high as 50 μM in the ligation reaction. Linear and hairpin type helper oligonucleotides were used. In the presence of the linear helper oligonucleotide circRNA was generated with 40% yield, the hairpin helper allowed for ring formation with nearly 100% yield ( 87) (Protocol S9, Supplementary data). The circular products retained their biological activity some displayed even increased catalytic activity and decreased need for divalent cations. In general, helper oligonucleotides have proven useful for proper orientation of the reactive ends. In addition to helper oligonucleotides that assist in ligation by interaction with the substrate in a distance from the ligation site (Figure 5b), also splints may be used that bring the reactive ends close together, but leave the terminal two to three nucleotides of both donor and acceptor single stranded. This is a common procedure for ssRNA ligation with T4 RNA ligase 1 ( 88, 89), and should be a suitable strategy also for circularization (Figure 5c). Another scenario uses internal base pairing of the linear precursor to promote ligation (Figure 5d). Beaudry and Perreault developed a procedure for the synthesis of circular RNAs of any sequence based on internal secondary structures to position the 5′- and 3′-termini as single-stranded region, but held in close proximity for subsequent ligation ( 90). In another approach, dumb-bell-shaped RNAs were synthesized by closing the loops of linear but secondary folded precursors with T4 RNA ligase 1 ( 17, 22, 91–93) (for representative protocols see Supplementary data, Protocol S10).

T4 RNA ligase 2

Inter- and intramolecular ligation activity of T4 RNA ligase 2 was described by Ho and Shuman in 2002 ( 94). However, compared with its close relative T4 RNA ligase 1, this RNA ligase is much more efficient in joining nicks in dsRNA substrates, rather than connecting the ends of ssRNA ( 95, 96). This characteristic feature was used to circularize a specific RNA substrate in vitro with the donor and acceptor ends hold in proximity by internal secondary structures ( 75) (see Supplementary data, Protocol S11). A detailed mechanistic and kinetic analysis of T4 RNA ligase 2 is described in ( 94). There is a homologous protein to T4 RNA ligase 2 occurring in vibriophage KVP40. It also catalyzes RNA circularization of single-stranded small (such as 18 mers) RNAs in an ATP-dependent manner (see ( 97) for detailed comparison and kinetic data of T4 and KVP40 RNA ligase 2-dependent circularization). Furthermore, a truncated version of T4 RNA ligase 2 with 249 amino acid residues is commercially available. It ligates the enzymatically or chemically pre-adenylated 5′-end of DNA (AppDNA) or RNA (AppRNA) to the 3′-end of RNA in the absence of ATP ( 94, 98), and thus potentially can also be used for circularization.

Other RNA ligases with potential for in vitro RNA circularization

Apart from the three most widely used ligases described above, there are a number of other ligases capable of supporting RNA circularization. For example, tRNA ligases from wheat germ and a similar ‘ligase’ from Saccharomyces cerevisae may be applied for RNA ligation in vitro ( 99–101). Compared with RNA ligases 1 and 2, these ligases accept substrates with 5′-terminal phosphate donors and 2′-terminal phosphate acceptors ( 99, 102). The formed internucleotide bond is a 2′-phosphomonoester, 3′, 5′-phosphodiester structure, as appearing in tRNA splicing intermediates en vivo ( 99, 100). A recombinant yeast RNA ligase was shown to convert linear introns to their circular counterparts, although notably slower than wild-type Arabidopsis tRNA ligase ( 55).

Another RNA ligase was found in Pyrococcus abyssi, termed Pap1020. It performs the ATP-dependent circularization of oligoribonucleotides in vitro. Ring formation occurs by intramolecular reaction between the 3′- and 5′-termini of the RNA, whereby in contrast to T4 RNA ligase 1 or 2 no oligomerization was observed as side reaction ( 103). A wide range of temperatures from 20 to 95°C was screened and found suitable for efficient ligation. Varying the ATP concentration from 5 μM to 1 mM revealed that circularization activity decreases with increasing ATP concentration (see Supplementary data, Protocol S12).

Yet another ligase, named RtcB, was described by Tanaka and Shuman ( 104). It belongs to an Escherichia coli RNA repair operon with still unknown mechanistic features. Unlike classic ligases, RtcB seals broken RNAs with 3′-phosphate and 5′-OH termini. The reaction is dependent on GTP, which in the first step is bound to the protein via a histidinyl residue. The 3′-phosphate end takes over the guanylate and forms a polynucleotide-(3′)-pp-(5′)G intermediate. Subsequently, the 3′, 5′-phosphodiester bond is formed by nucleophilic attack of the 5′-terminal hydroxyl group onto the activated 3′-phosphate of the intermediate ( 105). The authors tested several GTP concentrations for RNA ligation and circularization, finding increasing yields of circRNA with increasing GTP concentration, up to complete ligation at 6.25 μM GTP (see Protocol S13, Supplementary data).

Artificial rolling circle replication and HPR supported circularization

As described above, viroids and other small infectious RNAs replicate via the double rolling circle mechanism ( 1, 50–51). An application using the rolling circle reaction and the self-splicing activity of the HPR for the generation of circular RNA was described by Kool and Diegelman ( 106). Circular single-stranded DNA templates were used for in vitro transcription by either T7 or E. coli RNA polymerase resulting in a multimeric repeating RNA sequence harboring the HPR element. Thus, upon transcription, RNA cleaved itself in monomer-length segments. The authors observed the subsequent formation of circular monomers and suggested that circularization occurs because of the intrinsic HPR activity ( 107). Data from our laboratory ( 75) and others ( 108, 109) further support the idea of HPR-derived RNA circularization. We have demonstrated that specifically designed linear RNAs harboring the HPR structure undergo self-processing and circularization ( 75). Dallas et al. demonstrated that freezing stimulates the self-ligation (circularization) of linear forms of the HPR containing 2′,3′-cyclic phosphate and 5′-OH termini ( 108). In a similar study, self-processing of the 5′- and 3′-ends of a transcribed HPR derived precursor RNA followed by ligation of the processed ends to produce a circular RNA was shown ( 109).

PIE method (RNA cyclase ribozyme)

In contrast to the methods of chemical and enzymatic ligation, which can be merely applied in vitro, a spontaneous group I intron self-splicing system, designated as the PIE method, allows circular RNA production in vitro y en vivo (Figure 6). In 1992, Puttaraju and Been first reported that circularly permuted group I intron precursor RNAs derived from Tetrahymena o Anabena, containing end-to-end fused exons that interrupt half intron sequences (comp. Figure 6a), self-splice to generate a circular RNA exon in vitro ( 110). Ford and Ares Jr extended this work by demonstrating that foreign sequences can be placed in the exon of a permuted group I intron self-splicing system (here termed ‘cyclase ribozyme’) derived from the phage T4 td gene and made circular in vitro ( 111). This is possible, because the exon sequence does not participate in the self-splicing reaction. Expression of such constructs in E. coli and yeast resulted in the accumulation of circular RNAs ( 111). Mechanistically, the PIE method includes two transesterifications at defined splice sites as occurring in the normal group I intron self-splicing reaction. However, after splicing in the normal intron exons are ligated, whereas in the PIE are circularized (Figure 6b). The first transesterification leads to release of the 3′-terminal sequence (5′-half intron) of the PIE construct. The newly generated free 3′-OH group of the 3′-half exon attacks the 3′-splice site in the second transesterification. This results in circRNA and release of the 3′-half intron (Figure 6c).

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (a) Illustration of the circular permutation of the intron. (B) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (C) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Comparison of group I intron self-splicing with the permuted intron exon method. (a) Illustration of the circular permutation of the intron. (B) Upon splicing in the normal intron, exons are ligated and the intron is circularized. (C) In the permuted intron, exons are circularized and split introns appear.

Based on the PIE method, a wide variety of circular RNAs were generated. For example, circular RNA aptamers were produced in vitro y en vivo ( 21, 112–114) as well as circular hammerhead ribozymes ( 115) and HDV ribozymes ( 116, 117). Basically, it is possible to create any desired circular RNA by inserting the sequence into a particular site of a plasmid, creating a new RNA cyclase ribozyme gene. Circular RNAs in the range of 71–1130 nt were generated ( 118).

With the studies cited above, production of RNA circles by the PIE method in E. coli as well as in yeast was experimentally verified. However, so far the strategy has not been shown to work in mammalian cells.

Modified group II introns

It is also possible to modify group II introns for inverse splicing in vitro generating RNA circles ( 119, 120). Mikheeva et al. engineered a derivative of a yeast self-splicing group II intron that catalyzes the formation of a circular human exon in vitro ( 119). RNA circles were formed by inverse splicing, which requires arranging the exons consecutively, positioning the branch point upstream and intronic sequences up- and downstream of the exons. This design allows exon circularization upon two transesterifications, excluding any intronic sequences in the circle. An advantage of this strategy in comparison to group I intron mediated exon circularization is the somewhat higher efficiency and the complete sequence variability (for group I intron mediated exon circularization the 3′-terminal residue of the 5′-exon must be U). However, based on the group II intron self-splicing mechanism, circRNAs produced via this pathway carry a 2′,5′-phosphodiester at the ligation/circularization site.


The Cost of IVF: 4 Things I Learned While Battling Infertility

When I found out that I was a carrier for the single-gene genetic disorder Tay-Sachs, a degenerative neurological condition that is fatal for children born with it, there was absolutely nothing to worry about…unless my husband was also a carrier.

The odds of that in my case, I had been told, were “one in a million,” so I wasn’t terribly concerned.

So my heart skipped a beat when I saw I had a missed call on my cell phone from my reproductive endocrinologist two weeks after my husband had finally gotten tested.

“You can imagine my surprise,” she began, “when Matt’s test results came across my desk this morning … and he’s a Tay-Sachs carrier.”

That’s when I found out I would be one of more than 85,000 women in the U.S. annually who undergo in-vitro fertilization, or IVF, as a way to create a family. Utilizing IVF and pre-implantation genetic diagnosis or PGD, the team of doctors and embryologists at our infertility practice would be able to create embryos, and then biopsy those embryos to ensure that only those not affected by Tay-Sachs were among those selected to create a pregnancy.

As I began researching IVF, I also dove into the financial details of the treatment.

Unraveling the seemingly foreign language of clinical terminology and insurance verbiage can be a heavy added stress on a patient struggling with infertility I offer the below as an introduction to anyone also beginning this process. Here are four things I learned in our journey thus far.

1. How Much IVF Actually Costs

My husband and I were back at our reproductive endocrinologist’s office a week after that first phone call, to learn more about the process … and its costs.

On average, nationally, a “fresh” IVF cycle costs $12,000, before medications, which typically run another $3,000 to $5,000. In a “fresh” IVF cycle, eggs are harvested transvaginally after a closely monitored period of ovulation-inducing medications and then “mixed” with fresh sperm. One or two of the best-looking of the resulting embryos are then transferred to the uterus via a thin catheter.

The PGD step of the process meant we were looking at another $3,000 to $6,000. Altogether, conservatively speaking, about $20,000 … for each attempt to have a healthy child utilizing a procedure that is successful (most optimistically) about 40% of the time, depending upon factors such as maternal age and the specific medical circumstances of the parents.

One of the most complex aspects of an infertility diagnosis is that for a patient to have her best chances for conception with IVF, she needs to act as quickly (to ensure that her eggs are as young and thus as viable as possible) as she can upon diagnosis. This biological urgency doesn’t exactly complement the equally pragmatic need to invest in the time to budget and save for treatment.

For some individuals undergoing IVF, if a fresh cycle doesn’t result in a pregnancy, and the remaining embryos from this fresh cycle can subsequently be used during a “frozen” cycle. “Frozen” cycles, often abbreviated as FET or Frozen Embryo Transfer, are much more economical, as they use “frozen” (technically, vitrified) embryos stored for future use. FET averages anywhere from $3,000 to $5,000 per cycle and annual storage fees for frozen embryos are typically an additional few hundred for each year.

Many practices offer “refund” and “discounted multi-cycle” programs. Practices with these kinds of programs offer various plans that provide patients with multiple IVF cycles for a single, discounted fee that costs about 30% to 40% less than the same exact treatment plan if you were to pay for it on a cycle-by-cycle basis.

Should you choose to go with a multi-cycle discount or refund package, you play an odds game. The packages only apply to one child at a time that is, if you pre-pay for three cycles and get pregnant the first time, you can’t use the subsequent cycles for your future attempts to conceive. Keep in mind, though, that to qualify for these programs, patients must undergo a pre-qualification evaluation, evaluating their odds of conceiving within the first cycle of treatment.

2. The Various Payment Options

In thinking about how to finance your treatments, remember that taking money out of your retirement fund comes with penalties and translates into money that will not be available—and not accruing interest—when it comes time for you to retire.

Using your credit cards as a quick loan will force you into a situation with high-penalty fees and interest, not to mention a swift hit to your credit score. During our research we learned of the Springstone loan program, which is geared toward infertility treatment financing and is reasonable in underwriting, interest rates, and repayment times.

If passed, The Family Act of 2013 would create a new tax credit for the out-of-pocket costs associated with IVF and fertility preservation. The proposed Family Act tax credit will only apply to those whose adjusted gross income falls below a certain combined, determined amount.

Infertility care is medical, and you may also deduct medical expenses that exceed 10% of your adjusted gross income on your taxes each year. Many parts of your infertility treatment will qualify for this kind of deduction, as preventive care, treatment, surgeries and prescription medications are all deductible.

Alternately, you can also put some of your income into a Flexible Spending Account, or FSA, which allows individuals to set aside pre-tax dollars for out-of-pocket health care costs. You may set aside up to $2,500 per individual in an FSA. While you can’t deduct expenses paid for from an FSA on your federal income tax return, you also do not have to meet the 10% adjusted gross income requirements needed for medical expense deductions.

3. How Insurance Coverage Works

One of the biggest misunderstandings when it comes to insurance coverage and infertility is what your insurance will actually cover, whether or not the actual physician you are seeing is “in-network.”

Fifteen states (Arkansas, California, Connecticut, Hawaii, Illinois, Louisiana, Maryland, Massachusetts, Montana, New Jersey, New York, Ohio, Rhode Island, Texas and West Virginia) have laws requiring varying levels of insurance coverage for infertility treatments.

Resolve, the National Infertility Association, offers an excellent state-by-state breakdown of these various benefits by state on its website. Even if you do live in a state with a mandate, not all mandates from state to state ensure the same level of coverage of care, so do familiarize yourself with your individual state’s policies.

Some insurance plans, such as my own, provide coverage only for the diagnostic phase of infertility treatment. A good rule of thumb in understanding what your insurance will and will not cover should you have such a plan is to ask if the procedure is something that will determine whether or not infertility does in fact exist and, if so, the cause of this infertility. Keep in mind that when the diagnostic phase ends, any subsequent treatment will not be covered, thus requiring you to pay out-of-pocket regardless of whether you are in- or out-of-network.

Other plans will cover the diagnostic phase and some infertility treatment services, but not all treatment services. If your plan offers some infertility treatment coverage, check with your individual plan to see their coverage policies for all possible avenues of care, from oral ovulation drugs to injectable ovulation induction medications to intrauterine insemination (IUI).

Remember to investigate all the plan options available to you compare the policy through which you currently have coverage with ones that might be offered by your partner’s employer, and compare its costs and benefits to see if it might offer more comprehensive infertility coverage.

Likewise, the new state and federal Health Insurance Marketplace now open as a result of the Affordable Care Act also allow you to see all possible plans available for purchase in your state. A new plan may come at a higher premium than what you’re currently paying, but could potentially save you tens of thousands of dollars.

4. How to Work With Your Practice’s Financial Services Department

Don’t forget to ask your physician’s office whether the prices for care quoted to you include all blood work, ultrasounds, monitoring and medications, or whether those will all be additional “à la carte” fees.

For example, when a plan covers injectable fertility medications, most plans have a “preferred” brand which they will in fact pay for, and they will deny payment on any of the others. So, if medically appropriate, your physician can choose the one that will be paid for by your insurance company as opposed to the one that will not.

Likewise, most insurance companies have a “preferred” lab to which they send routine lab work. If your practice sends the lab work to the lab that your insurance company recognizes, they will pay for it (if the lab tests are covered by your plan). If those same tests are sent to a lab that is not in-network for your plan, the plan will not pay. Make sure both you and your providers know the ins and outs of your plan.

The Affordable Care Act’s (or ACA) defining attribute is the mandating that certain insurance plans include what is now qualified as “essential health benefits.” Unfortunately, infertility treatment is not classified as an “essential health benefit.”

A huge win for those in the infertility community, however, is that, because of ACA, your insurance company can no longer discriminate against pre-existing conditions, of which an infertility diagnosis is one. That means your insurance company can no longer charge you a higher premium than someone who will not need infertility treatment, nor can you be denied coverage should you be seeking private insurance because of the diagnosis.

Where We Are Now

Because my husband’s and my need for IVF is due to a genetic disorder, there are some interesting questions to be asked—and still to be determined—on the implication of the Affordable Care Act as it defines preventive care.

As our need for IVF is to prevent a child from being born with, and subsequently dying from, Tay-Sachs disease, we have argued to our insurance company that under the Affordable Care Act, our IVF would qualify as preventive care, and thus be required to be covered as outlined by the law.

Pursuing IVF was the right next step for my husband and me. We’ve already taken the very first steps in our IVF journey, submitting DNA samples for the creation of the custom probe which will be used to test the biopsies from our future embryos. We will hopefully begin our first cycle next month. Though we know there is a long road ahead of us, we take such great comfort in knowing that, though the exact circumstances may vary, there are so many other individuals out there also pursuing a similar path.

This time of great uncertainty, a little anxiety, and many things beyond my control seem like the best preparation I could possibly receive as I prepare to become a parent … and plan for my family’s financial future.


Ver el vídeo: Hay situaciones difíciles de entender, Luis Armando (Agosto 2022).