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¿Dónde puedo encontrar los datos del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)?

¿Dónde puedo encontrar los datos del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)?


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Estoy buscando datos de ensayos de inhibición de la hemaglutinación para el virus de la influenza tipo A. Revisé bases de datos como fludb.com, sin embargo, parece que solo tiene datos genéticos. Muchas veces, los artículos científicos no incluyen los datos del ensayo HI que usaron, así que me preguntaba si alguien sabe dónde encontrar esos datos. Necesito específicamente análisis de influenza tipo A HI, no influenza tipo B.

Los datos de HI vienen en forma de títulos (el recíproco de la concentración de anticuerpo en la última placa de pocillos que pudo inhibir que el virus se uniera a la muestra de sangre y formara un escudo en la placa de pocillos).

¿Podría alguien darme un enlace a una base de datos con esta información?

Gracias.


No creo que haya ninguna base de datos universal que contenga resultados de ensayos de HI en curso y ampliamente representativos. El grupo de Cartografía antigénica ha puesto a disposición algunos conjuntos de datos históricos que se utilizaron en artículos publicados, como

  • Los datos de Influenza A / H3N2 publicados en Smith et al. 2004. Science 305: 371-376.
  • Datos de los ensayos de H1N1pdm09 en 2009/2010 (haga clic en los enlaces para las tablas html / Excel / OpenDocument)
  • Los datos publicados en Koel et al. 2013. Science 342: 976-979

Trevor Bedford y col. hacen que su gran conjunto de datos históricos de HI descritos en Integración de la dinámica antigénica de la influenza con la evolución molecular estén disponibles en DataDryad.


Inhibición de la hemaglutinación

El ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) se utiliza para valorar la respuesta de anticuerpos a una infección viral. El ensayo HI se aprovecha de la capacidad de algunos virus para hemaglutinar (unir) los glóbulos rojos, formando así una "red" y evitando que los glóbulos rojos se aglutinen. En el ensayo HI, se preparan diluciones dobles de los sueros a analizar en placas de 96 pocillos. Se agrega un título conocido del virus y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se añaden glóbulos rojos y la placa se incuba durante 30 minutos más a temperatura ambiente. Si hay anticuerpos presentes en la muestra de suero que reaccionan de forma cruzada con el virus, los anticuerpos se unirán al virus y evitarán que el virus haga hemaglutinación de los glóbulos rojos. De esta manera, se puede determinar el título exacto de los anticuerpos en el suero. Este ensayo es el estándar para el diagnóstico de influenza equina. 63

Este ensayo tiene la ventaja de ser rápido y fácil de realizar, especialmente si se sospecha de un subtipo de virus predominante. Sin embargo, es posible que el ensayo HI no detecte anticuerpos en muestras que no presentan reactividad cruzada con el virus que se está analizando (es decir, contra diferentes subtipos del virus de la influenza). Por lo tanto, deben probarse todos los posibles virus y subtipos virales, lo que no siempre es factible. Además, la inmunidad al virus puede implicar otros aspectos de la respuesta del huésped, incluidas las respuestas de las células T y los anticuerpos contra otros componentes del virus además de la proteína hemaglutinante. El ensayo HI no detectará estos aspectos de la respuesta inmune del huésped. En este sentido, las pruebas de neutralización por reducción de placa serían más completas.


Caracterización antigénica

Los & ldquoAntígenos & rdquo son estructuras moleculares en la superficie de los virus que son reconocidas por el sistema inmunológico y son capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria (producción de anticuerpos). En los virus de la influenza, los principales antígenos se encuentran en las proteínas de superficie del virus y rsquo (ver Figura 1).

Cuando alguien se expone a un virus de la influenza (ya sea a través de una infección o una vacuna), su sistema inmunológico produce anticuerpos específicos contra los antígenos (proteínas de superficie) de ese virus de la influenza en particular. El término "propiedades antigénicas" se utiliza para describir el anticuerpo o la respuesta inmune desencadenada por los antígenos de un virus en particular. & ldquoCaracterización antigénica & rdquo se refiere al análisis de las propiedades antigénicas de un virus y rsquo para ayudar a evaluar qué tan relacionado está con otro virus.

Los CDC caracterizan antigénicamente alrededor de 2,000 virus de la influenza cada año para comparar qué tan similares son los virus de la influenza que circulan actualmente con los que se incluyeron en la vacuna contra la influenza y para monitorear los cambios en los virus de la influenza en circulación. La caracterización antigénica puede dar una indicación de la capacidad de la vacuna contra la influenza para producir una respuesta inmune contra los virus de la influenza que circulan en las personas. Esta información también ayuda a los expertos a decidir qué virus deben incluirse en la próxima temporada y la vacuna contra la influenza rsquos.

Otra información que determina qué tan similar es un virus circulante a un virus de la vacuna u otro virus son los resultados de las pruebas serológicas y la secuenciación genética.

La imagen de arriba muestra las diferentes características de un virus de la influenza, incluidas las proteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Después de la infección por influenza o la recepción de la vacuna contra la influenza, el sistema inmunológico del cuerpo desarrolla anticuerpos que reconocen y se unen a sitios "antigénicos", que son regiones que se encuentran en las proteínas de superficie del virus de la influenza. Al unirse a estos sitios antigénicos, los anticuerpos neutralizan los virus de la gripe, lo que evita que causen más infecciones.

Ensayo de inhibición de hemaglutinina (prueba HI)

Los científicos utilizan una prueba llamada ensayo de inhibición de hemaglutinina (HI) para caracterizar antigénicamente los virus de la influenza. La prueba HI funciona midiendo qué tan bien los anticuerpos se unen (y por lo tanto inactivan) los virus de la influenza.

Los científicos utilizan la prueba HI para evaluar la similitud antigénica entre los virus de la influenza. Esta prueba es particularmente útil para ayudar a seleccionar los virus de la vacuna que se usan en la vacuna contra la influenza estacional. Los resultados de la prueba de HI pueden decirnos si los anticuerpos desarrollados contra la vacunación con un virus son lo suficientemente similares antigénicamente a otro virus de influenza circulante como para producir una respuesta inmune contra ese virus circulante. Los científicos también usan la prueba HI para comparar los cambios antigénicos en los virus de la influenza que circulan actualmente con los virus de la influenza que han circulado en el pasado.

La prueba de HI incluye tres componentes principales: anticuerpos, virus de la influenza y glóbulos rojos que se mezclan en los pocillos (es decir, tazas) de una placa de microvaloración. (Ver imagen 1.)

Se utiliza una placa de microtitulación para realizar la prueba HI. La placa contiene pozos (es decir, depresiones en forma de copa que pueden contener una pequeña cantidad de líquido) donde se inserta la solución de anticuerpos, virus de la influenza y glóbulos rojos y se permite que interactúen. Estos pocillos están dispuestos de acuerdo con filas y columnas (que se identifican en la placa de microvaloración con letras y números, respectivamente). Las filas de la placa se pueden usar para probar diferentes virus de influenza contra el mismo conjunto de anticuerpos. Las columnas se pueden utilizar para diferenciar entre diluciones mayores de anticuerpos, como una escala de menor a mayor que va de izquierda a derecha (consulte las Figuras 3 y 4 para ver un ejemplo).

Los anticuerpos utilizados en la prueba de IH se obtienen al infectar a un animal (generalmente un hurón) que es inmunológicamente inocente (es decir, que no ha estado expuesto a ningún virus de la influenza o vacuna anteriormente en su vida). El sistema inmunológico de los animales crea anticuerpos en respuesta a los antígenos en la superficie del virus de la gripe específico que se utilizó para infectar a ese animal. Para estudiar estos anticuerpos, se extrae una muestra de sangre (suero) del animal. La prueba HI mide qué tan bien estos anticuerpos reconocen y se unen a otros virus de la influenza (por ejemplo, los virus de la influenza que se han aislado de pacientes con influenza). Si los anticuerpos de hurón (que resultaron de la exposición al virus de la vacuna) reconocen y se unen al virus de la influenza de un paciente enfermo, esto indica que el virus de la vacuna es antigénicamente similar al virus de la influenza obtenido del paciente enfermo. Este hallazgo tiene implicaciones sobre qué tan bien podría funcionar la vacuna en las personas. Consulte Efectividad de la vacuna contra la influenza: preguntas y respuestas para profesionales de la salud para obtener más información.

Como se mencionó anteriormente, los virus de la influenza utilizados en la prueba de HI se toman de muestras de personas enfermas. Los CDC y otros centros colaboradores de la OMS recolectan muestras de personas de todo el mundo para rastrear qué virus de influenza están infectando a los humanos y monitorear cómo estos virus están cambiando.

Para la prueba de HI, se extraen glóbulos rojos (RBC) de animales (generalmente pavos o cobayas). Se utilizan en la prueba HI porque los virus de la influenza se unen a ellos. Normalmente, los glóbulos rojos en una solución se hundirán hasta el fondo del pozo de ensayo y formarán un punto rojo en la parte inferior (Figura 2A). Sin embargo, cuando se agrega un virus de la influenza a la solución de glóbulos rojos, las proteínas de superficie de hemaglutinina (HA) del virus se unirán a múltiples glóbulos rojos. Cuando los virus de la influenza se unen a los glóbulos rojos, los glóbulos rojos forman una estructura reticular (Figura 2B). Esto mantiene los glóbulos rojos suspendidos en solución en lugar de hundirse hasta el fondo y formar el punto rojo. El proceso de unión del virus de la influenza a los glóbulos rojos para formar la estructura de celosía se denomina & ldquohemaglutinación & rdquo.

La prueba de HI implica la interacción de glóbulos rojos (RBC), anticuerpos y virus de la influenza. La fila A muestra que, en ausencia de virus, los glóbulos rojos en una solución se hundirán hasta el fondo de una placa de microvaloración y se verán como un punto rojo. La fila B muestra que los virus de la influenza se unirán a los glóbulos rojos cuando se coloquen en la misma solución. Esto se llama hemaglutinación y está representado por la formación de la estructura reticular, que se muestra en la columna de la derecha debajo de & ldquoMicrotiter Results & rdquo. La fila C muestra cómo los anticuerpos que son antigénicamente similares a un virus que se está probando reconocerán y se unirán a ese virus de la influenza. Esto evita que el virus y los glóbulos rojos se unan y, por lo tanto, no se produce la hemaglutinación (es decir, se produce la inhibición de la hemaglutinación).

Cuando los anticuerpos se premezclan con el virus de la influenza seguido de los glóbulos rojos, los anticuerpos se unirán a los antígenos del virus de la influenza que reconocen, cubriendo el virus de modo que sus proteínas de superficie HA ya no puedan unirse a los glóbulos rojos (Figura 2C). La reacción entre el anticuerpo y el virus inhibe (es decir, evita) que se produzca la hemaglutinación, lo que da como resultado la inhibición de la hemaglutinación (como se muestra en la Figura 2C). Esta es la razón por la que el ensayo se denomina "prueba de inhibición de la hemaglutinina (HI)". La hemaglutinación (como se muestra en la Figura 2B) se produce cuando los anticuerpos no reconocen ni se unen a los virus de la influenza en la solución y, como resultado, los virus de la influenza se unen a los glóbulos rojos en la solución, formando la estructura reticular. Cuando los anticuerpos reconocen y se unen a los virus de la influenza en la solución, esto muestra que el virus de la vacuna (como el que se infectaron los hurones) ha producido una respuesta inmune contra el virus de la influenza obtenido del paciente enfermo. Cuando esto sucede, se dice que el virus de la influenza que se está probando es "antigénicamente similar" al virus de la influenza que creó los anticuerpos (de los hurones).

Cuando un virus de la influenza circulante es antigénicamente diferente de una vacuna o un virus de referencia, los anticuerpos (desarrollados en respuesta a la vacuna o el virus de referencia) no reconocerán ni se unirán a los antígenos de superficie del virus de la influenza circulante. En la prueba HI, esto provocará que se produzca hemaglutinación (consulte la Figura 2B). Esto indica que el virus de la vacuna o el virus de referencia no ha provocado una respuesta inmunitaria (es decir, la creación de anticuerpos) que reconozca y se dirija al virus de la influenza circulante. Los virus de la influenza circulantes analizados mediante la prueba HI se obtienen normalmente de muestras respiratorias recogidas de pacientes enfermos.

Evaluación de la similitud antigénica mediante la prueba HI

La prueba HI evalúa el grado de similitud antigénica entre dos virus utilizando una escala basada en mayores diluciones de anticuerpos. Como se mencionó anteriormente, la prueba HI se realiza utilizando una placa de microtitulación. La placa de microvaloración contiene filas y columnas de pocillos (es decir, copas) donde se mezclan los glóbulos rojos, el virus de la influenza y los anticuerpos (desarrollados contra un virus de comparación, como un virus de la vacuna). Las diluciones están marcadas en la parte superior de la placa de microvaloración. Estas diluciones funcionan como una escala para evaluar la similitud antigénica y la respuesta inmune. Al probar la capacidad de mayores diluciones de anticuerpos para prevenir la hemaglutinación, los científicos miden qué tan bien esos anticuerpos reconocen y se unen (y por lo tanto inactivan) un virus de la influenza. Cuanto mayor es la dilución, se necesitan menos anticuerpos para bloquear la hemaglutinación y más similares antigénicamente son los dos virus que se comparan entre sí. La mayor dilución de anticuerpo que da como resultado la inhibición de la hemaglutinina se considera un título de virus y rsquos HI (Figura 3). Los títulos de HI más altos se asocian con una mayor similitud antigénica. Una mayor similitud antigénica sugiere que la vacunación produciría una respuesta inmune contra el virus de prueba.

Esta muestra de virus tiene un título HI de 1280, lo que significa que la mayor dilución de anticuerpo que aún bloqueaba la hemaglutinación estaba en una dilución de 1280. Con esta dilución, los anticuerpos aún eran capaces de reconocer y unirse a los antígenos del virus.

Cuando los CDC caracterizan antigénicamente los virus de la influenza para informar las decisiones sobre la formulación de la vacuna contra la influenza estacional, la prueba HI se usa para comparar los virus que circulan actualmente (B & ampC) con los virus de la vacuna (A). Esto permite a los científicos determinar rápidamente si un virus utilizado en la vacuna contra la gripe estacional es antigénicamente similar a los virus de la gripe circulantes y, por lo tanto, es capaz de producir una respuesta inmunitaria contra ellos.

Los expertos en salud pública consideran que los virus de la influenza son antigénicamente similares o similares entre sí si sus títulos de HI difieren en dos diluciones o menos. (Esto es equivalente a una diferencia de dos pocillos (es decir, una dilución de cuatro veces) o menos). Usando la figura 4 como ejemplo, cuando el virus circulante 1 se compara con un virus de la vacuna, el virus circulante 1 difiere en una dilución (una diferencia del doble) y, por lo tanto, es & ldquolike & rdquo el virus de la vacuna rsquos de la temporada anterior. Sin embargo, el virus circulante 2 difiere en cinco diluciones (una diferencia de 32 veces) y, por lo tanto, no es como el virus de la vacuna de la temporada anterior y rsquos. Los virus circulantes que son antigénicamente diferentes (es decir, no & ldquolike & rdquo) del panel de referencia se consideran & ldquolow reactores & rdquo.

Limitaciones

La caracterización antigénica brinda información importante sobre si una vacuna elaborada con un virus de vacuna específico protegerá contra los virus de la influenza circulantes, pero existen varias limitaciones en la metodología de prueba de caracterización antigénica, que se describen a continuación.

Adaptaciones de huevo

En este momento, la mayoría de las vacunas contra la influenza se fabrican con virus que se cultivan en huevos. A medida que los virus de la influenza humana se adaptan para crecer en huevos, pueden ocurrir cambios genéticos en los virus. Estos se denominan cambios & ldquoegg-adaptados & rdquo. Algunos cambios adaptados al huevo pueden cambiar las propiedades antigénicas (o inmunogénicas) del virus, mientras que otros pueden no hacerlo. Los cambios adaptados al huevo se han convertido en un problema particular para la selección de virus candidatos a vacunas (CVV) para el componente del virus de la influenza A (H3N2) de la vacuna contra la influenza. Los virus de la influenza A (H3N2) tienden a crecer menos en los huevos de gallina que los virus de la influenza A (H1N1) y también son más propensos a los cambios adaptados al huevo. Dichos cambios pueden reducir la protección inmunológica proporcionada por la vacuna contra la influenza contra los virus A (H3N2) circulantes.


1. Introducción

La medición precisa del historial de exposición a patógenos de las personas es una herramienta esencial para comprender los factores de riesgo de infección y los patrones de transmisión a escala poblacional. Determinada a través de una variedad de métodos, la concentración de anticuerpos en el suero se considera el método estándar de oro para estimar la exposición pasada a patógenos. Dos de los métodos más comunes para medir los anticuerpos séricos contra la influenza son los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) y neutralización del virus (NT). 1 Aunque ambas pruebas sirven como medidas de concentración de anticuerpos en suero, tienen diferencias importantes en cómo se realizan y cómo miden la inmunidad. La prueba HI, que es rápida y relativamente fácil de realizar, se considera fácilmente estandarizada y reproducible en todos los laboratorios. Sin embargo, solo se mide con HI el efecto de los anticuerpos sobre el proceso de hemaglutinación, mediante el cual un virus se une a los glóbulos rojos, y el criterio de valoración es solo un correlato de la capacidad de los anticuerpos para inhibir la infección viral de las células huésped. 2, 3 Por el contrario, los ensayos de NT, también conocidos como ensayos de microneutralización, miden el título necesario para bloquear los efectos citopáticos del virus, midiendo los anticuerpos que bloquean la entrada del virus en la célula, la internalización del virus y la fusión del virus. DECIR AH. Aunque la NT es intuitivamente más atractiva porque refleja más de cerca el proceso de la enfermedad in vivo, requiere más tiempo, es más costosa y se considera más difícil de estandarizar en todos los laboratorios. 2, 3

A pesar del uso generalizado de estos dos métodos, ha habido pocos estudios comparativos formales de estas medidas. En un estudio de 2007 de Stephenson et al., Se realizaron pruebas de HI y NT en 11 laboratorios para investigar la reproducibilidad de cada ensayo para la detección de anticuerpos anti-influenza H3N2. Encontraron una variación significativamente mayor en los resultados de NT entre laboratorios que en los resultados de HI, aún mejor discriminación entre NT y correlación generalmente limitada entre las pruebas. 2 En un estudio de seguimiento de anticuerpos anti-H1N1pdm, se encontró una correlación significativa entre HI y NT, sin embargo, los factores de conversión entre laboratorios variaron significativamente. Además, los títulos de NT fueron significativamente más altos y significativamente más variables que los títulos de HI. 3

La diferencia de confiabilidad entre los laboratorios con estos dos ensayos es un resultado directo de cómo se miden. Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación y neutralización viral evalúan el nivel de inmunidad funcional a un virus de una manera similar, ambos usando diluciones seriadas de sueros aplicados a una cantidad fija de virus para determinar en qué título de sueros se inhibe eficazmente el virus. La diferencia está en el mecanismo biológico utilizado como indicador de inhibición. El ensayo HI utiliza el proceso natural de hemaglutinación viral, un proceso en el que se forma una red al unirse los virus a los glóbulos rojos, este proceso se bloquea cuando hay suficiente anticuerpo con afinidad por el virus. Se supone que un título de HI en suero de ≥40 indica una reducción del 50% en la susceptibilidad en comparación con un individuo con un título indetectable. 4-6 El ensayo de NT, por el contrario, mide los efectos citopáticos del virus, la invasión y destrucción de células, a través de la formación de placa. Nuevamente, los anticuerpos en la muestra de suero se analizan para determinar su capacidad para bloquear esta actividad. Los resultados se expresan como recíprocos de la dilución más alta a la que se bloquea la infección por virus. 7

La prueba de neutralización viral se valora por su alta sensibilidad y especificidad, que se ha encontrado que es más alta que para la prueba de microneutralización de anticuerpos fluorescentes (MFA) y HI, aunque algunos han indicado sensibilidad y especificidad similar entre las pruebas de HI y NT para ciertos virus, incluyendo influenza A H1N1 2009.2, 5, 8, 9 Además, se ha encontrado que es más específica de cepa que la HI para los virus estacionales y H5N1, y las pruebas de HI no son sensibles para la detección de respuestas de anticuerpos humanos a la hemaglutinina aviar, especialmente cuando están intactas. el virus está presente. 2, 6 Según Gross y Davis, la prueba de neutralización "parece detectar niveles más bajos de anticuerpos virales que la prueba HI", una diferencia que "puede estar relacionada con las altas concentraciones séricas y los antígenos virales adicionales detectados por NT". 10 Sin embargo, es un procedimiento laborioso y que requiere mucho tiempo, lo que lo hace menos adecuado para analizar un gran número de muestras. 11 Las desventajas de la NT incluyen su nivel de dificultad y el tiempo requerido para realizarla, la necesidad de virus vivos y que los aspectos técnicos del ensayo pueden afectar los títulos. 3, 8 Sin embargo, la principal desventaja ha sido la escasa reproducibilidad entre laboratorios. 2, 3

Además de la baja sensibilidad, en particular en comparación con el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), las desventajas del HI incluyen subjetividad en la interpretación de los resultados y problemas de confiabilidad en relación con la frescura de los reactivos. Para ambas pruebas, la medición de la inmunidad no es exacta, sino que se basa en los puntos de corte del título, y el punto final de ambos ensayos requiere una inspección visual. Aparte del costo, la facilidad y la variabilidad reducida, una ventaja importante de la HI sobre la NT para la medición de la inmunidad contra la influenza estacional es que la HI no requiere citopatía, lo que no siempre ocurre para cada virus de la influenza en este ensayo. 7

Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación y NT se han utilizado durante años para investigar la inmunidad contra la influenza, aunque solo unos pocos estudios han comparado directamente las capacidades de detección de anticuerpos contra la influenza de los ensayos, y la mayoría de estos estudios evaluaron la inmunidad derivada de la vacuna. 2, 3, 12 Aquí, comparamos los títulos de anticuerpos HI y NT de una muestra de individuos de la provincia de Guangdong, China, con el fin de comparar formalmente el desempeño de los títulos HI y NT para medir la inmunidad de origen natural con doce cepas históricas y recientemente circulantes de influenza A. Estas doce cepas son cepas de influenza estacional de los subtipos H3N2 y H1N1 que han estado o están en amplia circulación desde 1968. Además, intentaremos determinar un factor de equivalencia entre los títulos HI y NT para la traducción directa y comparación de resultados de ambos ensayos.


イ ン フ ル エ ン ザ 特異 抗体 価 を 定量 化 す る 最適 化 さ れ た 赤血 球 凝集 抑制 (HI) 試 験

抗体 は, イ ン フ ル エ ン ザ や 他 の 病原体 に 対 す る 血清 学 的 保護 の サ ロ ゲ ー ト マ ー カ ー と し て 使用 さ れ ま す. ワ ク チ ン に よ る 免疫 を 理解 す る 前 と 後 の ワ ク チ ン 接種 の 抗体 の 生産 の 詳細 な 知識 が 必要 で す. こ の 資料 で は, 特定の イ ン フ ル エ ン ザ 抗体 価 を 決定 す る た め の 信 頼 性 の 高 い ポ イ ン ト に よ っ て プ ロ ト コ ル に つ い て 説明 し ま す. 最初 の プ ロ ト コ ル で は, 赤血 球 凝集 は, 2 番 目 の プ ロ ト コ ル (赤血 球 凝集 ア ッ セ イ, HA ア ッ セ イ) そ の 後 の 使用 の た め の 集中 を標準化 す る の に 必要 な 抗原 量 を 指定 す る 方法 に つ い て 説明 し ま す 0,2 番 目 の プ ロ ト コ ル で は, ひ と 血清 · 細胞 培養 上清 (赤血 球 凝集 抑制 法, HI 試 験) の シ リ ア ル 希 薄 を 使用 し て 異 な る ウ イ ル ス 株 イ ン フ ル エ ン ザ特異 抗体 価 の 定量 に つ い て 説明 し ま す。

応 用 例 と し て 3 価 不 活化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン を 受 け た 健康 コ ホ ー ト の 抗体 応 答 を 示 す. ま た, イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス と 交差 反 応 を 示 す, さ ま ざ ま な 種類 の 動物 の 赤 い 血球 (赤血 球) を 使用 し て, 交差 反 応 を 最小限 に 抑 え る 方法 を 説明 し ま し た。 議論 は 、 長 所 と 短 所 提示 法 の 特定 の イ ン フ ル エ ン ザ 抗体 価 の 定量 免疫 の ワ ク チ ン 関 連 改善 の 理解 を

Introducción

イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス に よ る 感染 症 は 、 か な り の 罹患率 、 死亡率 と 高 い 医療 費 1, 2, 3, 4 に 関 連 付 け ら ら れ ま す。 特 に 、で す。 し た が っ て 、 循環 の イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス に 対 す る ワ ク チ ン 接種 ハ イ リ ス ク 集 団 の こ こ れ ら の 疾患 の 負担 負担 を 減少例 え ば、 保護 し き い 値 を 超 え る イ ン フ ル エ ン ザ 特異 的 抗体 の 後 個 々 の 免疫 応 の の 加 加 人口 の ウ イ ル ス の 伝 達 の 可能性 感染 症 一般 一般.ワ ク チ ン 誘 発 さ れ る 体液 性 免疫 応 答 の 別 の 集 団 と 様 々 な 年 齢 グ ル ー プ 間 で 詳細 な 理解 は 重要 な 臨床 質問 質問 6, 7 、 8 に 答 え る めな ぜ 感染 症 前 の ワ ク チ ン 接種 に も か か わ ら ず を 持 っ て? 「良 い」 と 「十分 な」 ワ ク チ ン 誘 発 さ れ る 保護 と は 何 で す か. ど の く ら い の 頻 度 ワ ク チ ン は 保護 抗体 に 到達 す る 免疫 抑制 患者 に 適用 さ れる べ き で す か。 最 も 効果 的 な 投 与 量 と は 何 で す か。 ワ ク チ ン 接種 の の 抗体 価 と 規 ア ジ ュ バ ン ト の 影響 は ク チ ン 接種 は ワ ク チ ン 接種 は ク チ ン は成果 を 向上 さ せ る に 役 立 つ こ と が あ り ま す。

ELISA法 は 、 様 々 な 抗原 に 対 す る 血清 の 比較 的 大量 の ス ク リ ー ニ ン グ を 許可 し ま す。 ま た 、 病原体 特定 免疫 グ ロ ブ リ ン (Ig) M お よ び 個別 個別例 え ば, 直線 の ア ミ ノ 酸 シ ー ケ ン ス ま た は ウ イ ル ス の よ う な 粒子 の 特性 は, 抗体 の 結合 に 影響 を 与 え る 可能性 が あ り ま す 潜在 的 な エ ピ ト ー プ の ス ペ ク ト ラ ム は 非常 に 広 い と 抗体 か ど う か に 関 す る 情報 を 提供 し ま せ ん レ ス ポ ン ス は, 機能的 関 連 性 で す。

こ の 資料 は, 特定 の イ ン フ ル エ ン ザ 抗体 価 を 定量 化 す る こ ん に ち は 世界 保健 機構 OMS ベ ー ス プ ロ ト コ ル 12 ス テ ッ プ バ イ ス テ ッ プ の 説明 し ま す. 赤血 球 凝集 は 赤血 球 の 凝集 に つ な が る い く つ か の ウ イ ル ス の 特 徴 的 な 効果 で す. 患者 血清を こ の 効果 の 抑制 に は 、 中 和 効果 を 反映 す る 抑制 性 抗体 濃度 測定 が 可能 し ま す。

同時 に 複数 の サ ン プ ル の よ り 効率 的 な 処理 と 必要 な 時間 を 短縮 で き る よ う に OMS プ ロ ト コ ル の ワ ー ク フ ロ ー を 変 更 し ま し た. 最初 の プ ロ ト コ ル で は, 特定 の イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 の 凝集 反 応 電位 の 決定 に つ い て 説明 し ま す. そ う す るこ と で 、 正 し い イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 濃度 は 2 番 目 の プ ロ ト コ ル の 決定 さ れ ま す。 こ の 部分 は 血液 新 の の 各 バ ッ チ と 同 様 、

2 番 目 の プ ロ ト コ ル で は, 特定 の イ ン フ ル エ ン ザ 抗体 価 の 定量 に つ い て 説明 し ま す. 示 さ れ た プ ロ ト コ ル は ​​し か し イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス と ひ と 血清 サ ン プ ル の 調査 用 に 最適 化 さ れ た, そ れ は も 刺激 免疫 細胞,例 え ば、 ウ イ ル ス 特異 B 細胞 か ら マ ウ ス 血清 や 細胞 培養 上清 中 の 適用 す る こ と が で き ま す。 結果 は 、 絶 対 測定 抗体 と し し て 定 定 き ま て 算 定 で き ま す特定 の 人口 の た め 表示 さ れ ま す. 解 釈, seroprotección ま た は セ ロ コ ン バ ー ジ ョ ン は, 特定 の ウ イ ル ス 集 団 の 感受性 を 記述 す る よ く 使用 さ れ ま す .Seroprotection は, 4 倍 以上 の 抗体 価 を 高 め る 2 つ の 時間 ポ イ ン ト (ほ と ん ど の 一般的 予 防 接種 前 お よ び 30 日後 予 防 接種 を 使用) の 間 の seroprotector 抗体 の 達成 と 、 ≥1: 40 、 お よ び 陽 転 の 力 価 と し て 定義 さ れ ま す。

両 方 の プ ロ ト コ ル が 使 い や す い し 、 彼 ら の 研究 の 質問 の 広 い 範 囲 に 適 応 す る こ が で き ま す。。 に 、 確風疹 14, 15, 16 な ど の 容量 を 持 つ 他 の 各種 の ウ イ ル ス に 対 す る 抗体 価.

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Protocolo

研究 プ ロ ト コ ル は ​​ロ ー カ ル 倫理 審査 委員会 (www.EKNZ.ch) に よ っ て 承認 さ れ た 、 す べ て の 参加 者 か ら 書面 に よ る イ ン フ ォ ー ム ド コ ン

  1. 興味 の 時点 で 人間 か ら 血清 サ ン プ ル を 収集 し ま す。 こ の 研究 の た め 、 ワ ク チ ン 接種 後 0 (イ ン フ ル エ ン ザ の 予 防 接種 の し ま す) + 30 血清 を + 7 、
  2. 血清 を 得 る た め に は 、 部屋 の 温度 (20-25 ° C) で 10 分 の 1200 x g で サ ン プ ル チ ュ ー ブ を 遠 心 し ま す。
    メ モ: 4 ° c と 24 h 以内 、 非 遠 心 血液 サ ン プ ル を 保存 す る 必要 が あ り ま す。
  3. 因数 に 異 な る 管 (低温 瓶) と 使用 す る ま で -80 ° C で 凍結 血清。
  4. ポ イ ン ト を 含 む す べ て の 時間 - 患者 内 で の 変 動 を 減 ら す た め に 一 人 の por lotes 、 そ の 後 の 試 金 を 実 行 し ま す。

注意: 5 つ の 異 な る 抗原 を 使用 (材料 の 表を 参照 し て く だ さ い)。 バ イ オ セ ー フ テ ィ レ ベ ル 2 (BSL-2) 研究室 で は 、 抗原 を 準備 し ま す。

  1. 製造 元 の 指示 に 従 っ て 進 む 前 に 室温 で 5 分 間 の 最小 値 の た め に 立 つ 溶 抗原 が 1.0 mL の 蒸 留 水 と 1 つ の 凍結 乾燥 イ ン フ ル エ ン。 抗原
  2. 分 注 1,5 ml に 抗原 ソ リ ュ ー シ ョ ン は チ ュ ー ブ し 、 さ ら に 使用 ま で -80 ° C で 凍結 し ま す。

注: コ レ ラ の 濾液 は 、 QUIÉN プ ロ ト コ ル 12 に よ る と 酵素 (RDE) を 破 壊 す る 受 体 と し て 使用 さ れ ま す。 こ こ は 血清 ア ッ イ と 17

注:., こ ん に ち の 試 金, い く つ か の プ レ ー ト の 間 で 比較 で き る よ う に, 同 じ ウ イ ル ス 粒子 量 は 各 プ レ ー ト の 使用 す る 必要 が あ り ま す 赤血 球 凝集 反 応 に 必要 な ウ イ ル ス 粒子 を 定量 化 に HA の 試金 (HA 滴定 と も 呼 ば れ ま す) は 、 HA 単 位 に 記録 さ れ ま す。 赤血 球 凝集 反 応 の 「単 位」 HA の 滴定 で 使用 さ れ る 方法 に 依存 し て ユ ニ ニな い で す。 し た が っ て 、 HA ユ ニ ッ ト は 、 標準化 さ れ た 赤血 球 懸濁液 の 等量 に 凝集 す る た め に な ウ イ ル よ ス 量 と し て 定義 さ て 定義 さ れ 25 L で す 。HA ア ッ セ イ の 原理 図 は 、図 1を 参照 し て く だ さ い。


図 1: 凝集 性 と 赤血 球 凝集 抑制 の 原則 で す. ウ イ ル ス や 抗体 (左列), な し の ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル 状況 で 凝集 が 発 生 せ ず, 赤血 球 は, イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス (中 欄) の 存在 下 で hemoaglutinan. し か し, イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の ヘ マ グ ル チ ニ ン が ウ イ ル ス 特異 的 抗体 な い 凝集 に よ っ てブ ロ ッ ク さ れ た 場合 (右側 の 列) に 発 生 し ま す。 こ の 図 の 拡 大 版 を 表示 す る の に は こ こ を ク リ ッ ク し て く だ さ い。

注: 使用 さ れ る 赤血 球 (表 1) ア ッ セ イ に お け る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 型 に 依存 し て い ま す. さ ら に, 96 ウ ェ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト の さ ま ざ ま な 種類 の 非 分離 細胞 の 出現 と 同 様, イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 時間 異 な り ま す (表 2)。

イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 A / カ リ フ ォ ル ニ ア / 7/09 (H1N1) A / ス イ ス / 9715293/2013 (H3N2) A / テ キ サ ス / 50/2012 (H3N2) B / ブ リ ス ベ ン / 60/08 B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ / 02/2012
RBC 種 チ キ ン モ ル モ ッ ト モ ル モ ッ ト ト ル コ ト ル コ

表 1: イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 と 対 応 す る 種 赤血 球 の。 よ る と 製造 元 の 指示 (NIBSC)。

RBC 種 チ キ ン ト ル コ モ ル モ ッ ト ヒ ト 型 O
赤血 球 (v / v) 濃度 0.75% 0.75% 1% 1%
マ イ ク ロ プ レ ー ト の 種類 V 底 V 底 U 底 U 底
培養 時間 、 RT 30 分 30 分 1 時間 1 時間
非 凝集 の セ ル の 外 観 ボ タ ン * ボ タ ン * ヘ イ ロ ー ヘ イ ロ ー

表 2: 赤血 球 の 種 を 条件 ア ッ セ イ し ま す。 QUIÉN の プ ロ ト コ ル に よ る と。 (* 傾 い て い る と き に 流 れ る)。

  1. 赤血 球 懸濁液 の 準備
    1. 赤血 球 在 庫 懸濁液 を 希 釈 (10% 、 v / v O 人間 型 を 除 く) (材料 の 表を 参照 し て く だ さ い) リ ン 酸 緩衝 生理 食 塩 水 (PBS) そ れ ぞ れ 適 切 な 0,75% と 1% 、 鳥類 と 哺乳類 の 赤血 球 濃度 を 確認 し ま す。


    図 2: HA ア ッ セ イ の デ ザ イ ン を プ レ ー ト し ま す。 重複 で HA の 滴定 を 行 い ま す。 コ ン ト ロ ー ル の 行 に 抗原 が 追加 さ れ ま せ ん で し た。 ま た 最高 の 抗原 濃度 の 定量 の た めの 図 4を 参照 し て く だ さ い。 こ の 図 の 拡 大 版 を 表示 す る の に は こ こ を ク リ ッ ク し て く だ さ い。

    1. 96 ウ ェ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト の 準備
      注: プ レ ー ト デ ザ イ ン の 概要 に つ い て は図 2を 参照 し て く だ さ い。
      1. 96 ウ ェ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト の 使用 さ れ る 各 行 の 1 に 12 の 井 戸 に 25 μ L の PBS を 追加 す る に は 、 マ ル チ チ ャ ン ン図 2) を 使用 し ま す。 鶏 と 七 面 鳥 の よ う な 鳥 の 赤血 球 を 操作 す る と き は 、 V 字 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ー を 使用 し ま す。 哺乳類表 2) を 操作 す る と き は 、 U 字 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト を 使用 し ま す。
      2. 重複 整理 さ れ る 抗原 行 の 最初 の 井 戸 に イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 の 25 μ L を 追加 し ま す. コ ン ト ロ ー ル の 行 に は, 抗原 は 追加 さ れ ま せ ん. コ ン ト ロ ー ル の 行 な い 凝集 効果 を 示 す, ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル (図 2) と な り ま す。
      3. シ リ ア ル 2 倍 希 釈 を 実 行 す る に は, マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し て 連 続 井 戸 に 抗原 行 の 最初 の 井 戸 か ら 25 μ L を 転 送 し ま す. 各 希 釈 段 階 を ミ ッ ク ス す る に は, 上下 に ゆ っ く り 10 回 ピペ ッ テ ィ ン グ し ま す。
      4. 最後 の ウ ェ ル ス の 最終 的 な 25 μ L を 破 棄 し ま す。
      5. 使用 さ れ る 各 行 の 1 に 12 の 井 戸 に 25 μ L の PBS を 追加 す る に は 、 50 μ L / ウ ェ ル の 容量 に 達 す る た め に マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ペ
      6. 各 マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し て 、 よ く 使用 す る 赤血 球 懸濁液 50 μ L を 追加 し ま す。
      7. タ ッ プ プ レ ー ト を 慎重 に 10 回 四方 を 混 在 さ せ る こ と に し ま す。
      8. 蓋 付 き プ レ ー ト を カ バ ー し 、 RBC 種 使用 (表 2参照) に 応 じ て 適 切 な 時間 室温 で 孵化 さ せ な さ い。 抱卵 中 板 を 移動 し な い で く だ さ い。


      図 3: 鳥 お よ び 哺乳類 の 赤血 球 の 凝集 パ タ ー ン。V 字 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト は 、 鳥 の 赤血 球 を 操作 す る と き に 使用 さ れ ま す。 傾斜 レ ー ト 位置 位置 の 読 み 出 し を 実 行の マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト は, 哺乳類 の 赤血 球 を 操作 す る と き に 使用 さ れ ま す. 読 み 出 し が 非 傾斜 の 位置 に 実 行 さ れ, 非 凝集 赤血 球 を 形成 す る 小 さ な ハ ロ ー. こ の 図 の 拡 大 版 を 表示 す る の に は こ こ をク リ ッ ク し て く だ さ い。

      1. 版 を 読 む
        注: 異 な る 形 マ イ ク ロ タ イ タ ー 井 戸 (図 3) た め 哺乳類 赤血 球 と 比較 し て 鳥 の 赤血 球 を 使用 す る 場合 、 読 み 出 し は 若干 異 な り ま す。
        1. 鳥類 の 赤血 球 の 読 み 出 し
          1. プ レ ー ト を 25 の 90 ° 傾 け s。
            注: は 、 凝集 パ タ ー ン (完全 に 付 属 、 一部 付 属 と 非 凝集) の す べ て の 3 種類 が 傾 か な い と き タ ン と し し て 表示 さ れ る た め 鳥 パ
          2. プ レ ー ト の 傾斜 の 位置 、 96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 印刷 方式 の 中 、 す ぐ に 結果 を マ ー ク し ま す。 鳥類 の 赤血 球 の 凝集 パ タ ー ン は 、図 3の と お り で す。
          1. プ レ ー ト (ベ ン チ の 水平 位置) で 傾 く こ と な し 96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 印刷 方式 の 結果 を マ ー ク し ま す。
            注: 赤血 球 凝集 が 発 生 す る と 、 付 属 の 細胞 に 定 着 し な い 下 、 井 戸 の 底 で ヘ イ ロ ー の よ う な 非 凝集 凝集 の 細胞 に 対。。 部分 的 に 的。 的 的 的図 3)。


          図 4: 4 HA 単 位 の 力 価 を 決定 す る 鳥 の 赤血 球 と HA の 滴定 の 読 み 出 し。 赤血 球 凝集 ア ッ セ イ (抗原 ​​滴定 試 金) 赤血 球 凝集 反 応 に 必要 な 最適 な 抗原 量 を し ま す。 完全 な 凝集 発 生 し し た 最後 最後 の 井 戸 、 HA 滴定 エ ン HA 滴定 エ エ ン。 抗原 、 HA 滴定 終点 の 前 の 2 つ の 井 戸 の 2 倍 希 釈 の た め 、 力 価 は 4 HA 単 位 に 対 応 し ま す。 こ の 図 の 拡 拡 大 版 を 表示 す る の に

          注: プ ロ ト コ ル の 作業 フ ロ ー は 、 同時 に 複数 の サ ン プ ル の よ り 的 的 な 処理 を 許可 す る 、 pcr 法 を 用 い た チ ュ ー ブ ス

          1. 血清 試 料 の 調製
            注: は 、 BSL 2 研究室 で 血清 を 準備 し ま す。
            1. 一 人 一 人 の 各 時点 の 冷凍 血清 サ ン プ ル を 解凍 (ス テ ッ プ プ 1.2 参照) 室温 で。
            2. PCR チ ュ ー ブ ス ト リ ッ プ (1 つ の ス ト リ ッ プ で の 10 管) の 管 に 各 解凍 血清 サ ン プ ル の 10 μ L の 因数 を 追加 し ま す。
              注: PCR チ ュ ー ブ ス ト リ ッ プ を 使用 し て の 大 き な 利 点 は, こ ん に ち の 試 金 の 次 の 手 順 で マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 で き る こ と こ れ は 大量 の 血清 サ ン プ ル を テ ス ト 時 に, 異 な る ウ イ ル ス 株 に 対 す る 抗体 価 の 同 じ サ ン プ ル の測定 を 繰 り 返 し 実 行 す る と き に 多 く の 時間 を 節約 で き ま す。
            3. 使用 す る ま で -80 ° C で PCR チ ュ ー ブ ス ト リ ッ プ に 検 体 の 血清 サ ン プ ル を 格納 し ま す。
            4. 1 日 こ ん に ち は 試 金 の 実 行 前 に 、 室温 で 関心 の 血清 サ ン プ ル 因数 を 解凍 し ま す。
            5. 空 の PCR チ ュ ー ブ に 適 切 な 抗 血清 の 10 μ L を 追加 し ま す。
              注: 肯定 的 な 制 御 と し て 、 特定 の ウ イ ル ス に 対 す る 抗 血清 は 使用 さ れ る イ イ ル ス 一致 し な け れ ば な り ま せ ん。 的 な。。。 な。 的 的 な
            6. マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し て 各 血清 因数 と 抗 血清 ・ 血清 の 1 ボ リ ュ ー ム に コ レ ラ 濾液 の 3 巻) コ レ ラ 濾液 ソ リ ュ ー シ 30
            7. PCR チ ュ ー ブ PCR 96 ウ ェ ル ラ ッ ク ま た は 空 の ヒ ン ト ボ ッ ク ス と 5 の 渦 を お い て s。
            8. 一 晩 で 37 ° C 熱 cicladora を 使用 し て サ ン プ ル を イ ン キ ュ ベ ー ト し ま す。
            9. 熱 cicladora を 使用 し て コ レ ラ の 濾液 を 不 活化 す る 30 分 の 56 ° C で サ ン プ ル を イ ン キ ュ ベ ー ト し ま す。
              注: 熱 cicladora に よ っ て こ の ス テ ッ プ は プ ロ セ ス を さ ら に 自動化 す る プ ロ グ ラ ム で き ま す。
            10. PCR チ ュ ー ブ PCR 96 ウ ェ ル ラ ッ ク ま た は 空 の ヒ ン ト ボ ッ ク ス と 5 の 渦 を お い て s。
            11. こ ん に ち は 試 金 の た め の 使用 す る ま で 冷 蔵 庫 で 4 ° C で サ ン プ ル を 格納 し ま す。


            図 5: プ レ ー ト デ ザ イ ン と こ ん に ち は ア ッ セ イ の ワ ー ク フ ロ ー 。 一 皿 に 二人 の 5 つ の 時間 ポ イ ン ト を 測定 で き ま す 。HI 抗体 価 は 8 か ら 1.024 を 範 囲 し ま す 肯定 的 的 な 制 御 使用 さ れ る 抗原 血清チ ェ ッ ク す る 背部 滴定 を 行 っ た 。2 個別 ワ ク チ ン 接種 者 の 血清 サ ン プ ル の シ リ ア ル 希 薄 化 表示 表示 れ れ ま ま す。 こ の 図 の 拡 大 版

            1. こ ん に ち は ア ッ セ イ
              注: こ ん に ち は ア ッ セ イ の 原理 図 は 、図 1を 参照 し て く だ さ い。 ウ イ ル ス に よ っ て 赤血 球 の 種 、 (表 1) 試 金 の た め に 使用 さ れ ま す 。96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 様 々 な 種類 で 使用 す る 赤血 球 の 種 と 非 細胞 の 出現 出現 と 同 様 、 イ ン キ キ ベ ベ表 2)。 こ ん に ち は 試 金 の た め ウ イ ル ス や 抗原 の 4 HA 単 位 は サ ン プ ル の 2 倍 希 釈 系列 に 追加 さ れ ま す。
              1. 抗原 溶液 の 調製
                1. 96 ウ ェ ル の プ レ ー ト 使用 数 に 応 じ て 抗原 溶液 の 体積 を 計算 (96 ウ ェ ル プ レ ー ト あ た り も × 96 = 2400 μ L 抗原 あ た り 25 μ L 抗原 100 μ L プ レ ー 分な / を 追加 合計 antige 2.5 mL プ レ ー ト ご と n)。
                  注: た と え ば 場合 100 の 血清 サ ン プ ル を 測定 、 10 皿 が 必要 (10 サ ン プ ル プ レ ー ト ご と): 合計 で 必要 な 抗原 溶液 2.5 mL × 10 = 25 mL。
                2. PBS を 使用 す る 計算 さ れ た 容積 の 4 HA 単 位 の 適 切 な 希 釈 を 準備 し ま す。
                  注: HA の 試 金 の た め 4 HA 単 位 が 決定 さ れ ま す。 抗原 の 適量 4 HA 単 位 に 対 応 す る 抗体 に よ っ て さ れ た た ボ リ リ ュ ー ム を 分割 し す 64 15.000 、 必要抗原 溶液 の μ L が 必要: 15.000 / 64 = 234,4 溶 存 凍結 乾燥 イ ン フ ル エ ン ザ 抗原 の μ L を 追加。
                1. 96 ウ ェ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト 使用 数 に 応 じ て 赤血 球 懸濁液 の 体積 を 計算 (よ く × 96 = 4800 μ L 赤血 球 懸濁液 96 ウ ェ ル プ レ ー ト あ た り あ た り 50 μ L の 赤血 球 懸濁液 200 μ L プ レ ー ト マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト用 の 貯 水池 の 使用 の た め に 余 分 な / を 追加).
                2. 赤血 球 在 庫 懸濁液 を 希 釈 (通常 10% 、 v / v O 人間 型 を 除 く) 適 切 な 0,75% と 1% 、 鳥類 と 哺乳類 の 赤血 球 濃度 を そ れ ぞ れ す る PBS の。
                1. (サ ン プ ル ID 、 肯定 的 な 制 御 、 お よ び 背部 滴定) 96 ウ ェ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト に ラ ベ ル を 付 け ま す。5 プ レ ー ト の 向 き を よ く 確認 く だ さ い。
                2. 25 μ L の PBS を 加 え る 「滴定 を 戻 る」 行 (図 5、 12 番 目 の 行) 最初 井 戸 中 に を 除 く す べ て の よ く マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し ま す し ま す。
                  注: 使用 さ れ る 抗原 希 釈 4 HA 単 位 に 等 し い か ど う か を チ ェ ッ ク す る 滴定 を 行 っ た 。4 HA 単 位 の 抗原 抗体 抗体 価 を 示 す 赤血 球 凝集 発の 3 つ の 井 戸 で も。
                3. 「滴定 を 戻 る」 行 (12 番 目 の 行) 最初 井 戸 に (5.2.1 で 説明) 準備 さ れ た 抗原 溶液 50 μ L を 追加 し ま す。
                4. マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し て 、 各 プ レ ー ト の 行 1 に 10 の 最初 の 井 戸 に RDE 治療 血清 サ ン プ ル の 25 μ L を 追加 し ま す。
                5. 肯定 的 な 制 御 と し て 11 番 目 の 行 の 最初 の 井 戸 の 中 に 適 切 な 抗 血清 を 25 μ l 添加 を 追加 し ま す。
                6. シ リ ア ル 2 倍 希 釈 を 実 行 す る に は 、 マ ル チ チ ャ ン ネ ル ピ ペ ッ ト を 使用 し て 連 続 井 に (1-12) の 各 行 の 最初 の 井を ピ ペ ッ テ ィ ン グ で 混 ぜ ま す。 サ ン プ ル ご と の 各 希 釈 段 階 の 同 じ ヒ ン ト を 使用 で き ま す。
                7. 最後 の ウ ェ ル ス の 最終 的 な 25 μ L を 破 棄 し ま す。
                8. 抗原 溶液 の 25 μ L を 追加 す る に は 、 行 1 に 11 (血清 と 抗 血清) の 各 ウ ェ ル に マ ル チ チ ン ネ ル ピ ペ ト を を 使用 し し す。 彼 ら は 井 戸。
                9. 「滴定 を 戻 る」 行 (12 番 目 の 行) の 各 ウ ェ ル に 抗原 で は な く 25 μ L の PBS を 追加 し ま す。
                10. タ ッ プ プ レ ー ト を 慎重 に 10 回 四方 を 混 在 さ せ る こ と に し ま す。
                11. 蓋 付 き プ レ ー ト を カ バ ー し 、 30 分 間 室温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し ま す。 抱卵 中 板 を 移動 し な い で く だ さ い。
                12. 赤血 球 懸濁液 50 μ L を 各 ウ ェ ル に 追加 し ま す。
                13. プ レ ー ト 慎重 に 10 倍 を タ ッ プ 4 四方 を ミ ッ ク ス し ま す。
                14. 蓋 付 き プ レ ー ト を カ バ ー し 、 RBC 種 使用 (表 2参照) に 応 じ て 適 切 な 時間 室温 で 孵化 さ せ な さ い。 抱卵 中 板 を 移動 し な い で く だ さ い。
                1. 鳥類 の 赤血 球 の 読 み 出 し
                  1. プ レ ー ト を 25 の 90 ° 傾 け s。
                    注: は 、 凝集 パ タ ー ン (完全 に 付 属 、 一部 付 属 と 非 凝集) の す べ て の 3 種類 が 傾 か な い と き タ ン と し し て 表示 さ れ る た め 鳥 パ
                  2. プ レ ー ト の 傾斜 の 位置 、 96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 印刷 方式 の 中 、 す ぐ に 結果 を マ ー ク し ま す。 鳥類 の 赤血 球 の 凝集 パ タ ー ン は 、図 3の と お り で す。
                  1. プ レ ー ト を 傾 け る こ と が な く 96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 印刷 方式 の 結果 を マ ー ク し ま す。
                    注: 赤血 球 凝集 が 発 生 す る と 、 付 属 の 細胞 我 慢 し な い で く だ さ い 井 戸 の 底 で ヘ イ ロ ー の よ う な 非 凝集 の 細胞 に 対。 部分 的図 3)。
                  2. 各 サ ン プ ル の HI を 決定 し 、 コ ン ピ ュ ー タ ー ベ ー ス の 表 (図 6) に 転 送
                  3. 注: 低 力 価 と し て 部分 的 に 付 属 の 井 戸 を 求 め た。 た と え ば 、 血清 サ ン プ ル を 完全 に 阻 も も 4 ま で 赤血 球 凝集 (希 釈 1: 64) 釈 1: 64)上水 、 HI 抗体 価 は 、 最終 的 な 分析 (図 6、 低 価 64 に 設定 さ れ て い ま す 。4 番 目 の 行)。


                  図 6: 鳥 の 赤血 球 と こ ん に ち は ア ッ セ イ の 読 み 出 し. 前 と 後 の ワ ク チ ン 接種 に よ る イ ン フ ル エ ン ザ 抗体 応 答 は, こ ん に ち の 試 金 に よ っ て 決 ま り ま す. こ の 例 で は, 1 つ 人 は 2 人 よ り も 高 い HI 抗体 を 持 っ て い ま す. 両 方 の 人 は ワ ク チ ン 接種 の 後抗体 応 答 を 表示 し ま す。 ワ ク チ ン 接種 後 180 ​​日間 両 方 の 人 の 抗体 価 は 再 び 減少 し ま し た。 こ の 図 の 拡 大 版 版 を 表示 す る の に は こ

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                  Resultados representativos

                  前 と 後 の ワ ク チ ン 接種 に よ る 抗体 応 答 を イ ン フ ル エ ン ザ A 型 H3N2
                  ワ ク チ ン に よ る 抗体 は 2014 年前 イ ン フ ル エ ン ザ A / H1N1 / カ リ フ ォ ル ニ ア / 2009, A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ / 02/2012 を 含 む 三 価 サ ブ ユ ニ ッ ト の 不 活化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン を 受 け た 26 の 健康 な ボ ラ ン テ ィ ア で評 価 さ れ た / 2015 年 の イ ン フ ル エ ン ザ シ ー ズ ン 。2 ワ ク チ ン 接種 者 の 代表 例 を図 6. に 示 し ま す 興味 深 い こ と に, そ の 特定 の イ ン フ ル エ ン ザ シ ー ズ ン 中 に テ キ サ ス / 2012 A / H3N2 型 循環 さ れ な か っ た と シ ー ズ ン が 多少 異 な る ウ イ ル ス 株 に 含 ま れ て 代 わ り に: A, H3N2 型, ス イ ス 連邦 共和国, 2013. A 、 H3N2 、 テ キ サ ス 州 、 2012 と 2013 年 A 月 H3N2 / ス イ ス 連邦 共和国 の ウ イ ル ス の ヘ マ グ ル チ ニ ン 97% 順序 の ア イ デ ン テ ィ テ ィ を表 4参照) 、 そ の 位置 は図 7で 強調 表示 さ れ ま す。


                  図 7: A / h3n2 型 イ ン フ ル エ ン ザ の ヘ マ グ ル チ ニ ン 比較 し ま す.A / テ キ サ ス / 50/2012 と A / ス イ ス / 9715293/2013 株 ウ イ ル ス の ヘ マ グ ル チ ニ ン を 比較 し ま し た. イ ン フ ル エ ン ザ A / ビ ク ト リ ア / 361/2011 18, テ キ サ ス ひ ず み と 95% 98% 順序 の ア イ デ ン テ ィ テ ィ を 表 わ す 非常 に 同 じよ う な ヘ マ グ ル チ ニ ン の 結晶 構造 を 用 い て こ れ ら の 系統 の 血球 凝集 素 結晶 構造 が な い の で ス イ ス 連邦 共和国 の 歪 み を 持 つ シ ー ケ ン ス ID. テ キ サ ス 州, ス イ ス の 系統 が 異 な る ア ミ ノ 酸 位置 が 強調 表示 さ れ ま す. こ の 図 の拡 大 版 を 表示 す る の に は こ こ を ク リ ッ ク し て く だ さ い。

                  A, H3N2 型, ス イ ス 連邦 共和国, 2013 と テ キ サ ス / 2012 A / H3N2 型 ウ イ ル ス 株 の 交差 反 応 性 の 免疫 反 応 を 観 察 し た. こ ん に ち は 価 イ ン フ ル エ ン ザ A / H3N2 / ス イ ス / 2013 に 対 し て 著 し く 低 か っ た 幾何 平均 抗体価 で 誘導 さ れ る seroprotección (図 8 a) と 比較 し て イ ン フ ル エ ン ザ A 型 H3N2 2012 // テ キ サ ス / (図 8 b)。


                  図 8: 健康 な ド ナ ー の 幾何 平均 抗体 価。 幾何 平均 - 抗体 (GMT) 25 健 常 者 前 と 後 の 予 防 接種 の 2 つ の 異 な る 抗原 を 使用 し て 決定 さ れ ま す 。A / H3N2 / ス イ ス / 2013 (A) お よ び A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 (B) の 平均 抗体 価 が 表示 さ れ ま す。 ワ ク チ ン 接種 に よ る 免疫 応 答 は 、 予 防 接種 (d0) の 前 に GMTs と 比較 し て (d7 d60) 、 ワ ク チ ン 後 後 チ ン 後、 GMTs は 再 び 減少 し ま す。 注 記 の う ち 、 唯一 A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 (ワ ク チ ン が) 保護 抗体 価 に 達 す る。 バ ー は 幾何 平均 価 を 95は 、 seroprotección の し き い 値 を 示 し ま す 。Seroprotegido 人 の% (力 価> 1:40) が グ ラ フ で 表示 さ れ ま す。 こ の 図 の 拡 大 版 を 表示 す る の に

                  予 防 接種 後 テ キ サ ス / 2012 A / h3n2 型 に 対 す る 抗体 価 は ほ と ん ど の で 増 加 A 、 h3n2 型 、 ス イ ス 連邦 共和国 、 、 2013と 同 様 に い く つ か の 科目 に 増 加 し ま し た。図 9H以下 の 強力 で す。


                  図 9: A / h3n2 型 イ ン フ ル エ ン ザ 間 の 交差 反 応 し ま す。 す べ て の 個人 と 時間 の ポ イ ン ト の A / H3N2 / テ キ サ ス 抗体 は 対 応 す る A / H3N2 / ス イ ス 抗体 に 対 し て プ ロ ッ ト さ れ。。 ま。。す る の に は こ こ を ク リ ッ ク し て く だ さ い。

                  使用 血液 の 種類 を に 基 づ い て 潜在 的 な 凝集
                  ウ イ ル ス の ヘ マ グ ル チ ニ ン は 、 赤血 球 を hemaglutinato に 別 の 種 依存性 を 示 し て い ま す。 こ 種 に 依存 し た た 効果 に は 、 赤血 球 凝集 抑制た 5 つ の ウ イ ル ス 抗原 を 赤血 球 の 最高 の 適 し て い る 型 (A と A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 年 イ ン フ ル エ ン ザ A / H1N1 / カ リ フ ォ ル ニ ア / 2009 B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ / 02/2012 イ ン フ ル エ ン ザ B / ブ リ ス ベ ン / 60/2008 / H3N2 / Suiza / 2013) 最大 の 凝集 も 最低 の 交差 反 応 性 を 達成 す る た め に。 生物学 的 標準 と コ ン ト ロ ー ル (NIBSC) 各 抗原 に 対 す る こ れ ら の ア ッ イ を ア ッ イ を を

                  イ ン フ ル エ ン ザ B, B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ / 02/2012 に よ る 抗体 応 答 が B / ブ リ ス ベ ン / 60/2008 に 対 し て 保護 を 提供 し な い こ と を 観 察 す る こ と. 対 照 的 に, B / ブ リ ス ベ ン / 60/2008 に 対 す る 抗体 は, 異 な る赤血 球 (表 3参照) で 4 倍 低 価 で B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ / 02/2012 に 対 し て 交差 反 応 性 を 示 し た. 関心 の モ ル モ ッ ト 血 で し た い な い 正 し く hemoaglutinan イ ン フ ル エ ン ザ * ト ル コ 血 前述 A / H3N2 / テ キ サ ス か ら 離 れ て 相 対 低 交差反 応 性 を hemaglutinato す る 可能性 と 高 い 抗体 価 を 示 す に 最 善 を 尽 く し た と / ス イ ス 連邦 共和国 の 系統。

                  ト ル コ モ ル モ ッ ト チ キ ン ヒ ト 型 O
                  B / ブ リ ス ベ ン 1024 - 1024 1024
                  B / マ サ チ ュ ー セ ッ ツ 州 1024 384 768 1024
                  A / H3N2 / ス イ ス 1024 1024 - 1024
                  A / H3N2 / テ キ サ ス 1024 1024 512 1024
                  A / H1N1 / カ リ フ ォ ル ニ ア 1024 1024 768 768

                  テ ー ブ ル 3:肯定 的 な 制 御 異 な っ た 種類 を 渡 っ て そ れ ぞ れ イ ン フ ル エ ン ザ HA 抗原 に 対 す る 抗体 で す

                  違 い ま す A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 ひ ず み A 、 h3n2 型 、 ス イ ス 連邦 共和国 、 2013 ひ ず み 位置
                  1 ア ス パ ラ ギ ン (N) ア ラ ニ ン (A) 128
                  2 ア ラ ニ ン (A) セ リ ン (S) 138
                  3 イ ソ ロ イ シ ン (I) Arginina (R) 140
                  4 Arginina (R) グ リ シ ン (G) 142
                  5 ア ス パ ラ ギ ン (N) セ リ ン (S) 145
                  6 フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン (F) セ リ ン (S) 159
                  7 グ リ シ ン (G) バ リ ン (V) 186
                  8 プ ロ リ ン (P) セ リ ン (S) 198
                  9 セ リ ン (S) フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン (F) 219
                  10 ア ス パ ラ ギ ン (N) ア ス パ ラ ギ ン 酸 (D) 225
                  11 * リ ジ ン (K) Arginina (R) 326
                  * ヘ マ グ ル チ ニ ン は 残渣 325 で 刈 り 取 ら た め 図 8 に 示 し た 結晶 構造 の 表示 さ れ ま せ ん。

                  表 4: A / H3N2 / テ キ サ ス / 2012 と 2013 年 A 月 H3N2 / ス イ ス 系統 ヘ マ グ ル チ ニ ン の ア ミ ノ 酸 の リ ス ト

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                  Discusión

                  前 と 後 の ワ ク チ ン 接種 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 抗体 価 の 定量 化 は, ワ ク チ ン 研究 に 必要 な 重要 な ツ ー ル で す .Seroprotection な ど の ウ イ ル ス 感染 症 に 対 す る 保護 の サ ロ ゲ ー ト の メ ジ ャ ー に 基 づ い て (> 1:40) ま た は セ ロ コ ン バ ー ジ ョ ン (力 価 の 4 倍 増) 、 予 防 接種 戦 略 を す る こ と が で き ま す 最適 化 さ れ た 9。 指定 さ れ た プ ロ ト コ を を 使用 し し て 判断 で き ま ル赤血 球 凝集 可能性。

                  変 更 と ト ラ ブ ル シ ュ ー テ ィ ン グ:

                  こ の プ ロ ト コ ル は ​​、 QUIÉN 標準 12 に 基 づ い て い ま す。 (手 順 5. を 参照) 血清 の 準備 の た め PCR チ ュ ー ブ ス ト リ リ ッ プ を 使用 し て 、 プ ロ ロア ッ セ イ の ス ル ー プ ッ ト を 向上 さ せ る 助 け た. さ ら に, 我 々 は 効果 的 な コ ス ト 超過 が 抗原 の 滴定 手 順 で 4 分 の 1 で 抗原 量 を 削減 し ま し た. サ ン プ ル 量 が 限 ら れ て い る 場合 は 特 に 役 立 ち ま す RDE の治療 の た め 血清 (10 μ L) の よ り 低 い 量 を 使用 で き ま す (、 マ ウ ス 血清)。 背部 滴定 お よ び 肯定 的 な 制 御 は 、 適 切 な 内部 統制 と し て 機能 し 、 赤血 球 の 老化 を 監視 す る 抗体 測定 プ レ ー ト に 含 ま れ

                  さ ら に, 赤血 球 血栓 良 い ビ ジ ュ ア ル 読 み 出 し の た め の 最適 な サ イ ズ を 設定 す る の に OMS 標準 12 の そ れ ら よ り 別 の 赤血 球 濃度 を 使用 し ま し た. こ れ を 保証 す る に は, 測定 前 に 赤血 球 濃度 を チ ェ ッ ク を お 勧 めし ま す。 と は い え 、 こ の 部分 を 最適 化 プ ロ ト コ ル 我 々 し て い な い 、 OD や 細胞 数 と 吸光度 測定 な ど の 方法 を 使用 で き ま す。

                  場合 は 、 RDE は 完全 に 不 活性 化 さ れ ず 、 赤血 球 は 凝集 反 応 を 室温 で 測定 す る 場合 desializado と 逆 ハ 正 井 戸 す る る こ と が で き ま す。 我 々 RDE 活性 は 4 ° C で 有意 に 低 い の で こ ん に ち は 4 ° c を 実 行 す る 提案 し ま す。 た だ し 、 4 ° C で こ ん に ち は 試 金 の 実 行 は 遅 く く

                  こ ん に ち は 試 金 の い く つ か の 重要 な 側面 は 、 次 の 点: 興味 深 い こ と に 、 血球 凝集 反 応 は 赤血 球 (例 え ば, ト ル コ ま た は モ ル モ ッ ト 赤血 球) の 特定 の 種類 に 強 く 依存 し ま す. 血 の 最適 な 型 は, 特定 の ウ イ ル ス 株 が 評 価 さ れ, 分析 を 通 じ て 使用 さ れ る 同 種 血 の 前 に テ ス ト 必要 が あ り ま す. ウ イ ル ス 間 の 交差反 応 性 の 誘導 は, わ ず か に 新 し い ウ イ ル ス 19, 20 の 場合 免疫 学 的 利 点 を 生成 可能性 が あ り ま す, 低 特異性 に よ る 診断 の 視点 か ら い く つ か の 問題 が あ り ま す. し た が っ て, 類似 の ウ イ ル ス 間 の 交差 反 応す る 必要 が あ り ま す 慎重 に 対 処 し て 研究 に つ い て は 後 述 し ま す。 赤血 球 を 選 択 す る と 特定 の 種 か ら 、 交差 反 応 性 の 量 量 を や

                  こ ん に ち は, 高 い 再現 性 と 信 頼 性 の 高 い 結果 を 提供 す る 老 舗 の ゴ ー ル ド ス タ ン ダ ー ド 方法 で す. こ ん に ち HA 茎 ル ー プ に バ イ ン ド し, そ れ に よ り 中 和 と 相関 す る 抗体 を 検 出 す る だ け に 対 し, ELISA な ど の 手法は 非 中 和 抗体 を 検 出 が あ り ま す。

                  プ ロ ト コ ル の 中 で 重要 な ス テ ッ プ:

                  最 も 重要 な 手 順 は 、 RDE 非 特異 的 阻 害 剤 と バ イ ン デ ィ ン グ を 不 活化 す る と 血清 治療 ウ イ ル ス の ha。 も う 一 つ の 重要な ス テ ッ プ で す 、 赤血 球 の 溶血 反 応 の 制 御 時間 を か け て 彼 ら の 年 齢 と し て。

                  将来 の ア プ リ ケ ー シ ョ ン:

                  プ ロ ト コ ル は ​​潜在 的 な 凝集 反 応 で 他 の ウ イ ル ス の 使用 可能性 が あ り ま す。 結果 を 示 さ れ て ひ と 血清 血清 中 の サ ン プ ル を こ に ル ル を こ 培養 ル を こ に ル を こ に を こ に清 中 の 細胞 培養 、 マ ウ ス 血清 中 の 抗体 価 を 測定 す る ア ッ セ イ を 使 え ま す。 要約 す る と 、 こ ん に ち は 、 ワ ワ ク チ ン に よ る 抗体 の の


                  ¿Dónde puedo encontrar los datos del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)? - biología

                  La presencia de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle en pollos se detecta mediante pruebas serológicas. Los resultados de estas pruebas se utilizan para tres propósitos.

                  1. Evaluar la eficacia de la vacuna contra la enfermedad de Newcastle en ensayos de laboratorio y de campo.

                  2. Evaluar el nivel de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle en el campo.

                  3. Se utiliza suero que se sabe que contiene anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle para confirmar la presencia del virus de la enfermedad de Newcastle en una muestra de prueba de líquido alantoideo. Esta muestra se obtendría durante el aislamiento del virus virulento de la enfermedad de Newcastle. Consulte la Sección 15.

                  Hay dos ensayos que se utilizan habitualmente para realizar pruebas serológicas de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle.

                  1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). La prueba HI es un ensayo conveniente y de uso común que requiere reactivos baratos y se lee a simple vista.

                  2. ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Este es un ensayo colorimétrico y requiere el uso de un instrumento sofisticado para leer la densidad óptica de las reacciones. Los kits de ELISA para la detección de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle se preparan y venden comercialmente. Las instrucciones detalladas se suministran con los kits. Suelen ser bastante caras.

                  En este manual se utilizará un protocolo para la prueba HI basado en la prueba descrita por Allan y Gough para las pruebas serológicas. (Allan y Gough, 1974 a.)

                  Se recolectan muestras de suero para analizar la presencia de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle. La sangre se recolecta como se describe en la Sección 7. La sangre forma un coágulo en la jeringa en unos pocos minutos. Una vez que la sangre se coagula, las jeringas de sangre se pueden mantener con la aguja en posición vertical para evitar que el suero llene la tapa de la aguja. El suero se separará del coágulo en unas pocas horas a temperatura ambiente o en aproximadamente 2 horas a 37 ° C y 176 ° C. El almacenamiento a 37 ° C y # 176 ° C ayudará a que el suero se separe del coágulo.

                  • Jeringas con muestras de sangre.
                  • Pipetas Pasteur de vidrio estériles.
                  • Tubos de microfuga.
                  • Tubos de almacenamiento. (Los criotubos Nunc de 1,8 ml son ideales, pero los tubos de microcentrífuga son una alternativa más económica).
                  • Recipiente para objetos punzantes y bolsa de desecho para desechos biológicos.

                  1. Retire el émbolo de la jeringa. Transfiera el suero a un tubo de microcentrífuga vertiendo o usando una pipeta Pasteur de vidrio.

                  2. Deseche las agujas, jeringas, coágulos y pipetas en recipientes adecuados.

                  3. A menudo, el suero contiene glóbulos rojos. Centrifugar durante 30 segundos en una centrífuga de microcentrífuga o dejar reposar por gravedad durante la noche a 4 ° C y 176 ° C para sedimentar las células. No congele las muestras en este paso. La congelación lisará los glóbulos rojos.

                  4. Transfiera el suero transparente a un segundo tubo.

                  5. Recuerde etiquetar cada tubo después de la transferencia del suero. Esto asegura que los resultados de la serología se puedan aplicar a aves individuales y grupos.

                  Almacene las ampollas de suero a -20 & # 176C.

                  El almacenamiento a 4 ° C y # 176 ° C es aceptable por un período corto, hasta 2 semanas.

                  Las muestras recolectadas en el campo pueden terminar a temperatura ambiente durante la noche y, a menudo, no se separan bien.

                  Se ha observado en el Laboratorio de Virología John Francis que en algunas muestras el suero no se separa del coágulo. En estos casos, se centrifuga todo el coágulo. Esto generalmente resulta en una pequeña cantidad de suero que se separa.

                  Es importante que las muestras de suero sean claras. Las muestras rosadas contienen glóbulos rojos lisados. Cuando se analizan muestras de color rosa, observe cuidadosamente las muestras de prueba y de control para determinar el efecto del color en los resultados de la prueba.

                  Las muestras de color rosa pueden afectar los resultados de un ELISA, que es un ensayo colorimétrico.

                  Una descripción general de la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI)

                  La respuesta de los anticuerpos a la proteína hemaglutinina en la envoltura del virus de la enfermedad de Newcastle puede medirse mediante la prueba de IH.

                  Cuando el suero que contiene estos anticuerpos se mezcla con el virus de la enfermedad de Newcastle, los anticuerpos se unen a la proteína hemaglutinina en la envoltura del virus. Esto bloquea la unión de la proteína hemaglutinina con el sitio receptor en los glóbulos rojos de pollo.

                  Por tanto, se inhibe la reacción de hemaglutinación entre el virus y los glóbulos rojos.

                  Al realizar dos diluciones seriadas en el suero antes de la prueba, la concentración de los anticuerpos séricos se puede expresar como un título HI en base logarítmica 2.

                  Estandarización de la prueba HI

                  Es importante que exista correlación entre los resultados de las pruebas realizadas por diferentes técnicos y en diferentes laboratorios. Por esta razón, las pruebas de IH deben estandarizarse tanto dentro de un laboratorio como entre laboratorios.

                  La estandarización se logra siguiendo un protocolo estándar. Esto incluirá:

                  Utilizando 4 unidades HA estándar de antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle.

                  Utilizando suero anti-suero positivo estándar y suero negativo.

                  Incluyendo un control de suero para cada suero de prueba para detectar la presencia de aglutininas inespecíficas.

                  Usando una dilución estándar del 1 por ciento de glóbulos rojos.

                  El uso de suero de control en la prueba de HI.

                  Los sueros de control positivos y negativos se analizan para evitar errores en la interpretación de los resultados de la prueba HI. Las inconsistencias en los resultados de la prueba HI pueden deberse a variaciones en los reactivos y procedimientos.

                  Ejemplos de posibles variaciones incluyen:

                  La fuente y el porcentaje exacto en volumen de glóbulos rojos.

                  La cantidad exacta de antígeno utilizada en la prueba HI.

                  Precisión de diluciones.

                  Temperatura.

                  Tiempo permitido para que ocurran las reacciones anticuerpo / antígeno.

                  Calidad de las muestras de suero de prueba (las muestras de suero hemolizado pueden ser responsables de reacciones inespecíficas)

                  Se utilizan dos sueros estándar.

                  1. Un suero de control negativo estándar que se sabe que no contiene anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle. No tiene título HI y no aglutina los glóbulos rojos de pollo.

                  2. Un suero de control positivo estándar también conocido como antisuero estándar. El título HI del antisuero se habrá establecido mediante titulaciones repetidas.

                  Variabilidad en los títulos de HI del suero positivo estándar

                  A veces se observa que el título HI estándar del antisuero estándar probado el mismo día con la misma preparación de antígeno y protocolo puede variar. Una diferencia en el título de HI de una dilución que es una base logarítmica 2 (2 1) puede considerarse debido a errores aleatorios y una variabilidad inherente en las respuestas biológicas. Sin embargo, si el título del suero positivo estándar difiere en más de una dilución o base logarítmica 2, la prueba se invalida. En este caso, se debe preparar y analizar antígeno nuevo y repetir la prueba HI.

                  Tres categorías de sueros estándar

                  1. Suero de referencia estándar internacional. Algunos laboratorios preparan suero de referencia con un estándar muy alto. El suero estándar de referencia contra la enfermedad de Newcastle está disponible para su compra. Se utiliza como suero de referencia en la preparación de sueros estándar nacionales y de laboratorio.

                  El Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos (NIBSC) del Reino Unido puede suministrar un suero de referencia estándar internacional. La potencia del suero de referencia internacional ha sido determinada por el proveedor y se expresa en Unidades Internacionales (UI) por ampolla de suero liofilizado.

                  Correo electrónico [email & # 160protected]
                  Tel 44 (0) 1707 654753
                  Fax 44 (0) 1707 646730
                  Sitio web http://www.nibsc.ac.uk

                  2. Un laboratorio nacional prepara el suero estándar nacional y lo distribuye a los laboratorios colaboradores según sea necesario. Este suero se prepara mezclando sueros con títulos HI conocidos. Se lleva a cabo una serie de pruebas de HI para establecer el título de HI del estándar nacional. Esto se compara con el título HI del suero de referencia estándar internacional, si está disponible. Luego, el suero estándar nacional se almacena en múltiples alícuotas y se distribuye a los laboratorios colaboradores dentro de un país.

                  3. Algunos laboratorios preparan suero estándar de laboratorio para conservar los suministros de suero estándar nacional. El estándar de laboratorio se prepara mezclando muestras de suero con títulos de HI conocidos. La prueba de HI comparativa del estándar de laboratorio y el estándar nacional se utiliza para establecer el título de HI del estándar de laboratorio.

                  Preparación de sueros estándar nacionales y de laboratorio

                  Cada laboratorio requerirá un suministro de suero de control negativo y positivo para realizar pruebas de IH en muestras de suero.

                  Recolección de suero HI negativo

                  Recolecte suero de pollos que no hayan estado expuestos al virus de la enfermedad de Newcastle. El suero no debe mostrar inhibición de la actividad de hemaglutinación viral cuando se analiza mediante la prueba HI. A menudo es difícil encontrar suero sin actividad HI. En este caso, utilice suero con títulos HI bajos de 2 1.

                  Recolección de suero positivo para HI

                  Puede haber suero almacenado que sea adecuado para este propósito. Si no es así, vacune a varios pollos con la vacuna I-2 contra la enfermedad de Newcastle. Dos semanas después de la vacunación primaria, administre una vacuna de refuerzo. Dos semanas después, tome una muestra de suero de cada pollo y pruebe el título de HI. Recolecte suero adicional de pollos con un título de 2 5 o más. El volumen de sangre extraído de cada pollo depende del tamaño del pollo. Reúna todas las muestras de suero con títulos HI de 2 5 o más y pruebe el título HI del suero combinado.

                  Pruebas comparativas de HI de sueros estándar nacionales y de referencia internacional

                  La información proporcionada por NIBSC en 2001 indicó que su referencia estándar internacional contenía 320 UI por ampolla.

                  El suero se puede reconstituir en PBS. Un volumen adecuado de PBS sería de 2 ml, lo que daría 4 UI en la muestra de prueba de 25 & # 181L. Consulte las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

                  Utilice la prueba HI estándar descrita en esta sección para determinar el título del estándar de referencia internacional y del estándar nacional.

                  Analice ambas muestras por triplicado en la misma placa de micropocillos.

                  Realice una serie de al menos tres pruebas en días diferentes.

                  Una vez que se hayan establecido el título de HI del suero estándar internacional y el suero estándar nacional, prepare una serie de diluciones dobles del suero que se distribuyan alrededor del punto final utilizado para establecer los títulos de HI. Valorar las diluciones que van desde la inhibición completa hasta la ausencia de inhibición como una comprobación adicional de los títulos de HI. Los resultados de la prueba de estas diluciones confirmarán el título HI del suero sin diluir.

                  Ejemplo de confirmación del título HI de muestras estándar probando una serie de diluciones de la muestra.

                  Las pruebas repetidas del suero combinado establecieron el título HI en 2 5.

                  Prepare diluciones 1/8, 1/16, 1/32 y 1/64 del suero combinado.

                  Pruebe cada dilución para el título HI.

                  Resultados confirmatorios: Los resultados en la tabla confirman que el título HI del suero utilizado para preparar las diluciones tenía un título de 2 5.

                  Tabla 3: Resultados que confirman el título de HI en suero = 2 5

                  Los resultados de la prueba darán un título HI tanto para el suero de referencia internacional como para el suero de laboratorio nacional que se está analizando. El título HI de 4 UI del suero de referencia internacional se puede utilizar para determinar el número de UI en el suero de referencia nacional.

                  La prueba HI estándar de 25 & # 181L del suero de referencia internacional que contiene 4 UI y tiene un título HI de 8 (2 3). El título de HI probado en suero nacional de 64 (2 6).

                  ¿Cuántas UI contiene el suero nacional?

                  4 UI en una muestra con un título HI de 8.

                  ¿Cuántas (?) UI en una muestra con un título HI de 64.

                  No todos los laboratorios utilizan el mismo protocolo para analizar el título de HI y las UI son independientes del sistema de análisis utilizado.

                  Los resultados serológicos de las muestras expresadas en UI deben dar resultados equivalentes cuando se analizan con diferentes sistemas.

                  La comparación del título HI del suero nacional estándar con el título HI del suero de referencia internacional le permite expresar los resultados de las pruebas HI en UI. Sin embargo, no es muy frecuente que se le pida que exprese los resultados de las pruebas de HI en UI.

                  La mayoría de las publicaciones de los resultados de la serología de la enfermedad de Newcastle describen el ensayo utilizado y expresan los títulos de HI en base logarítmica 2.

                  Preparación de un suero estándar de laboratorio

                  Cada laboratorio debe recibir un suero estándar nacional de un laboratorio central. El título de HI y la actividad en unidades internacionales del suero se habrán determinado mediante pruebas rigurosas como se describe anteriormente. Para conservar el suministro de suero estándar nacional, algunos laboratorios decidirán preparar un suero estándar de laboratorio secundario.

                  Recoja el suero positivo como se describe arriba. Realice pruebas comparativas del laboratorio y los estándares nacionales. Analice cada muestra por triplicado en la misma placa de micropocillos. Repita varias veces y analice los títulos de HI para ambas muestras. Registre el título HI para el estándar de laboratorio.

                  Almacene alícuotas de 1 ml del estándar de laboratorio a -20 ° C y # 176 ° C. Este estándar se utiliza cada vez que se realiza la prueba HI y siempre debe mostrar el mismo título HI cuando se prueba con las 4 unidades HA de antígeno.

                  Preparación de un suero estándar nacional sin un suero de referencia internacional

                  Muchos laboratorios no podrán obtener un suero de referencia internacional con el que comparar su suero estándar nacional. En este caso, se requerirán pruebas de HI más rigurosas de las muestras de suero positivas para HI combinadas para establecer el título de HI del suero estándar. Se sugiere que el suero se analice hasta diez veces. Utilice 4 unidades HA de antígeno recién preparadas para cada prueba y realice la prueba en días diferentes si es posible. Los resultados serán un rango de títulos HI. El título que ocurre con más frecuencia puede considerarse el título HI del suero estándar. Todas las futuras pruebas de IH realizadas con el suero estándar deben dar este título.

                  Almacenamiento de suero estándar

                  Una vez que se han analizado los sueros estándar positivos y negativos, las alícuotas se pueden preparar, etiquetar y almacenar congeladas. El almacenamiento a -70 & # 176C es óptimo (pero -20 & # 176C es adecuado). No descongele y vuelva a congelar las muestras con frecuencia. Se deben descongelar y analizar muestras representativas para confirmar que no hay pérdida de título en el proceso de almacenamiento.

                  Preparación del antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle para su uso en pruebas de IH

                  El antígeno se prepara inoculando huevos embrionados con una muestra del virus de la enfermedad de Newcastle y recolectando el líquido alantoideo cuatro días después. Parte del primer lote de vacuna contra la enfermedad de Newcastle I-2 preparada a partir de la semilla de trabajo I-2 puede reservarse para su almacenamiento como antígeno. Un volumen de 50 ml a 100 ml es adecuado para una gran cantidad de pruebas. Centrifugue la muestra a 1200 g para aclarar y eliminar los glóbulos rojos contaminantes. Almacene el antígeno en alícuotas de un ml a -20 ° C y # 176 ° C.

                  Preparación de unidades 4HA de antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle

                  La cantidad estándar de virus de la enfermedad de Newcastle utilizada en la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI) es de 4 unidades HA. Es necesario preparar y probar una suspensión del virus de la enfermedad de Newcastle que contenga 4 unidades HA para realizar la prueba HI. Esto implica una serie de pasos siguientes.

                  1. Valorar la suspensión almacenada de virus que se utilizará como antígeno en la prueba HI. Consulte la Sección 10 Calcule el título de HA.

                  2. Calcule el factor de dilución requerido para producir 4 unidades HA. Una forma sencilla es dividir el título de HA entre 4.

                  3. Aplicar el factor de dilución y diluir la suspensión original de antígeno en PBS para producir un volumen adecuado de antígeno 4HA para realizar la prueba HI. Deje 2,5 ml por cada placa de micropocillos.

                  4. Valorar la suspensión de virus diluida (4HA). Se trata de una titulación por retroceso para comprobar que el antígeno diluido contiene 4 unidades de HA.

                  5. Lea el título de HA. Debe ser igual a unidades de 4HA. Si no es así, ajuste la dilución y vuelva a titular.

                  6. Utilice la unidad de dilución 4HA de antígeno en una prueba HI para analizar el suero estándar positivo y negativo. El título HI del suero positivo estándar de laboratorio debe ser igual al título predeterminado.

                  Los resultados de la titulación por retroceso del antígeno diluido y el título HI del estándar positivo se utilizan para confirmar que el antígeno se ha diluido a una concentración equivalente a las 4 unidades estándar de HA.

                  Si el título HI del suero de control positivo es menor que el título estándar, el antígeno está demasiado concentrado. Prepare una nueva dilución y pruebe de nuevo.

                  Por el contrario, si el título HI del suero de control positivo es demasiado alto, el antígeno está demasiado diluido. Prepare una nueva dilución y pruebe de nuevo.

                  Preparación de 4 unidades HA de antígeno para prueba HI en placas de 10 micropocillos:

                  El título de HA del antígeno se probó de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. El título de HA = 128

                  Cálculo del factor de dilución para preparar 4 unidades HA: 128/4 = 32

                  Cálculo del volumen de la unidad de dilución 4HA del antígeno requerido:

                  Deje 2,5 mL por placa, volumen total requerido = 10 & # 215 2,5 mL = 25 mL

                  Aplicar factor de dilución = 25 mL / 32 = 0,781 mL = 781 & # 181L

                  Preparación del antígeno diluido: mezclar 781 & # 181L de la suspensión original del virus con 24.219 mL de diluyente. PBS es un diluyente adecuado.

                  Nota: En este caso, sería más fácil preparar 32 ml del antígeno 4HA. Esto usaría 1 mL de la suspensión original diluida en 31 mL de PBS.

                  • Muestras de suero descongeladas en gradillas
                  • Placas y tapas de micropocillos con fondo en V
                  • PBS
                  • 1 por ciento de glóbulos rojos lavados
                  • Bandeja de reactivo con fondo en V
                  • Pipetas y puntas de 25 & # 181L mono y multicanal
                  • Hoja de registro de placa de micropocillos.
                  • Antígeno del virus de la enfermedad de Newcastle diluido a 4 unidades de HA por 25 & # 181L
                  • Suero estándar positivo y negativo

                  1. Complete las hojas de registro para registrar cómo se dispensarán las muestras en las placas de micropocillos.

                  2. Calcule el número de platos necesarios y numere cada plato.

                  3. Dispense 25 & # 181L de PBS en cada pocillo de las placas.

                  4. Agite cada muestra de suero y dispense 25 & # 181L en el primer pocillo y el último pocillo (control) de una fila de una placa de micropocillos.

                  5. Utilice una pipeta multicanal para hacer diluciones en serie dobles a lo largo de la fila hasta el penúltimo pocillo desde el final. El último pocillo es el control de suero. No lo diluyas bien. Consulte el Apéndice 4 para obtener instrucciones sobre cómo realizar diluciones en serie dobles.

                  6. Agregue 25 & # 181L de la dilución de antígeno 4HA a cada pocillo excluyendo los pocillos de control en la última columna. Consulte la Sección 10 para obtener información sobre la preparación de unidades de antígeno 4HA.

                  7. Golpee suavemente los lados de las placas de micropocillos para mezclar los reactivos. Cubra los platos con una tapa. Deje reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

                  8. Agregue 25 & # 181L de glóbulos rojos lavados al 1 por ciento a cada pocillo, incluidos los pocillos de control en la última columna.

                  9.Golpee suavemente los lados de las placas de micropocillos para mezclar los reactivos. Cubra los platos con una tapa. Deje reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos.

                  10. Lea los patrones de sedimentación de cada muestra de suero. Lea primero el suero de control y luego lea los patrones en los otros pocillos.

                  11. Registre el patrón observado en cada pocillo en una hoja de registro de placa de micropocillos. Determine el punto final. Este es el punto donde hay una inhibición completa de la hemaglutinación.

                  12. Registre el nivel de anticuerpos para cada muestra de suero. Esto se expresa como una base logarítmica 2. Por conveniencia, el título a menudo se registra solo como el índice logarítmico. Por ejemplo, un título de 2 6 se registraría como 6.

                  interpretación de resultados

                  En los pocillos donde están presentes los anticuerpos habrá inhibición de la hemaglutinación. Los glóbulos rojos se asentarán como un botón.

                  En los pozos donde no hay anticuerpos, los glóbulos rojos se aglutinarán.

                  El punto final de la titulación es el pocillo que muestra una inhibición completa de la hemaglutinación. A veces no es fácil de determinar. Observe el tamaño del botón como una indicación del grado de inhibición de la hemaglutinación. Utilice bien el control como punto de comparación. Sea consistente al determinar el punto final.

                  La enzima neuraminidasa presente en la partícula del virus eventualmente romperá el vínculo entre el virus y los glóbulos rojos. Este proceso se llama elución.

                  Cuando se produce la elución, los glóbulos rojos ya no se aglutinan. Ruedan hacia abajo por el costado de las placas de micropocillos con fondo en V para parecerse al patrón de asentamiento negativo, un botón apretado.

                  Algunas cepas del virus de la enfermedad de Newcastle eluyen más rápidamente y la prueba debe leerse antes de que esto ocurra.

                  Por lo general, la elución tarda más de 45 minutos. Un pozo de control con virus y glóbulos rojos es útil para determinar el tiempo de elución.

                  Algunos sueros pueden contener sustancias distintas de los anticuerpos que inhiben la hemaglutinina viral. Estas sustancias se describen como inhibidores inespecíficos y rara vez se observan con suero de pollo y enfermedad de Newcastle.

                  Algunos sueros de pollo contienen sustancias que aglutinan los glóbulos rojos de pollo. El patrón de sedimentación de las células aglutinadas es similar al producido por el virus de la enfermedad de Newcastle. Estas aglutininas naturales están presentes en baja concentración. El suero de control indicará bien la presencia de aglutininas naturales.

                  Adsorción de aglutininas naturales

                  Si hay aglutininas naturales presentes en una muestra de suero, se pueden eliminar mediante adsorción con glóbulos rojos de pollo. Luego, el suero se puede volver a analizar en la prueba HI.

                  • Suspensión de glóbulos rojos de pollo lavados al 10 por ciento.
                  • Tubo de microfuga (Eppendorf)
                  • Micropipeta, 200 & # 109L a 1000 & # 109L y puntas
                  • Desechar la bandeja
                  • Centrífuga de microcentrífuga
                  • Muestras de suero

                  1. Coloque 200 & # 109L del 10 por ciento de glóbulos rojos lavados en un tubo de microcentrífuga.

                  2. Centrifugue durante 15 segundos.

                  3. Retire el sobrenadante.

                  4. Agite la muestra de suero y retire 500 & # 109L de suero. Algunas muestras pueden contener menos volumen. Utilice una nueva punta para cada muestra.

                  5. Agregue el suero a los glóbulos rojos en el tubo de microcentrífuga. Mezclar suavemente.

                  6. Deje reposar durante no menos de 30 minutos a 4 & # 176C.

                  7. Centrifugar durante 15 segundos.

                  8. Retire el suero (sobrenadante) inmediatamente y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio.

                  9. Almacene los sueros adsorbidos a 4 ° C y 176 ° C durante la noche o a -20 ° C ° 176 ° C durante períodos más prolongados.


                  Aglutinación de bacterias y virus.

                  El uso de pruebas de aglutinación para identificar bacterias estreptocócicas fue desarrollado en la década de 1920 por Rebecca. Lancefield trabajando con sus colegas A.R. Dochez y Oswald Avery. [1] Usó anticuerpos para identificar Proteína M, un factor de virulencia de los estreptococos que es necesario para la capacidad de la bacteria de causar faringitis estreptocócica. La producción de anticuerpos contra la proteína M es crucial para generar una respuesta protectora contra las bacterias.

                  Lancefield usó antisueros para mostrar que diferentes cepas de la misma especie de estreptococos expresan diferentes versiones de la proteína M, lo que explica por qué los niños pueden contraer faringitis estreptocócica repetidamente. Lancefield clasificó los estreptococos beta-hemolíticos en muchos grupos basándose en diferencias antigénicas en polisacáridos específicos de grupo ubicados en la pared celular bacteriana. Las cepas se llaman serovares porque se diferencian mediante antisueros. Es importante identificar los serovares presentes en un brote de enfermedad porque algunos serovares pueden causar una enfermedad más grave que otros.

                  Figura 2. Se unieron anticuerpos contra seis serovares diferentes del estreptococo del grupo A a perlas de látex. Cada una de las seis preparaciones de anticuerpos se mezcló con bacterias aisladas de un paciente. Los pequeños grupos que se ven en el pozo 4 son indicativos de aglutinación, que está ausente en todos los demás pozos. Esto indica que el serovar asociado con el pocillo 4 está presente en la muestra del paciente. (crédito: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología)

                  El método desarrollado por Lancefield es un ensayo de aglutinación directa, ya que las propias células bacterianas se aglutinan. Una estrategia similar se usa más comúnmente en la actualidad cuando se identifican serovares de bacterias y virus; sin embargo, para mejorar la visualización de la aglutinación, los anticuerpos pueden unirse a inertes. perlas de látex. Esta técnica se llama ensayo de aglutinación indirecta (o ensayo de fijación de látex), porque la aglutinación de las perlas es un marcador de la unión del anticuerpo a algún otro antígeno (Figura 2). Pueden usarse ensayos indirectos para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos.

                  Para identificar anticuerpos en el suero de un paciente, el antígeno de interés se une a perlas de látex. Cuando se mezclan con el suero del paciente, los anticuerpos se unirán al antígeno, entrecruzando las perlas de látex y haciendo que las perlas se aglutinen indirectamente, lo que indica la presencia del anticuerpo (Figura 3). Esta técnica se utiliza con mayor frecuencia al buscar IgM anticuerpos, porque su estructura proporciona la máxima reticulación. Un ejemplo ampliamente utilizado de este ensayo es una prueba para factor reumatoide (RF) para confirmar un diagnóstico de artritis reumatoide. RF es, de hecho, la presencia de anticuerpos IgM que se unen al propio paciente. IgG. La RF aglutinará las perlas de látex recubiertas de IgG.

                  En la prueba inversa, los antígenos solubles se pueden detectar en el suero de un paciente uniendo anticuerpos específicos (comúnmente mAb) a las perlas de látex y mezclando este complejo con el suero (Figura 3).

                  Figura 3. (a) Las perlas de látex recubiertas con un antígeno se aglutinarán cuando se mezclen con el suero del paciente si el suero contiene anticuerpos IgM contra el antígeno. (b) Las perlas de látex recubiertas con anticuerpos se aglutinarán cuando se mezclen con el suero del paciente si el suero contiene antígenos específicos de los anticuerpos.

                  Las pruebas de aglutinación se utilizan ampliamente en países subdesarrollados que pueden carecer de instalaciones adecuadas para cultivar bacterias. Por ejemplo, el Prueba de Widal, utilizado para el diagnóstico de fiebre tifoidea, busca aglutinación de Salmonella enterica subespecie typhi en sueros de pacientes. La prueba de Widal es rápida, económica y útil para monitorear la extensión de un brote, sin embargo, no es tan precisa como las pruebas que involucran el cultivo de la bacteria. La prueba de Widal frecuentemente produce falsos positivos en pacientes con infecciones previas con otras subespecies de Salmonela, así como falsos negativos en pacientes con hiperproteinemia o inmunodeficiencias.

                  Además, las pruebas de aglutinación están limitadas por el hecho de que los pacientes generalmente no producen niveles detectables de anticuerpos durante la primera semana (o más) de una infección. Se dice que un paciente se ha sometido seroconversión cuando los niveles de anticuerpos alcanzan el umbral de detección. Por lo general, la seroconversión coincide con la aparición de signos y síntomas de la enfermedad. Sin embargo, en una infección por VIH, por ejemplo, generalmente se necesitan 3 semanas para que se produzca la seroconversión y, en algunos casos, puede llevar mucho más tiempo.

                  De manera similar a las técnicas para la prueba de anillo de precipitina y los ensayos de placa, es habitual preparar diluciones dobles en serie del suero del paciente y determinar el título de anticuerpo aglutinante presente. Dado que los niveles de anticuerpos cambian con el tiempo en las respuestas inmunitarias tanto primarias como secundarias, al verificar las muestras a lo largo del tiempo, se pueden detectar cambios en el título de anticuerpos. Por ejemplo, una comparación de título durante el Fase aguda de una infección versus el título de la fase de convalecencia distinguirá si una infección es actual o ha ocurrido en el pasado. También es posible controlar qué tan bien está respondiendo el sistema inmunológico del paciente al patógeno.

                  Mire este video que demuestra las reacciones de aglutinación con perlas de látex.

                  Piénsalo

                  • ¿Cómo se usa la aglutinación para distinguir los serovares entre sí?
                  • En un ensayo de perlas de látex para detectar anticuerpos en el suero de un paciente, ¿con qué se recubren las perlas?
                  • ¿Qué ha sucedido cuando un paciente se ha sometido a seroconversión?

                  Hemaglutinación

                  La aglutinación de glóbulos rojos se llama hemaglutinación. Un ensayo común que usa hemaglutinación es el prueba directa de Coombs, también llamado el prueba directa de globulina antihumana (DAT), que generalmente busca anticuerpos no aglutinantes. La prueba también puede detectar el complemento adherido a los glóbulos rojos.

                  La prueba de Coombs se emplea a menudo cuando un recién nacido tiene ictericia, coloración amarillenta de la piel causada por concentraciones sanguíneas elevadas de bilirrubina, un producto de la descomposición de la hemoglobina en la sangre. La prueba de Coombs se utiliza para determinar si los glóbulos rojos del niño se han unido a los anticuerpos de la madre. Estos anticuerpos activarían el complemento, lo que provocaría la lisis de los glóbulos rojos y la consiguiente ictericia. Otras condiciones que pueden causar pruebas de Coombs directas positivas incluyen reacciones de transfusión hemolítica, anemia hemolítica autoinmune, mononucleosis infecciosa (causada por Virus de Epstein Barr), sífilis, y Micoplasma neumonía. También se puede observar una prueba de Coombs directa positiva en algunos cánceres y como una reacción alérgica a algunos medicamentos (por ejemplo, penicilina).

                  Los anticuerpos unidos a los glóbulos rojos en estas afecciones son con mayor frecuencia IgG, y debido a la orientación de los sitios de unión al antígeno en la IgG y al tamaño comparativamente grande de un glóbulo rojo, es poco probable que se produzca una aglutinación visible. Sin embargo, la presencia de IgG unida a los glóbulos rojos se puede detectar agregando Reactivo de Coombs, un antisuero que contiene anticuerpos IgG antihumanos (que pueden combinarse con anticomplemento) (Figura 4). El reactivo de Coombs une la IgG adherida a los glóbulos rojos vecinos y, por lo tanto, promueve la aglutinación.

                  También hay un prueba de Coombs indirecta conocido como el prueba de antiglobulina indirecta (IAT). Esto analiza a un individuo en busca de anticuerpos contra los antígenos de los glóbulos rojos (distintos de los antígenos A y B) que no están unidos en el suero del paciente (Figura 4). La IAT se puede utilizar para evaluar a las mujeres embarazadas en busca de anticuerpos que puedan causar enfermedad hemolítica del recién nacido. También se puede utilizar antes de realizar transfusiones de sangre. A continuación se analizan más detalles sobre cómo se realiza el IAT.

                  Figura 4. Haga clic para ver una imagen más grande. Los pasos de las pruebas de Coombs directas e indirectas se muestran en la ilustración.

                  Los anticuerpos que se unen a los glóbulos rojos no son la única causa de hemaglutinación. Algunos virus también se unen a los glóbulos rojos, y esta unión puede causar aglutinación cuando los virus entrecruzan los glóbulos rojos. Por ejemplo, virus de la influenza tienen dos tipos diferentes de picos virales llamados neuraminidasa (N) y hemaglutinina (H), este último llamado así por su capacidad para aglutinar los glóbulos rojos (ver Virus). Por lo tanto, podemos usar glóbulos rojos para detectar la presencia del virus de la influenza mediante ensayos de hemaglutinación directa (HA), en el que el virus provoca una aglutinación visible de los glóbulos rojos. los paperas y rubéola Los virus también se pueden detectar utilizando HA.

                  Con mayor frecuencia, un dilución en serie El ensayo de aglutinación viral se utiliza para medir la título o estimar la cantidad de virus producidos en cultivos celulares o para la producción de vacunas. Se puede determinar un título viral usando un HA directo haciendo una dilución en serie de la muestra que contiene el virus, comenzando con una alta concentración de muestra que luego se diluye en una serie de pocillos. La dilución más alta que produce aglutinación visible es el título. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microvaloración con pocillos de fondo redondo o en V. En presencia de virus aglutinantes, los glóbulos rojos y el virus se agrupan y producen una estera difusa sobre el fondo del pozo. En ausencia de virus, los glóbulos rojos ruedan o sedimentan hasta el fondo del pozo y forman un sedimento denso, por lo que no se pueden usar los pozos de fondo plano (Figura 5).

                  Figura 5. Se mezcla una suspensión viral con una cantidad estandarizada de glóbulos rojos. No se observa aglutinación de glóbulos rojos cuando el virus está ausente y las células forman un sedimento compacto en el fondo del pocillo. En presencia de virus, se forma un precipitado rosa difuso en el pocillo. (crédito en la parte inferior: modificación del trabajo de la Sociedad Estadounidense de Microbiología)

                  Puede usarse una modificación del ensayo de HA para determinar el título de anticuerpos antivirales. La presencia de estos anticuerpos en el suero de un paciente o en un antisuero producido en el laboratorio neutralizará el virus y evitará que aglutine los glóbulos rojos, lo que lo convierte en un ensayo de inhibición de la hemaglutinación viral (EIS). En este ensayo, el suero del paciente se mezcla con una cantidad estandarizada de virus. Después de una breve incubación, se agrega una cantidad estandarizada de glóbulos rojos y se observa hemaglutinación. El título del suero del paciente es la dilución más alta que bloquea la aglutinación (Figura 6).

                  Figura 6. En esta EIS, el suero que contiene anticuerpos contra el virus de la influenza se sometió a diluciones en serie al doble en una placa de microtitulación. Luego se agregaron glóbulos rojos a los pocillos. La aglutinación solo ocurrió en aquellos pocillos donde los anticuerpos estaban demasiado diluidos para neutralizar el virus. La concentración más alta a la que se produce la aglutinación es el título de anticuerpos en el suero del paciente. En el caso de esta prueba, la muestra A muestra un título de 128 y la muestra C muestra un título de 64. (crédito: modificación del trabajo de Evan Burkala)

                  Piénsalo

                  • ¿Cuál es el mecanismo por el cual se detectan los virus en un ensayo de hemaglutinación?
                  • ¿Qué resultado de hemaglutinación nos dice el título de virus en una muestra?

                  Animales en el laboratorio

                  Mucho de lo que sabemos hoy sobre el sistema inmunológico humano se ha aprendido a través de investigaciones realizadas utilizando animales, principalmente mamíferos, como modelos. Además de la investigación, los mamíferos también se utilizan para la producción de la mayoría de los anticuerpos y otros componentes del sistema inmunológico necesarios para el inmunodiagnóstico. Las vacunas, los diagnósticos, las terapias y la medicina traslacional en general se han desarrollado a través de la investigación con modelos animales.

                  Considere algunos de los usos comunes de los animales de laboratorio para producir componentes del sistema inmunológico. Los conejillos de Indias se utilizan como fuente de complemento y los ratones son la principal fuente de células para producir mAb. Estos mAb se pueden utilizar en investigación y con fines terapéuticos. Los antisueros se crían en una variedad de especies, incluidos caballos, ovejas, cabras y conejos. Cuando se produce un antisuero, normalmente se inyectará al animal al menos dos veces y se pueden utilizar adyuvantes para potenciar la respuesta de anticuerpos. A los animales más grandes utilizados para fabricar antisueros se les extraerá sangre repetidamente durante largos períodos de tiempo, con poco daño para los animales, pero ese no suele ser el caso de los conejos. Aunque podemos obtener unos mililitros de sangre de las venas de las orejas de los conejos, normalmente necesitamos volúmenes mayores, lo que resulta en la muerte de los animales.

                  También utilizamos animales para el estudio de enfermedades. La única forma de crecer Treponema pallidum porque el estudio de la sífilis está en animales vivos. Muchos virus se pueden cultivar en cultivo celular, pero el crecimiento en cultivo celular nos dice muy poco sobre cómo responderá el sistema inmunológico al virus. Cuando trabajamos en una enfermedad recién descubierta, seguimos empleando los postulados de Koch, que requieren causar enfermedades en animales de laboratorio utilizando patógenos de cultivo puro como un paso crucial para demostrar que un microorganismo en particular es la causa de una enfermedad. Estudiar la proliferación de bacterias y virus en huéspedes animales, y cómo responde el sistema inmunológico del huésped, ha sido fundamental para la investigación microbiológica durante más de 100 años.

                  Si bien la práctica de utilizar animales de laboratorio es esencial para la investigación científica y el diagnóstico médico, muchas personas se oponen firmemente a la explotación de animales para beneficio humano. Este argumento ético no es nuevo; de hecho, una de las hijas de Charles Darwin era una activa antiviviseccionista (la vivisección es la práctica de cortar o diseccionar un animal vivo para estudiarlo). La mayoría de los científicos reconocen que debería haber límites en la medida en que los animales pueden ser explotados con fines de investigación. Las consideraciones éticas han llevado a los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a desarrollar regulaciones estrictas sobre los tipos de investigación que se pueden realizar. Estas regulaciones también incluyen pautas para el tratamiento humanitario de los animales de laboratorio, estableciendo estándares para su alojamiento, cuidado y eutanasia. El documento de los NIH & # 8220Guide for the Care and Use of Laboratory Animals & # 8221 deja en claro que el uso de animales en la investigación es un privilegio otorgado por la sociedad a los investigadores.

                  Las pautas de los NIH se basan en el principio de las tres R: reemplazar, refinar y reducir. Los investigadores deben esforzarse por reemplazar modelos animales con modelos no vivos, reemplazar vertebrados con invertebrados siempre que sea posible, o utilice modelos de computadora cuando corresponda. Ellos deberían refinar procedimientos experimentales y de cría para reducir el dolor y el sufrimiento, y utilizar diseños y procedimientos experimentales que reducir el número de animales necesarios para obtener la información deseada. Para obtener fondos, los investigadores deben convencer a los revisores de los NIH de que la investigación justifica el uso de animales y que su uso está de acuerdo con las pautas.

                  A nivel local, cualquier instalación que utilice animales y reciba fondos federales debe tener un Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) que garantice que se sigan las pautas de los NIH. El IACUC debe incluir investigadores, administradores, un veterinario y al menos una persona sin vínculos con la institución, es decir, un ciudadano preocupado. Este comité también realiza inspecciones de laboratorios y protocolos. Para la investigación que involucra seres humanos, una Junta de Revisión Institucional (IRB) asegura que se sigan las pautas adecuadas.


                  Resultados

                  Optimización del NA-MNT

                  En este estudio, el NA-MNT se desarrolló utilizando 4-MU-NANA como sustrato. Específicamente, realizamos ensayos y calculamos las desviaciones estándar (DE) usando lisado celular o muestras de sobrenadante que contienen virus. Con este fin, las células se infectaron primero con virus a una multiplicidad de infección de 0,001 y se incubaron durante hasta 36 h. Como se muestra en la Fig. 1A, se detectó NA 6 h después de la incubación, con una actividad significativamente mayor detectada consistentemente en los lisados ​​celulares en comparación con los sobrenadantes en todos los puntos de tiempo evaluados (PAG = 0,031). Además, la variabilidad (SD) fue significativamente menor en los lisados ​​celulares que en los sobrenadantes (PAG = 0.031).

                  (A) Actividad de NA en lisados ​​celulares y sobrenadantes en diferentes puntos de tiempo después de la infección. Las células se infectaron con el virus NIBRG-14 (H5N1) con una multiplicidad de infección de 0,001. Cada punto de datos representa la media de tres experimentos separados. (B) Actividad de NA en lisados ​​celulares y sobrenadantes con diferentes inóculos virales. Las células MDCK se infectaron con diferentes diluciones de NIBRG-14, midiéndose la actividad de NA en el sobrenadante del cultivo celular o en los lisados ​​celulares 20 h después de la inoculación. Se calculó la actividad de NA total en los sobrenadantes y se comparó con la actividad en los lisados ​​celulares. (C) Los títulos de anticuerpos neutralizantes de muestras de suero medidos por NA-MNT. El título de anticuerpos neutralizantes de antisueros de oveja de referencia NIBSC (shRef H5N1), muestras seropositivas altas (huHiPos) y moderadas (HuMoPos) y sueros humanos negativos (huNeg) se determinaron mediante NA-MNT utilizando sobrenadantes celulares o lisados. Cada prueba se repitió cinco veces y los CV se calcularon en consecuencia. Nota: Las muestras de HuHiPos, HuMoPos y huNeg se obtuvieron de un estudio clínico de la vacuna candidata H5N1.

                  Para confirmar estas observaciones, se utilizó una gama más amplia de inóculos virales, midiéndose la actividad de NA 20 h después de la infección. Como se muestra en la Fig. 1B, la actividad de NA fue consistentemente más alta en los lisados, con SD más bajos, que en los sobrenadantes, independientemente de la cantidad de virus usada para la infección. A continuación, se realizó NA-MNT para comparar las actividades de NA entre los lisados ​​celulares y los sobrenadantes probando antisueros de oveja o humanos contra las vacunas H5N1. Como se muestra en la Fig.1C, los títulos de anticuerpos basados ​​en las mediciones de las actividades de NA en los lisados ​​celulares fueron ligeramente más altos que los de los sobrenadantes (tres veces más altos), pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los títulos logarítmicos (PAG& gt0.05 Prueba de rango con signo de Wilcoxon). Sin embargo, la variabilidad observada en los sobrenadantes fue mayor que en los lisados ​​celulares, como lo revela un coeficiente de variación (CV) más alto para los títulos de anticuerpos, específicamente, el CV para los sobrenadantes y lisados ​​fue de 11,3 a 17,7% (media, 13,7%). %) y 0–5,9% (media, 3,4%), respectivamente.

                  Reproducibilidad del NA-MNT en comparación con ELISA-MNT

                  Para determinar la reproducibilidad de NA-MNT, se midieron tres muestras individuales mediante NA-MNT en comparación con ELISA-MNT. La precisión intraensayo se determinó realizando ocho mediciones el mismo día, mientras que la precisión interensayo se determinó realizando nueve mediciones de cada muestra durante 3 días. Se encontró que los valores GMT obtenidos de los dos ensayos eran similares. Como se presenta en la Tabla 1, el CV% medio intraensayo en el NA-MNT fue 0, que fue más bajo que en el ELISA-MNT. El intervalo de% de CV interensayo fue de 2,52 a 6,40 para NA-MNT y de 4,92 a 11,06 para ELISA-MNT (Tabla 2). Aunque los títulos de las muestras analizadas fueron iguales entre los dos ensayos, siempre hubo menos variabilidad con el NA-MNT, lo que revela que este ensayo tiene una mayor reproducibilidad.

                  Correlaciones entre el ensayo HI, ELISA-MNT y NA-MNT para la detección de anticuerpos anti-H5N1

                  Las correlaciones en los resultados obtenidos del ensayo HI, ELISA-MNT y NA-MNT se analizaron utilizando muestras de suero recolectadas de 40 voluntarios sanos que recibieron dos dosis de la vacuna inactivada contra la influenza H5N1. Todos los sueros preinmunes resultaron negativos para anticuerpos anti-H5N1 y a las muestras negativas se les asignó un valor de 5 para cálculos posteriores. Para los sueros post-vacunación, los valores de GMT más bajos con el rango de títulos más estrecho se obtuvieron usando HI. Se obtuvo el mismo rango similar de títulos con NA-MNT y ELISA-MNT, siendo la relación media de los títulos logarítmicos 1,67 (Tabla 3). La seroconversión, definida como un título de anticuerpos ≥1: 40 después de la vacunación, fue 75% por NA-MNT, levemente (pero no significativamente) menor que la de ELISA-MNT (PAG = 0,152). Además, tanto el ELISA-MNT como el NA-MNT mostraron buenas correlaciones con el ensayo HI, siendo los coeficientes de correlación de Spearman 0,781 (Fig 2A) y 0,689 (PAG& lt0.001), respectivamente (Fig 2B). Sin embargo, se encontró una mejor correlación entre ELISA-MNT y NA-MNT, con un coeficiente de correlación de Spearman de 0.814 (PAG& lt0.001) (Figura 2C).

                  Se midieron los anticuerpos en 40 muestras de suero de voluntarios sanos inmunizados con dos dosis de vacuna antigripal H5N1 inactivada y se compararon entre el ensayo (A) HI y el ensayo ELISA-MNT (B) NA-MNT y HI, y (C) NA-MNT y ELISA-MNT. Las ecuaciones de regresión lineal y los coeficientes de correlación se calcularon mediante análisis de regresión lineal de los datos transformados logarítmicamente.

                  Correlaciones entre el ensayo HI, ELISA-MNT y NA-MNT para la detección de anticuerpos anti-H7N9

                  A continuación, investigamos las correlaciones entre los tres ensayos para la detección de anticuerpos específicos anti-H7N9. Las muestras de suero de 92 sujetos humanos que recibieron vacunas contra la influenza H7N9 candidatas se analizaron utilizando los tres ensayos. Como se observó con las muestras de suero H5N1, todos los sueros preinmunes resultaron negativos para anticuerpos H7N9 utilizando los tres ensayos. Se encontró que los títulos de anticuerpos de las muestras de suero recolectadas 21 días después de la inmunización eran ligeramente más bajas por NA-MNT que por ELISA-MNT, mientras que se encontraron títulos significativamente más altos por NA-MNT que por el ensayo HI. Como se muestra en la Fig. 3A, las tasas de seroconversión en NA-MNT y ELISA-MNT fueron del 100%, que fue más alta que en el ensayo HI (87%).

                  Se analizaron 92 muestras de suero de sujetos humanos inmunizados con (A) una dosis o (B) dos dosis de la vacuna candidata contra la influenza H7N9 utilizando el ensayo HI, NA-MNT o ELISA-MNT. Las correlaciones entre los títulos en las 92 muestras de suero después de la inmunización con una dosis de vacunas contra la influenza candidatas H7N9 se midieron mediante el ensayo (C) HI versus NA-MNT o (D) ELISA-MNT versus NA-MNT. Las correlaciones entre los títulos en las 92 muestras de suero después de la inmunización con dos dosis de vacunas contra la influenza candidatas H7N9 se midieron mediante el ensayo (E) HI versus NA-MNT o (F) ELISA-MNT versus NA-MNT. Las ecuaciones de regresión lineal y los coeficientes de correlación se calcularon mediante análisis de regresión lineal de los datos transformados logarítmicamente.

                  Para las muestras de suero recolectadas 42 días después de la inmunización, se obtuvieron valores de GMT más altos tanto por ELISA-MNT como por NA-MNT en comparación con los del ensayo HI (Fig 3B). Luego se realizó un análisis de regresión lineal para evaluar la correlación entre los ensayos. Hubo una buena correlación entre el ensayo NA-MNT y HI para los sueros obtenidos el día 21 (r = 0.837, PAG& lt0.01) (Fig 3C), similar al de los sueros de sujetos que recibieron dos vacunas (r = 0.887, PAG& lt0.01) (Figura 3E). Además, hubo una buena correlación entre NA-MNT y ELISA-MNT en la medición de anticuerpos anti-H7N9 de sujetos que recibieron una o dos dosis de la vacuna. Como se muestra en la Fig. 3D y 3F, el coeficiente de correlación de Spearman fue de 0,875 o 0,866 para las personas que recibieron una o dos inmunizaciones, respectivamente. En conjunto, estos datos indican fuertes correlaciones entre los resultados obtenidos de los tres ensayos.


                  Resultados

                  Inhibición de la multiplicación del virus de la influenza a in vitro por el alcohol pachulí

                  La citotoxicidad del alcohol de pachulí (PA) se evaluó en primer lugar mediante el ensayo MTT en células MDCK, A549 y 293FT [19]. Los resultados mostraron que el PA no presentaba citotoxicidad significativa a concentraciones de 6,25 a 100 µg / ml (Fig. 1a). El CC50 (50% de concentración de citotoxicidad) para PA en células MDCK, 293FT y A549 fueron aproximadamente 550,8, 914,8 y 454,5 µg / ml, respectivamente. Estos resultados se utilizaron para determinar el intervalo de dosis de PA para los experimentos posteriores.

                  El alcohol de pachulí inhibió la replicación de IAV in vitro con baja toxicidad. a Después de 24 h de exposición a alcohol pachulí (100, 50, 25, 12,5, 6,25 μg / ml) en células MDCK, A549 y 293FT, se midió la viabilidad celular de las células Vero mediante ensayo MTT. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). B Se trataron células MDCK infectadas con IAV (MOI = 1,0) con PA a las concentraciones indicadas durante 24 h, luego se determinó la actividad antiviral mediante ensayo de placa. Los valores son medias ± SD. (norte = 3). C Títulos de virus infecciosos de ensayos de alta moi de ciclo único realizados en células MDCK infectadas con PR8, Vir09 y NWS y tratadas con las concentraciones indicadas de PA. Se calculó el porcentaje medio de títulos de virus infecciosos como un porcentaje de títulos de virus infecciosos de células no tratadas para cada condición de tratamiento con fármaco en un experimento. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). D Se preincubaron aproximadamente 50-100 UFP / pocillo del virus Vir09 con diferentes concentraciones de PA durante 60 min a 37 ° C antes de la infección. Luego, la mezcla de virus-PA se transfirió a monocapas de células confluentes en placas de 6 pocillos, se incubó a 37 ° C durante 1 hora y se sometió a ensayo de placa. mi Número de placa de los ensayos de reducción de placa realizados en células MDCK infectadas con Vir09 y tratadas con las concentraciones indicadas de PA. Los valores son medias ± S.D. (norte = 4). F Número de placa de los ensayos de reducción de placa realizados en células MDCK infectadas con PR8, Vir09 y NWS y tratadas con las concentraciones indicadas de PA. Los números de placa porcentuales medios se calcularon como un porcentaje de los números de placa de las células no tratadas para cada condición de tratamiento con fármaco en un experimento. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3)

                  A continuación, se analizó la capacidad del PA para inhibir la multiplicación del IAV in vitro mediante un ensayo de placa [20]. En primer lugar, la inhibición de PA sobre los rendimientos del virus a partir de células MDCK infectadas con Vir09 (A / Virginia / ATCC1 / 2009), NWS (A / NWS / 33) o PR8 (A / Puerto Rico / 8/34) a moi alto ( 1,0 PFU / célula) se examinaron mediante ensayo de placa. Como se muestra en la Fig. 1b yc, el tratamiento con PA redujo los títulos de virus de Vir09, NWS y PR8 de una manera dependiente de la dosis cuando se usó en concentraciones de 6,25 a 50 μg / ml. La concentración inhibidora del 50% (IC50 valor) de PA para Vir09, NWS y PR8 fue de aproximadamente 6.3 ± 1.3, 3.5 ± 1.4 y 6.1 ± 1.7 μg / mL, respectivamente (Tabla 1). A la concentración de 12,5 μg / ml, los títulos de virus redujeron aproximadamente 30 veces los del grupo de control no tratado para Vir09, 3,0 veces los de NWS y 2,5 veces los de virus PR8 (Fig. 1b yc).

                  Para explorar más a fondo si la PA tenía acciones de inhibición directa sobre las partículas virales, se realizó el ensayo de reducción de placa como se describió anteriormente [21]. En resumen, el virus Vir09 (50-100 UFP / pocillo) se preincubó con o sin AP durante 60 min a 37 ° C antes de la infección. Se transfirió la mezcla de virus-PA a monocapas de células confluentes en placas de 6 pocillos, incubados a 37ºC durante 1 hora y sometidos a ensayo de placa. Como se muestra en la Fig. 1d y e, la preincubación de PR8 con PA a las concentraciones de 12,5 y 25 μg / ml redujo notablemente el número de placas y protegió las células MDCK, lo que sugiere que el PA puede inactivar las partículas virales directamente.

                  Además, los efectos de inhibición de la PA sobre la infección por IAV también se examinaron durante múltiples ciclos de infección utilizando un ensayo de reducción de placa [17]. Brevemente, las células MDCK se infectaron con virus pretratado con PA (Vir09, NWS y PR8) a una moi de 0,001 pfu durante 1 ha 37ºC, y luego se sometieron a ensayo de placa. Como se muestra en la Fig. 1f, PA también inhibió significativamente la formación de placa en las células infectadas con Vir09, NWS y PR8 (MOI = 0,001) cuando se usó a la concentración & gt 3,125 µg / ml (Fig. 1f). El IC50 Los valores de PA para Vir09, NWS y PR8 fueron de aproximadamente 2,2 ± 0,2, 3,2 ± 0,2 y 2,9 ± 0,4 μg / ml, respectivamente (Tabla 1). Sin embargo, la ribavirina no pudo inhibir significativamente la formación de placa de Vir09 con IC50 valor & gt 120 μg / ml (Tabla 1). Por lo tanto, PA poseía efectos anti-IAV in vitro, y el virus pandémico H1N1 (Vir09) era más susceptible al tratamiento con PA.

                  Influencia de las diferentes condiciones de tratamiento de la AP en la infección por IAV

                  Se evaluaron varios puntos de tiempo para determinar la etapa o etapas en las que el PA ejerció sus efectos inhibidores in vitro. En resumen, las células MDCK se infectaron con el virus Vir09 (H1N1) (MOI = 1,0) en cuatro condiciones de tratamiento diferentes: pretratamiento de virus, pretratamiento de células, durante la adsorción o después de la adsorción. A las 24 h p.i., se determinó la actividad antiviral mediante ensayo de placa. Como se muestra en la Fig. 2a, el pretratamiento del virus Vir09 con 25 μg / ml de PA durante 1 h antes de la infección redujo notablemente los títulos de virus, lo que sugiere que el PA puede tener interacción directa con las partículas de IAV. Sin embargo, la adición de PA durante la adsorción o el pretratamiento de las células solo inhibió débilmente la multiplicación del virus (Fig. 2a), lo que sugiere que el PA puede no interactuar directamente con las células MDCK. Curiosamente, el tratamiento de PA después de la adsorción también redujo significativamente los títulos de virus en comparación con el grupo de control de virus no tratado (Fig. 2a). Por tanto, el PA puede inactivar las partículas de virus directamente y bloquear algunas etapas después de la adsorción del virus.

                  Influencia de diferentes condiciones de tratamiento del alcohol de pachulí en la infección por IAV. a Las células MDCK se infectaron con H1N1 (Vir09, MOI = 1,0) mediante cuatro condiciones de tratamiento diferentes. i) Pretratamiento del virus: Se pretrató IAV con 25 μg / ml de PA a 37 ° C durante 1 h antes de la infección. ii) Pretratamiento de las células: las células MDCK se pretrataron con 25 µg / ml de PA a 37ºC durante 1 h antes de la infección. iii) Adsorción: se infectaron células MDCK en medio que contenía 25 µg / ml de PA y, después de 1 h de adsorción a 37ºC, se cubrieron con medio sin compuesto. iv) Después de la adsorción: después de eliminar el virus no absorbido, se añadió a las células el medio infectante que contenía 25 µg / ml de PA. A las 24 h p.i., se determinó la actividad antiviral mediante ensayo de placa. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0,01 frente al grupo de control del virus. B Se trataron células MDCK infectadas con PR8 (MOI = 1,0) con o sin 25 µg / ml de PA durante el período de tiempo especificado, y luego se retiraron los medios y las células se cubrieron con medios libres de compuesto. Luego, a las 24 h p.i., se recogieron los sobrenadantes celulares y se determinaron los rendimientos de virus mediante ensayo de placa. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). Significado: *pag & lt 0,05 frente al grupo de control del virus. C El virus H1N1 (Vir09) inactivado y el H1N1 (PR8) se incubaron con las concentraciones indicadas de PA o Zanamivir (10 μg / ml), y la actividad enzimática de NA se determinó mediante un ensayo fluorescente. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). D Los efectos de inhibición del PA y del anticuerpo anti-HA sobre la agregación inducida por el virus de la influenza H1N1 (PR8) de los eritrocitos de pollo se evaluaron mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). mi Se transfectaron células 293FT con plásmidos de expresión pcDNA3.1 que codifican PB2, PB1, PA, NP y el plásmido vNS1-luc en ausencia o presencia de PA (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μg / ml) o nucleozina (10 μM). A continuación, se evaluó el efecto de la transcripción de ARNv midiendo la actividad de luciferasa a las 48 h posteriores a la transfección. Los datos se expresan como la media ± DE de tres muestras en cada uno de los tres experimentos independientes. Significado: **pag & lt 0.01 frente al grupo de control simulado

                  Además, también se realizó otro estudio del curso del tiempo para explorar qué etapa viral después de la adsorción es inhibida por la AP como se describió anteriormente [17]. Brevemente, las células MDCK infectadas con Vir09 (MOI = 1.0) se trataron con 25 μg / mL de PA durante diferentes intervalos de tiempo, luego la multiplicación del virus a las 24 h p.i. fue evaluado por ensayo de placa. Los resultados mostraron que el tratamiento con AP durante las primeras 4 h (0 a 4 h p.i.) después de la adsorción resultó en una reducción significativa en el título del virus (aproximadamente 200 veces) (PAG & lt 0.05) (Figura 2b). Se observó una inhibición mucho menor (menos de 20 veces) cuando se añadió PA 8 h después de la infección (& gt 8 h pi), lo que sugirió que la PA puede inhibir las primeras etapas del ciclo de vida del IAV (principalmente 0-4 h pi) (Figura 2b).

                  Dado que el PA puede ser capaz de inactivar las partículas de virus directamente, exploramos si el PA tenía interacción directa con la proteína NA y HA de la superficie del virus mediante el ensayo de inhibición de la neuraminidasa y el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). Como se muestra en la Fig. 2c, PA no pudo inhibir significativamente las actividades de NA del virus Vir09 a concentraciones de 12,5 a 100 μg / ml, mientras que Zanamivir poseía un alto porcentaje de inhibición (& gt 80%) a 10 μg / ml, lo que sugiere que PA puede no tienen interacción directa con la proteína NA del virus. Además, los resultados del ensayo HI mostraron que los anticuerpos anti-HA inhibieron significativamente la agregación inducida por el virus PR8 de eritrocitos de pollo a concentraciones de 0.3125-5 μg / mL (Fig. 2d), lo que sugiere que el anticuerpo anti-HA puede bloquean la unión del virus a los glóbulos rojos mediante la unión a HA. Sin embargo, el PA no inhibió obviamente la agregación inducida por virus de los eritrocitos de pollo incluso a una concentración de 50 µg / ml (Fig. 2d), lo que sugiere que el PA puede no tener interacción directa con la proteína HA viral.

                  Además, también realizamos un ensayo de mini-genoma para evaluar la influencia de la AP en la replicación del genoma viral, que ocurre durante las primeras etapas del ciclo de vida viral. Brevemente, las células 293FT se transfectaron con cuatro plásmidos de expresión que codifican las proteínas PB2, PB1, PA y NP del virus PR8, y el plásmido vNS1-luc / pHH21 que contiene luciferasa, que codifica un genoma de tipo viral en ausencia o presencia de PA ( 3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μg / ml). A continuación, se evaluó el efecto de la transcripción de ARNv midiendo la actividad luciferasa a las 48 h p.i. Los resultados mostraron que el fármaco nucleozina positivo provocó una reducción notable en la actividad de luciferasa a 10 µM en comparación con el tratamiento de control (DMSO) (Fig. 2e). Por el contrario, el tratamiento con PA (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μg / ml) no inhibió significativamente la actividad de la luciferasa, lo que sugiere que la proteína NP puede no ser el objetivo directo de la PA. En resumen, las proteínas del virus HA, NA y NP pueden no ser los principales objetivos de PA in vitro.

                  La influencia de la PA en la expresión de ARNm y proteínas del virus

                  Dado que la AP puede inhibir algunos pasos después de la adsorción del virus (Fig. 2a yb), los efectos de la AP sobre la síntesis de proteínas virales y la replicación del ARN se evaluaron mediante un ensayo de inmunofluorescencia y un ensayo de RT-PCR en tiempo real como se describió anteriormente [19].En primer lugar, las células A549 infectadas con el virus Vir09 (MOI = 1,0) se añadieron con 10 o 20 μg / ml de PA después de la adsorción del virus y luego se incubaron a 37 ° C durante 2 h. Después de eso, la expresión de la proteína NP viral se detectó mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Como se muestra en la Fig. 3a, en las células infectadas por virus sin tratamiento farmacológico, la fluorescencia de las proteínas NP virales podría encontrarse obviamente tanto en el núcleo celular como en el citoplasma (Fig. células infectadas (Fig. 3a). Sin embargo, después del tratamiento con PA durante 2 h, el número de células que expresan el antígeno del virus se redujo drásticamente y solo se pudo encontrar muy poca fluorescencia en el citoplasma (Fig. 3a). La cuantificación de los datos de la intensidad de fluorescencia en células infectadas con IAV mostró que el tratamiento con PA (5, 10 μg / mL) redujo significativamente la intensidad de fluorescencia de NP en células A549, lo que sugiere que PA puede bloquear algunos pasos del ciclo de vida de IAV después de la adsorción para interferir con importación nuclear y expresión de proteína NP (Fig. 3b).

                  La influencia del alcohol de pachulí en la expresión de proteínas y ARNm del virus. a Ensayo de inmunofluorescencia de la proteína NP del virus en células A549 infectadas con H1N1 (Vir09) a las 2 h p.i. La barra de escala representa 50 micras. B La intensidad de fluorescencia media de las proteínas NP en (a) se midió con ImageJ (NIH) versión 1.33u (EE. UU.) para calcular la intensidad promedio por unidad de área de celdas de diferentes imágenes (norte = 30). Significado: ∗ PAG & lt 0.05, ∗ ∗ PAG & lt 0,01 frente al grupo de control de virus. C Las células MDCK infectadas con Vir09 (MOI = 1,0) se trataron con diferentes concentraciones de PA (10-40 μg / ml) y se incubaron a 37 ° C durante 8 h. Después de eso, se extrajo el ARN total para el ensayo de RT-PCR en tiempo real de ARNm de IAV HA y ARNm de β-actina celular. Las cantidades relativas de ARNm de HA del virus se determinaron utilizando el método comparativo (2-ΔΔCT). A los niveles de ARN para células no tratadas con fármaco (control de virus) se les asignaron valores de 1. Los valores son medias ± DE (norte = 3). Significado: *PAG & lt 0,05 frente al grupo de control del virus. D Las células MDCK se infectaron en primer lugar con IAV (MOI = 1,0) y luego se trataron con o sin PA a las concentraciones indicadas después de la adsorción. A las 8 h p.i., se evaluó la expresión de la proteína NP del virus mediante transferencia Western. También se probaron las transferencias para la proteína β-actina como controles de carga. mi Cuantificación de inmunotransferencia para la proporción de proteína IAV NP a actina. A la relación para el grupo de control de virus no tratados (PR8) se les asignaron valores de 1 y los datos se presentaron como media ± DE (norte = 3). Significado: **PAG & lt 0,01 frente al grupo de control de virus (PR8)

                  Además, el efecto de inhibición de PA sobre la expresión de ARNm del virus se evaluó luego mediante un ensayo de RT-PCR en tiempo real. A las células infectadas con IAV (MOI = 1,0) se les añadió PA (10, 20, 40 μg / ml) después de la adsorción del virus y luego se incubaron a 37 ° C durante 8 h. Después de eso, se extrajo el ARN total para RT-PCR en tiempo real. Como se muestra en la Fig.3c, después del tratamiento con PA (20, 40 μg / mL) durante 8 h, los niveles de ARNm de NP de IAV disminuyeron a aproximadamente 36,6 y 14,2% de los de las células no tratadas después del tratamiento con PA, respectivamente, de acuerdo con los resultados. del ensayo de inmunofluorescencia.

                  Además, también se realizó un ensayo de transferencia de Western para verificar la inhibición de PA en la producción de proteína viral. Las células MDCK se infectaron en primer lugar con IAV (MOI = 1,0) y luego se trataron con o sin PA a las concentraciones indicadas después de la adsorción. Después de la incubación durante 8 h, se detectó la producción de proteína NP viral mediante un ensayo de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 3d ye, el nivel de proteína NP viral se redujo significativamente por PA de una manera dependiente de la dosis en comparación con el del grupo de control de virus no tratado (PR8) (PAG & lt 0,01). El tratamiento con PA a 40 μg / mL redujo la producción de proteína IAV NP en más del 80% (Fig. 3e). Por lo tanto, PA también puede inhibir la expresión de ARNm y de proteína de IAV interfiriendo con algunos de los primeros pasos del ciclo de vida del virus.

                  Las vías de señalización celular PI3K / Akt y ERK / MAPK pueden estar involucradas en las acciones anti-IAV de PA

                  Dado que la PA puede inhibir algunos pasos después de la adsorción del virus para reducir el ARNm de IAV y la expresión de proteínas in vitro, exploramos más a fondo si la PA podría influir en algunas vías de señalización celular necesarias para la infección por IAV. Se informó que la vía de señalización celular PI3K / Akt es necesaria para la endocitosis y la replicación del virus, y los inhibidores de la señalización PI3K / Akt podrían inhibir tanto la entrada como la replicación del virus [21, 22]. En este estudio, después de la infección por IAV durante 2 h, los niveles de proteínas PI3K fosforiladas aumentaron significativamente hasta aproximadamente 1,3 veces más que el grupo de control normal en células infectadas por IAV (PAG & lt 0.01) (Fig. 4a y e). Sin embargo, después del tratamiento con PA (6.25, 12.5, 25, 50 μg / ml) durante 2 h, el nivel de expresión de PI3K fosforilada disminuyó significativamente de aproximadamente 1.3 a aproximadamente 1.1, 0.9, 0.6 y 0.3 veces del grupo de control normal, respectivamente (PAG & lt 0.05) (Fig. 4a y e). Además, la activación de PI3K puede inducir la activación de algunas señales aguas abajo tales como Akt, y el nivel de Akt fosforilada se incrementó realmente significativamente en el grupo de control del virus hasta aproximadamente 4,5 veces más alto que el grupo de control normal a las 2 h p.i. (PAG & lt 0.01) (Fig. 4b yf). Pero el tratamiento con PA (25, 50 μg / ml) durante 2 h podría reducir significativamente la activación de Akt de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 3,4 y 2,8 veces del grupo de control normal, respectivamente (Fig. 4b yf). Por tanto, la vía de señalización PI3K / Akt puede estar implicada en los mecanismos anti-IAV de la PA in vitro.

                  Participación de las vías de señalización PI3K / Akt y ERK / MAPK en las acciones anti-IAV del alcohol de pachulí. a-D Las células infectadas con el virus Vir09 (MOI = 1.0) se trataron con o sin PA (6.25, 12.5, 25, 50 μg / ml) durante 2 h, y luego la fosforilación de PI3K (a), Akt (B), ERK1 / 2 (C) y NF-κB (D) fue evaluado por Western Blot. También se probaron las transferencias para detectar GAPDH y proteínas α-tubulina como controles de carga. El resultado que se muestra es un representante de tres experimentos separados. mi-h Cuantificación de inmunotransferencia para la proporción de p-PI3K (mi), p-Akt (F), p-ERK1 / 2 (gramo) y p-NF-κB (h) proteína a GAPDH o tubulina, respectivamente. A la proporción de células no infectadas (M) se le asignaron valores de 1,0 y los datos se presentaron como media ± S.D. (norte = 3). Significado: ## PAG & lt 0.01 frente al grupo de control normal (simulacro) *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0,01 frente al grupo de control de virus (Vir09)

                  Además, se informó que la vía de señalización de MAPK era necesaria para la exportación eficiente de vRNP desde el núcleo, y los inhibidores de la vía de MAPK podrían reducir la replicación de IAV y los síntomas inflamatorios [23, 24, 25]. En este estudio, la proteína ERK1 / 2 se activó significativamente en el grupo de control del virus hasta aproximadamente 9,2 veces más alta que en el grupo de control normal a las 2 h p.i. (PAG & lt 0.01) (Fig. 4c yg). Sin embargo, después del tratamiento con PA (6.25, 12.5, 25 y 50 μg / ml) durante 2 h, el nivel de expresión de la proteína ERK1 / 2 fosforilada disminuyó significativamente de aproximadamente 9.2 a aproximadamente 6.0, 6.3, 5.9 y 5.3 veces de lo normal. grupo de control, respectivamente (PAG & lt 0.01) (Fig. 4c yg). Sin embargo, el tratamiento con PA (6.25, 12.5, 25 y 50 μg / ml) durante 2 h no pudo reducir significativamente el nivel de expresión de la proteína NF-κB fosforilada en comparación con el grupo de control del virus (Fig. 4d y h). Por lo tanto, PA puede inhibir la vía ERK / MAPK en lugar de la vía NF-κB para interferir con la replicación de IAV.

                  Además, se informó que la vía PI3K / Akt está asociada con la respuesta antiviral del huésped [26, 27], por lo que exploramos aún más la influencia de la AP en la respuesta inmune mediante el uso de western blot y ensayo ELISA. Primero evaluamos las acciones directas de PA en la vía celular PI3K / Akt en células A549 no infectadas usando Western Blot. Los resultados mostraron que el tratamiento con PA (6.25, 12.5, 25, 50 μg / ml) no pudo influir significativamente en la activación de las proteínas PI3K y Akt en las células A549 no infectadas (Fig.5a yb), lo que sugiere que la inhibición de PI3K La vía de / Akt por PA puede estar relacionada con su inhibición de la infección por IAV. El tratamiento de PA durante diferentes intervalos de tiempo dentro de las 24 h no mostró citotoxicidad significativa para las células A549 no infectadas (Fig. 5c). Además, la infección por IAV aumentó significativamente la producción de interferón-β celular (IFN-β) en las células A549 infectadas con el virus Vir09; sin embargo, el tratamiento con PA (6.25, 12.5, 25, 50 μg / ml) no pudo influir significativamente en la producción de IFN. -β en comparación con el grupo de control del virus (Fig. 5d), lo que sugiere que el PA no tuvo acción directa sobre la respuesta antiviral celular. Además, también evaluamos la influencia de PA en la producción de interferón-γ (IFN-γ) e interleucina 2 (IL-2) en ratones con o sin infección por virus PR8. Como se muestra en la Fig. 5e, el tratamiento intranasal de PA (20 o 40 µg / día) durante cuatro días no tuvo una influencia significativa sobre la producción de IFN-γ e IL-2 en ratones no infectados. Sin embargo, el tratamiento con PA podría revertir significativamente la reducción de IFN-γ e IL-2 en ratones infectados con IAV (Fig.5f), lo que sugiere que la mejora de PA en el sistema de interferón tipo II puede estar relacionada con su inhibición de la inhibición de IAV in vivo. . Por tanto, la inhibición de la vía PI3K / Akt por PA puede estar relacionada con su inhibición de la infección por IAV más que con acciones directas sobre la respuesta antiviral del huésped.

                  La influencia del alcohol de pachulí en la respuesta antiviral del huésped. a Las células A549 se trataron con o sin PA (6,25, 12,5, 25, 50 µg / ml) durante 2 h, y luego se evaluó la fosforilación de las proteínas PI3K y Akt mediante transferencia Western. También se probaron las transferencias para la β-actina y la proteína GAPDH como controles de carga. El resultado que se muestra es un representante de tres experimentos separados. B Gráficos que cuantifican las inmunotransferencias (como proporciones de β-actina o GAPDH) para las proteínas p-PI3K y p-Akt, respectivamente. A las proporciones de las células no tratadas (simulacros) se les asignaron valores de 1,0 y los datos se presentaron como media ± S.D. (norte = 3). C Las células A549 se trataron con alcohol pachulí (50, 25 µg / ml) durante un período de tiempo especificado, y luego se retiraron los medios y las células se cubrieron con medios sin compuesto. Luego, a las 24 h p.i., se midió la viabilidad celular de las células A549 mediante el ensayo MTT. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). D Las células infectadas con el virus Vir09 (MOI = 0,1) se trataron con o sin PA (6,25, 12,5, 25, 50 μg / ml) durante 24 h, luego se detectó el contenido de IFN-β en los sobrenadantes del cultivo utilizando kits de ELISA. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). ##PAG & lt 0.01vs. grupo no infectado (control simulado). mi y F Después del tratamiento de PA (20 o 40 μg / día) durante cuatro días en ratones no infectados (mi) o ratones infectados con el virus PR8 (F), se determinó la producción de interferón-γ (IFN-γ) e interleucina 2 (IL-2) en tejidos pulmonares utilizando los kits de ELISA para IFN-γ e IL-2. Los valores son medias ± S.D. (norte = 3). Significado: ##PAG & lt 0.01 frente al grupo de control simulado no infectado **PAG & lt 0,01 frente al grupo de control de virus

                  La aplicación de PA intranasal favorece la supervivencia de ratones infectados con IAV

                  Los efectos anti-IAV de la PA in vivo se exploraron más a fondo utilizando un modelo de neumonía de ratón [18]. En resumen, los ratones infectados con IAV recibieron administración intranasal de PA (20 o 40 μg / día) o placebo (PBS) una vez al día durante todo el experimento, y el subconjunto seleccionado de ratones infectados tratados se sacrificó el día 4 y el tejido las muestras se retiraron para su posterior análisis. Posteriormente, los títulos virales pulmonares se determinaron mediante ensayo de placa [22]. Como se muestra en la Fig. 6a, después del tratamiento de PA (20, 40 μg / día) durante 4 días, los títulos virales pulmonares disminuyeron significativamente en comparación con los del grupo de control del virus (PAG & lt 0,01), lo que sugiere que la terapia intranasal con PA podría inhibir la multiplicación de IAV en los pulmones de los ratones. La terapia oral de oseltamivir (10 mg / kg / día) también mostró una reducción significativa de los títulos de virus en los pulmones de los ratones (PAG & lt 0.05) (Figura 6a).

                  Los efectos anti-IAV del alcohol de pachulí in vivo. a Títulos virales en pulmones. Después del tratamiento con Oseltamivir (10 mg / kg / día) o PA (20 o 40 μg / día) durante 4 días, se evaluaron los títulos virales pulmonares mediante ensayo de placa. Los valores son la media ± DE (norte = 3). Significado: *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0,01 frente al grupo de control de virus. B Tasa de supervivencia. Los ratones infectados con IAV recibieron terapia con oseltamivir (10 mg / kg / día) o PA (20 o 40 µg / día) durante todo el experimento. Los resultados se expresan como porcentaje de supervivencia, evaluados diariamente durante 14 días. Significado: *PAG & lt 0,05 frente al grupo de control del virus (placebo). C Análisis histopatológicos de tejidos pulmonares el día 4 p.i. por tinción HE (× 10). Se mostraron las micrografías representativas de cada grupo (norte = 5 ratones / grupo). Simulacro: pulmones no infectados Control: pulmones infectados por IAV sin fármacos Oseltamivir: pulmones infectados por IAV con Oseltamivir (10 mg / kg / día) tratamiento PA 20 μg / día: pulmones infectados IAV con PA (20 μg / día) tratamiento PA 40 μg / día: pulmones infectados por IAV con tratamiento con PA (40 μg / día). Las flechas rojas indican la presencia de células inflamatorias en las paredes alveolares y exudados serocelulares en la luz.

                  Además, los experimentos de supervivencia también se realizaron para evaluar los efectos de la PA sobre la supervivencia de ratones infectados con IAV. Como se muestra en la Fig. 6b, la administración intranasal con PA (40 μg / día) aumentó significativamente las tasas de supervivencia en comparación con el grupo de control tratado con placebo (PAG & lt 0,05). Para el día 14 después de la infección, solo el 30% de los individuos en el grupo de placebo sobrevivieron, mientras que el 100% de los animales en el grupo tratado con AP (40 μg / día) sobrevivieron, superior al del Oseltamivir (10 mg / kg / día) - grupo tratado (90%). El tratamiento con PA a 20 µg / día también aumentó la tasa de supervivencia de los ratones infectados con IAV (50%) pero sin importancia (Fig. 6b).

                  Para evaluar más a fondo los efectos de la AP sobre la neumonía viral en ratones, también se realizó un análisis histopatológico como se describió anteriormente [18]. Como se muestra en la Fig. 6c, los tejidos pulmonares en el grupo de control del virus mostraron una infiltración marcada de células inflamatorias en las paredes alveolares y la presencia de exudados serocelulares masivos en la luz. Sin embargo, después del tratamiento con PA (20 o 40 μg / día) durante 7 días, los tejidos pulmonares mostraron epitelio columnar intacto en el bronquiolo incluso en presencia de algunos exudados serocelulares en la luz (Fig. 6c). Los ratones tratados con oseltamivir (10 mg / kg / día) también tenían epitelio columnar intacto (Fig. 6c). Por tanto, la PA puede atenuar los síntomas de la neumonía en ratones infectados con IAV.


                  Afiliaciones

                  Centro de Influenza, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Bergen, Bergen, Noruega

                  Anders Madsen, Åsne Jul-Larsen, Mai-Chi Trieu y Rebecca J. Cox

                  Departamento de Microbiología, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, EE. UU.

                  Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Haukeland, Bergen, Noruega

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                  Contribuciones

                  R.J.C., M.C.T. y Å.J.-L. diseñó el estudio. A.M., Å.J.-L. y M.-C.T. análisis de laboratorio realizado. F.K. proporcionó construcciones de baculovirus. SOY. y R.J.C. analizó los datos y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito.

                  Autores correspondientes


                  Ver el vídeo: Inhibición de la Hemaglutinación IH (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Lycurgus

    Disculpe, que te interrumpiera, pero sugiero ir otro.

  2. Gardagal

    Gracias por la explicación.

  3. Medwyn

    Genial, es algo divertido

  4. Gabra

    Te pido disculpas, pero creo que te equivocas. Entra lo hablamos. Escríbeme en PM, hablamos.



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