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13.1D: Generación de diversidad de anticuerpos - Biología

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Objetivos de aprendizaje

  1. Definir la translocación de genes y relacionarla con cada linfocito B capaz de producir un anticuerpo con un Fab de forma única.
  2. Defina lo siguiente:
    1. diversidad combinatoria
    2. diversidad de unión
    3. maduración de la afinidad

En esta sección veremos la generación de diversidad de anticuerpos a través de la translocación de genes. Como se mencionó anteriormente, el sistema inmunológico del cuerpo no tiene idea de qué antígenos eventualmente puede encontrar. Por lo tanto, ha desarrollado un sistema que posee la capacidad de responder a cualquier antígeno concebible. El sistema inmunológico puede hacer esto porque tanto los linfocitos B como los linfocitos T han desarrollado un sistema único de empalme de genes llamado translocación de genes, un tipo de proceso de mezcla de genes en el que varios genes diferentes a lo largo de un cromosoma se cortan de una ubicación y se unen. con otros genes a lo largo del cromosoma.

Para demostrar este proceso de translocación de genes, veremos cómo cada linfocito B se programa genéticamente para producir un anticuerpo que funciona como un receptor de células B (BCR) que tiene un Fab de forma única. Como se mencionó anteriormente, la porción Fab de un anticuerpo se compone de 2 cadenas de proteínas: una pesada y una ligera (ver Figura ( PageIndex {1} )).

La porción de la cadena pesada variable del Fab está codificada por una combinación de 3 genes, llamados VH (pesado variable), DH (diversidad pesada) y JH (unión pesada). La porción de cadena ligera variable del Fab consiste en una cadena kappa o una cadena lambda codificada por una combinación de 2 genes, VL (luz variable) y JL (luz de unión). En el ADN de cada linfocito B existen múltiples formas de cada uno de estos genes determinantes variables. Aunque se desconoce el número exacto de cada gen y varía de una persona a otra, hay aproximadamente 38-46 genes VH; 23 genes DH; 6 genes JH; 34-38 genes kappa VL; 5 genes kappa JL; 29-33 genes lambda VL; y 4-5 genes lambda JL.

Mientras que una persona hereda alelos para los diversos genes V (D) J de cada padre, un linfocito B individual solo expresará un conjunto de alelos heredados de uno de los padres. Esto aumenta una mayor diversidad de anticuerpos en ese individuo.

Mediante la translocación aleatoria de genes, cualquier combinación de las múltiples formas de cada gen puede unirse (ver Figura ( PageIndex {2} )) dando como resultado miles de posibles combinaciones de genes. Esto se conoce como diversidad combinatoria.

La translocación genética de los genes V (D) J se inicia cuando una enzima llamada recombinasa V (D) J reconoce secuencias señal de recombinación ubicadas en el extremo 3 'de los genes V, el extremo 5' de los genes J y ambos extremos de los genes D . Como resultado, el cromosoma forma un bucle que permite que diferentes genes de diferentes regiones a lo largo del cromosoma se alineen (ver Figura ( PageIndex {3} )). En la cadena pesada, cualquier gen pesado en J y cualquier gen pesado en D se alinean y se unen cuando los genes se cortan de un lugar y se pegan en otro. Posteriormente, cualquiera de los genes pesados ​​en V se une a este segmento de DJ. En la cadena ligera, el bucle cromosómico permite que cualquier gen V-light se una a cualquier gen J-light.

Animación flash que muestra la translocación de genes y la diversidad combinatoria.

versión html5 de la animación para iPad que muestra la translocación genética y la diversidad combinatoria.

Durante la translocación de genes, enzimas especializadas en el linfocito B causan imprecisiones de empalme en las que se agregan o eliminan nucleótidos adicionales en las diversas uniones de genes. Este cambio en la secuencia de bases de nucleótidos genera una diversidad aún mayor en la forma de Fab. A esto se le llama diversidad de unión.

Además, a medida que proliferan los linfocitos B, experimentan una maduración por afinidad, un proceso que "afina" la forma del sitio de unión del epítopo Fab. Esto se debe a que los genes de inmunoglobulina V de los linfocitos B tienen una tasa de mutación entre 1000 y 10,000 veces mayor que la de otros genes humanos en el cuerpo. Esta hipermutación somática crea una gran oportunidad para la selección de linfocitos B variantes con sitios de unión al antígeno que se ajustan aún mejor y que se ajustan al epítopo con mayor precisión. Cuanto más tiempo y más estrechamente se une el antígeno al receptor de la célula B, mayor es la probabilidad de que el linfocito B sobreviva y se replique. En otras palabras, el "ajuste" del anticuerpo se puede mejorar con el tiempo. La maduración por afinidad ocurre en los centros germinales de los ganglios linfáticos.

Lo más probable es que los humanos produzcan al menos 1011 BCR de diferentes formas. Tenga en cuenta que la forma tridimensional de una proteína está determinada en última instancia por la secuencia de sus aminoácidos y la secuencia de aminoácidos está determinada por el orden de las bases nitrogenadas en los genes que codifican esa proteína. Entre la diversidad combinatoria, la diversidad de unión y la maduración por afinidad, probablemente hay miles de millones de posibles combinaciones de genes y reordenamientos que pueden codificar las porciones Fab de un anticuerpo. Es probable, entonces, que cada linfocito B lleve a cabo una serie única de translocaciones de genes y sea capaz de producir un anticuerpo con un sitio de unión al epítopo de forma única.

Debido a que la translocación de genes es un proceso aleatorio, algunos linfocitos B inmaduros terminan produciendo receptores de células B que se ajustan a los propios antígenos del cuerpo. Los linfocitos B inmaduros con receptores de células B autorreactivos pueden ser estimulados para someterse a un nuevo reordenamiento genético para producir un nuevo receptor que ya no es autorreactivo. El reconocimiento del autoantígeno puede reactivar genes que permiten al linfocito B realizar nuevas recombinaciones V-J de cadenas ligeras y permitir que esa célula exprese un nuevo receptor de células B. Este proceso se llama edición del receptor.

Alternativamente, los linfocitos B autorreactivos también pueden sufrir una selección negativa. Dado que la médula ósea, donde se producen y maduran los linfocitos B, normalmente está libre de sustancias extrañas, los linfocitos B que se unen a sustancias deben reconocerse a sí mismos y son eliminados por apoptosis, un suicidio celular programado. La apoptosis da como resultado la activación de proteasas dentro de la célula diana que luego degradan las proteínas estructurales y el ADN de la célula.

Resumen

  1. Las respuestas inmunitarias adaptativas han desarrollado un sistema que posee la capacidad de responder a cualquier antígeno concebible que el cuerpo eventualmente pueda encontrar a través de un proceso llamado translocación de genes.
  2. La translocación de genes es un tipo de proceso de mezcla de genes en el que varios genes diferentes a lo largo de un cromosoma se cortan de una ubicación y se unen con otros genes a lo largo del cromosoma para crear un número máximo de receptores de células B y células T.
  3. Cada linfocito B se programa genéticamente para producir un anticuerpo que funciona como un receptor de células B (BCR) que tiene un Fab de forma única.
  4. La porción variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo está codificada por múltiples genes y existen múltiples formas de cada uno de estos genes variables.
  5. A través de translocaciones genéticas aleatorias, cualquier combinación de las múltiples formas de cada gen puede unirse dando como resultado miles de posibles combinaciones de genes. Esto se conoce como diversidad combinatoria.
  6. Durante la translocación de genes, las enzimas especializadas en el linfocito B causan imprecisiones de corte y empalme en las que se agregan o eliminan nucleótidos adicionales en las diversas uniones de genes y este cambio en la secuencia de bases de nucleótidos genera una diversidad aún mayor en la forma de Fab. A esto se le llama diversidad de unión.
  7. A medida que proliferan los linfocitos B, experimentan una maduración por afinidad, un proceso que "afina" la forma del sitio de unión del epítopo Fab a través de una alta tasa de hipermutación somática. Esto crea una gran oportunidad para la selección de linfocitos B variantes con sitios de unión al antígeno que se ajustan aún mejor y que se ajustan al epítopo con mayor precisión.
  8. Los linfocitos B inmaduros con receptores de células B autorreactivos pueden ser estimulados para someterse a un nuevo reordenamiento genético para producir un nuevo receptor que ya no sea autorreactivo a través de un proceso llamado edición del receptor. Alternativamente, los linfocitos B autorreactivos también pueden sufrir una selección negativa mediante la cual los linfocitos B que se unen a sustancias reconocidas como "propias" y se eliminan por apoptosis.

Preguntas

Estudie el material de esta sección y luego escriba las respuestas a estas preguntas. No haga clic en las respuestas y escríbalas. Esto no pondrá a prueba su comprensión de este tutorial.

  1. Defina la translocación de genes. (ans)
  2. Relacionar la translocación de genes con cada linfocito B que es capaz de producir un anticuerpo con un Fab de forma única. (ans)
  3. Defina lo siguiente:
    1. diversidad combinatoria (ans)
    2. maduración de la afinidad (ans)

V (D) J recombinación

V (D) J recombinación es el mecanismo de recombinación somática que ocurre solo en los linfocitos en desarrollo durante las primeras etapas de maduración de las células T y B. Da lugar a un repertorio muy diverso de anticuerpos / inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR) que se encuentran en las células B y las células T, respectivamente. El proceso es una característica definitoria del sistema inmunológico adaptativo.

La recombinación V (D) J en los mamíferos ocurre en los órganos linfoides primarios (médula ósea para las células B y timo para las células T) y de forma casi aleatoria reordena la variable (V), la unión (J) y, en algunos casos, la diversidad ( D) segmentos de genes. En última instancia, el proceso da como resultado nuevas secuencias de aminoácidos en las regiones de unión a antígenos de inmunoglobulinas y TCR que permiten el reconocimiento de antígenos de casi todos los patógenos, incluidas bacterias, virus, parásitos y gusanos, así como "células propias alteradas", como se ve en cáncer. El reconocimiento también puede ser de naturaleza alérgica (p.ej. al polen u otros alérgenos) o pueden coincidir con los tejidos del huésped y provocar autoinmunidad.

En 1987, Susumu Tonegawa recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina "por su descubrimiento del principio genético para la generación de diversidad de anticuerpos". [1]


13.1D: Generación de diversidad de anticuerpos - Biología

Los anticuerpos son notablemente diversos, proporcionando suficientes sitios de combinación diferentes para reconocer los millones de formas antigénicas en el medio ambiente. En realidad, se producen más tipos de anticuerpos que genes en nuestro genoma. ¿Cómo se genera esta enorme diversidad?

A lo largo del último siglo se han desarrollado una serie de teorías para explicar la generación de esta diversidad.

A principios de siglo, Paul Ehrlich comenzó a considerar el problema de la especificidad inmunológica. Según su teoría, la combinación de un antígeno con un "receptor de células B preformado", que hoy se conoce como anticuerpo, provocó que la célula produjera y secretara más de esos receptores. Ehrlich creía que una sola célula podría producir anticuerpos que podrían unirse a más de un tipo de antígeno, lo que ahora se sabe que es incorrecto. Sus ideas estaban muy cerca de la visión actual de la selección clonal, excepto que propuso que había varios receptores diferentes en la misma célula. Sin embargo, su teoría fue crucial porque demostró que el sistema inmunológico podía producir receptores antes del contacto real con los antígenos. Las ideas de Ehrlich constituyeron la primera teoría selectiva de la diversidad de anticuerpos que sugiere que el papel del antígeno era seleccionar un anticuerpo complementario y amplificar la producción de ese anticuerpo.

En 1930, se propuso la teoría instructiva o modelo. Según esta teoría, se sintetiza una molécula de anticuerpo en presencia del antígeno que actúa como molde. Esta teoría se amplió posteriormente para incluir la noción de que todos los anticuerpos tenían la misma estructura primaria pero diferían en la conformación de sus cadenas polipeptídicas. El apoyo a esta teoría flaqueó en la década de 1950 cuando la cromatografía de partición demostró que la gammaglobulina era una mezcla compleja de componentes similares. Ahora se sabe que los anticuerpos, al igual que otras proteínas, se sintetizan a partir de aminoácidos utilizando ARNm, no antígeno, como molde.

Jerne desarrolló una versión moderna de la teoría de la selección en 1955. Postuló la presencia de anticuerpos de todas las especificidades potenciales en el suero del individuo. Cuando se introdujo un antígeno, se uniría al anticuerpo complementario y este complejo sería reconocido por una célula productora de anticuerpos. Esta idea básica llevó a la teoría conocida como selección clonal desarrollada por Burnet y Talmage a finales de la década de 1950. La capacidad de responder a los agentes que se encuentran en el medio ambiente está presente antes de que se introduzca el agente. En esta teoría se propuso que los genes estructurales de los anticuerpos acumulan mutaciones somáticas aleatorias durante el curso de la proliferación celular. Por lo tanto, cada variación de anticuerpo surge en una sola célula y se lleva a cabo indefinidamente en los clones o la progenie de esa célula. Por tanto, el antígeno exógeno influiría en las células con un anticuerpo reactivo con él, lo que provocaría la estimulación, la proliferación y la producción del anticuerpo. La razón de una respuesta inmune más rápida y efectiva en el segundo contacto con un antígeno podría explicarse por el hecho de que un contacto previo con un antígeno y la expansión de estos clones celulares específicos daría como resultado una mayor fuerza de respuesta y un mayor número en el segundo contacto. . La teoría clonal puede ayudar a explicar cómo interactúan los anticuerpos y los antígenos, pero todavía no explica cómo se genera la diversidad de anticuerpos.

Evidencia contra las teorías selectiva e instructiva

En 1947, Landsteiner demostró que el sistema inmunológico podía reaccionar con la producción de un anticuerpo específico para cada una de las sustancias químicas orgánicas que se estaban sintetizando en ese momento. No sería posible que el sistema inmunológico tuviera genes para todos estos anticuerpos dirigidos a compuestos artificiales. Haurowitz proporcionó un razonamiento que también contradecía la teoría selectiva. Ehrlich llegó a la conclusión de que los anticuerpos se forman previamente en el organismo y que la presencia de antígenos simplemente aumenta el nivel de síntesis normal de anticuerpos. Haurowitz se dio cuenta de que esta hipótesis solo podría ser válida si solo existieran unos pocos antígenos naturales. Estas ideas apoyaron la instructiva teoría en la que un antígeno actúa sobre un anticuerpo flexible para formar un sitio de unión complementario. Sin embargo, nunca se descubrió ningún mecanismo para la instrucción propuesta. Otros problemas con esta teoría incluían propiedades conocidas de la respuesta inmune, como la memoria inmunológica, y que para que se modificara la estructura del anticuerpo, el antígeno tenía que estar presente en la célula durante períodos de tiempo muy largos. A principios de la década de 1960 se demostró que la secuencia de aminoácidos primaria determina la estructura tridimensional de las proteínas y, por tanto, de los anticuerpos. Esto sirvió como evidencia adicional contra la teoría instructiva. Por tanto, prosiguió la búsqueda de una posible teoría.

Si hay dos tipos de cadenas polipeptídicas y hay regiones de secuencia de aminoácidos variables y constantes dentro de ellas, ¿cómo es posible tener genes que codifiquen esto? Dreyer y Bennett sugirieron que había genes separados para las regiones constante y variable. Hay solo unos pocos genes constantes y una gran cantidad de genes variables. Esto llevó al desarrollo de la teoría de la línea germinal. Cada organismo, en su línea germinal, tiene un gen para cada cadena polipeptídica de anticuerpos de región variable única que puede sintetizar. Los genes separados en copias individuales codifican cada una de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera. Durante la diferenciación, una sola región variable se une a un gen de región constante. Los numerosos genes de regiones variables se producen por evolución química, duplicación de genes, mutación y selección. Aunque esta teoría es parcialmente correcta, tiene muchos problemas. Con la diversidad que está realmente presente, tendría que haber aproximadamente 10,000,000 de anticuerpos codificados dentro de la línea germinal. ¿Hay suficiente ADN para todas estas copias? Un estudio mostró que solo se requeriría aproximadamente el 0,2% del genoma total para codificar esta cantidad de anticuerpos. Otros estudios que muestran pruebas de esta teoría han sido difíciles de conseguir y, a menudo, están sujetos a argumentos basados ​​en la interpretación. En uno de estos estudios de regiones variables de anticuerpos se demostró que la línea germinal constaba de muchos subgrupos. Sin embargo, esto se hizo determinando el número de genes de la región constante contando las secuencias de la región variable, que siempre produjeron un número creciente de genes de la línea germinal. Además, al analizar las secuencias de aminoácidos para las regiones variables del anticuerpo, se puede ver la variación de las cadenas lambda y kappa y se pueden reconocer los subgrupos. Cuantos más subgrupos haya, más genes de la línea germinal debería haber, según esta teoría. Otro estudio para apoyar la teoría de la línea germinal analizó la herencia de idiotipos. La idea aquí era que si todos los genes de la región variable estuvieran codificados en la línea germinal, las observaciones del mismo idiotipo en miembros de la misma familia deberían ser comunes. En ratones, estas observaciones se hicieron hasta tal punto que la teoría de la línea germinal parecía ser la única explicación.

La teoría de la línea germinal somática exige la presencia de solo unos pocos genes variables en la línea germinal en contraposición a la presencia de todos ellos. La diversidad de anticuerpos se genera mediante mutaciones en tan solo un gen de región variable. La mayoría de los anticuerpos útiles se producen por mutación de este pequeño conjunto de genes de región variable y los anticuerpos recién generados se seleccionan mediante antígenos. Esto lleva a dos preguntas: ¿la frecuencia mutacional es lo suficientemente alta y cómo funciona la selección en el sistema inmunológico? En estudios que comparan la mutación de genes bacterianos, se ha encontrado que la frecuencia es lo suficientemente alta. En cuanto a cómo funciona la selección en el sistema inmunológico, solo las células que producen anticuerpos que se unen a los antígenos se subdividen en células plasmáticas secretoras de anticuerpos y células de memoria de larga duración. El problema con esta teoría es que hay producción de muchas células que no fueron seleccionadas por los antígenos. Una vez más, los estudios se analizaron aquí en busca de apoyo para esta teoría sobre la teoría de la línea germinal. En cada caso, aunque los datos recopilados podrían interpretarse de diferentes maneras. Al estudiar las secuencias de aminoácidos, por ejemplo, de la misma manera que se hizo para la teoría de la línea germinal, se encontró que algunos residuos en posiciones para secuencias de regiones variables derivadas de una especie eran diferentes para proteínas de otra especie. Esto refutaría la teoría de la línea germinal porque los genes no han evolucionado a través de procesos selectivos como lo hacen otras proteínas. También mediante el estudio de las cadenas lambda en el ratón se encontró información estructural que muestra que las variantes lambda tienen las mismas secuencias marco y, por lo tanto, las variantes del subgrupo pueden explicarse por una mutación somática. Otro estudio mostró que la teoría de la línea germinal tenía dificultades para explicar el hecho de que las mutaciones se extendían a través de genes de la línea germinal que eran diferentes en todos los demás aspectos. La teoría somática explica estos alotipos como marcadores de regiones marco sobre uno o muy pocos genes de la línea germinal.

Tres fuentes principales de diversidad

Está claro que no existe una teoría que pudiera explicar completamente cómo se genera la diversidad de anticuerpos. Más bien, es una combinación de estas teorías lo que proporciona la mejor explicación. Actualmente existen tres soluciones al problema de la generación de diversidad de anticuerpos. Primero, existe una recombinación somática entre elementos que forman un gen de región variable. Varios segmentos de genes se recombinan para unirse a la parte principal del gen de la región variable. Este proceso ocurre durante la ontogenia de las células B. En segundo lugar, existen múltiples genes de regiones variables en la línea germinal. El tercer factor es la mutación somática. Los genes variables primordiales mutan durante la ontogenia de las células B para producir diferentes genes en diferentes clones de células B.

La primera solución para la generación de diversidad de anticuerpos es la recombinación de genes. Se han estudiado en detalle muchos de los aspectos de la recombinación genética, especialmente en el ratón.

En la década de 1970, el uso de la tecnología del ADN recombinante permitió a los investigadores determinar la secuencia de recombinación genética. El primer ejemplo es la cadena ligera lambda. Se utilizaron endonucleasas de restricción para digerir el ADN. Se encontró que dos segmentos separados de ADN codificaban regiones constantes y variables.En las células que no estaban produciendo anticuerpos activamente, estos segmentos estaban muy separados, pero en las células B completamente diferenciadas, están separados por solo 1500 pares de bases. Entre las regiones variable y constante y unida al segmento variable se encuentra una sección corta de ADN conocida como segmento J. El gen variable codifica la región variable del anticuerpo hasta el aminoácido 95 y el segmento J codifica el resto. El gen del segmento variable está precedido por una señal o secuencia líder. Durante la diferenciación de las células B, uno de los genes lambda variables de la línea germinal se recombina con su segmento J para formar una combinación V-J. Esta secuencia de ADN luego se transcribe para formar una transcripción de ARN primaria que contiene intrones, exones y la secuencia líder. A continuación, los intrones se empalman para dar ARNm, que reúne los genes variable, J y constante. Esto luego se traduce en una proteína.

La formación de la cadena ligera kappa es similar. Es más heterogéneo porque hay un mayor número de genes de segmentos variables. Solo hay un gen de región constante. Los segmentos variables están nuevamente ubicados lejos del gen de la región constante. En el ratón, estos segmentos variables se organizan en conjuntos, cada uno de los cuales contiene siete genes. También hay genes J y pseudogenes que nunca se expresan (cinco y uno respectivamente en el ratón). Esencialmente, el proceso para la generación de la proteína completa es el mismo que para la cadena lambda. Durante la diferenciación de la célula pre-B, uno de los genes kappa variables de la línea germinal se combina con un segmento J-kappa. Se crea una transcripción de ARN primaria que se convierte en ARNm que se traduce en la proteína.

La recombinación de cadena pesada es similar a la recombinación de cadena ligera con algunas diferencias importantes. Nuevamente hay segmentos variables, constantes y J. Sin embargo, también hay otro segmento conocido como segmento D. Estos segmentos tienen secuencias muy variables y el número de codones presentes también difiere significativamente entre los segmentos. Más de un segmento D puede unirse a una combinación V-J. La región D también se puede leer en tres marcos de lectura diferentes sin generar codones de parada, lo que aumenta la diversidad. En el ratón hay 30 segmentos D de la línea germinal.

Los genes de la región de dominio constante se encuentran aguas abajo de los genes del segmento J. Todas las clases de inmunoglobulinas utilizan el mismo conjunto de genes de región variables. Cuando se cambia una clase, todo lo que se cambia son los dominios constantes de la cadena pesada. Esto se ha demostrado mediante el uso de mielomas dobles, donde dos anticuerpos monoclonales están presentes en el suero al mismo tiempo. Por ejemplo, cuando los anticuerpos IgM e IgG están presentes al mismo tiempo y se analizan, se ha encontrado que poseen la misma cadena ligera y regiones pesadas variables pero tienen diferentes dominios de cadena pesada constante. Por lo tanto, solo se cambian las regiones pesadas constantes. El cambio de clase puede ir acompañado o precedido de una mutación somática.

El mecanismo exacto por el cual ocurre la recombinación en cada una de estas situaciones aún no se conoce. Sin embargo, hay dos secuencias señal altamente conservadas que se encuentran en el lado J de cada variable y segmento D. Las secuencias señal son CACAGTG y ACAAAAACC y están separadas por una secuencia espaciadora. Las secuencias espaciadoras tienen una longitud de 12 pares de bases (en el caso de los espaciadores kappa variable, J-lambda y D) o 23 pares de bases (en el caso de los espaciadores lambda variable, variable pesada y J pesada) . Precediendo a todos los segmentos D y J de la línea germinal hay dos secuencias más que están separadas por una secuencia no atendida. Las secuencias que siguen a la cadena ligera variable, la cadena pesada variable o el segmento D son complementarias a las que preceden a los segmentos pesados ​​J lambda, D o J con los que se recombinan. La recombinación puede producirse mediante una enzima recombinasa.

Diversidad en diferentes especies

Aunque los ratones y los seres humanos pueden utilizar la recombinación variable, D y J, no todas las especies crean sus repertorios de inmunoglobulinas mediante este método. En algunas especies, la recombinación de los segmentos variables, D y J parece servir sólo para activar la expresión del gen de inmunoglobulina en una forma específica del linaje de células B. La conversión de genes (descrita más adelante) sirve para crear un repertorio de inmunoglobulinas. En los elasmobranquios, la organización de los genes de la cadena pesada es similar a la de las cadenas ligeras lambda del ratón. La unidad básica es variable pesada - D pesada 1 - D pesada 2 - J pesada - constante pesada y esto se repite varias veces. Su diversidad es limitada ya que la recombinación solo puede ocurrir dentro de cada unidad repetida y no entre diferentes segmentos de genes. En los pollos hay un número limitado de genes que codifican inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras contienen solo una variable, una constante y un segmento J y las cadenas pesadas contienen solo una variable y un segmento J. Aguas arriba del gen de la luz variable hay una región que contiene 25 secuencias. Estas secuencias no poseen un exón líder ni una región promotora. Estos pseudogenes se utilizan en el proceso de conversión de genes. Las secciones se insertan en el gen de la cadena ligera variable. Este proceso continúa durante toda la vida de las células B incluso después de que han abandonado la bolsa. En el gen de la cadena pesada se produce un proceso similar para aumentar la diversidad, utilizándose más de 100 pseudogenes pesados ​​variables. Estudios recientes han demostrado que el 70-90% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de conejo están codificadas por el mismo segmento de genes variable, aunque hay muchos genes pesados ​​variables presentes. Al igual que en la célula B aviar, la conversión de genes se utiliza para generar diversidad dentro del segmento de genes pesados ​​variables reordenado preferentemente.

Genes de múltiples líneas germinales: la segunda solución

¿Cuántos genes de la línea germinal hay? La segunda solución a la diversidad es que existen múltiples genes de línea germinal de regiones variables. Hay aproximadamente 200 segmentos del gen kappa variable de ratón. Esta estimación se basa en los resultados obtenidos a partir del análisis de hibridación líquida y el análisis de transferencia Southern. El número de segmentos del gen -kappa variable humano es 50. También se ha determinado que hay 2 segmentos del gen lambda variable de ratón y 25 humanos. Existen aproximadamente 200 segmentos de genes pesados ​​variables de ratón y 100 humanos. El número de segmentos de genes J-kappa, J-lambda y J-pesados ​​varía de 4 a 6 dependiendo de la especie. El número exacto de segmentos del gen D aún no se conoce. Existen diferentes métodos para determinar el número de segmentos génicos, pero un método común es construir copias de ADNc de las regiones variables a partir de proteínas de mieloma que pertenecen a subgrupos particulares de ratón pesado, lambda o kappa variable (dependiendo de qué genes desee obtener un recuento de ). A continuación, estas copias de ADNc se hibridan con digestiones de restricción de ADN embrionario de ratón. Se determina el número medio de fragmentos de restricción observados mediante análisis de hibridación con filtro Southern. Esto representa el número de genes por subgrupo. La secuenciación de aminoácidos de las regiones variables de ratón determinará el número de subgrupos que existen. Al multiplicar el número de genes por subgrupo por el número de subgrupos, se puede determinar el número total de segmentos de genes.

El tercer gran proceso involucrado en la generación de diversidad es la mutación somática, que es un cambio estructural que puede sufrir un gen. Esto puede suceder de forma espontánea o cuando se somete a determinadas condiciones ambientales. Es un proceso que ocurre en la maduración de las células B que afecta la región del gen del anticuerpo y que permite el refinamiento de la especificidad del anticuerpo. Se sabe que la mutación somática se produce en todos los segmentos de genes y que esto conduce a una mayor diversidad. En estudios en el ratón se encontró que la mutación tenía lugar en las cadenas pesadas V-lambda, V-kappa y V.

En la cadena V-lambda hay un único gen de región variable lambda para cada uno de los dos subgrupos de región V lambda. De los subgrupos hay una proteína V-lambda2 y nueve proteínas V-lambda1 diferentes. Con una comparación directa de la proteína con el ADN, se puede decir que la mutación somática debe haber dado lugar a las 8 proteínas V-lambda1 variantes. En el ratón, dado que probablemente existen más de veinte proteínas lambda, se pueden derivar hasta veinte variantes de un solo gen de la línea germinal.

En el segmento V-kappa, los anticuerpos implicados en la respuesta a la fosforilcolina en ratones utilizan un grupo de genes de la región variable de la cadena pesada y al menos tres grupos de genes de la región de la cadena ligera V-kappa. Estos pueden verse como ejemplos en mielomas de ratón, en las secuencias de proteínas MOPC167 y MOPC511. Dado que ninguna de estas secuencias puede detectarse en la línea germinal, deben haber surgido por medio de una mutación somática del gen conocido como V-kappa167.

En los estudios de segmentos pesados ​​en V se ha demostrado aquí que también se ha producido una mutación somática. Un estudio, por ejemplo, encontró que hay cuatro miembros estrechamente relacionados, pero no idénticos, del gen pesado V de T15. Estos miembros probablemente surgieron debido a una mutación somática.

¿Es el gen reordenado el único sujeto a mutación, o también está sujeto el gen de la línea germinal? En la maduración de las células B, se sabe que un segmento V de un alelo se une a un segmento J y excluye el alelo opuesto. Entonces, ¿puede tener lugar una mutación en el gen alélico no reordenado? La respuesta a esto se encontró cuando se encontró que el gen no reordenado estaba en la línea germinal y, por lo tanto, se pudo concluir que la mutación somática ocurre solo en el gen reordenado. Este descubrimiento llevó a la sugerencia de que el reordenamiento puede ser un desencadenante de la mutación somática. En los estudios de Gearhart (1983), en los que se clonaron seis genes V-kappa167 reorganizados y se compararon con las secuencias de los genes de la línea germinal, se detectó una mutación somática dentro y alrededor del gen VJ, pero no a mitad de camino entre VJ y constante, y no en y alrededor del segmento constante. La frecuencia de mutación en el segmento V-J fue del 0,4% y muchos tenían mutaciones extensas en un área centrada alrededor del gen V-J. No se encontraron mutaciones en sitios distantes. Las mutaciones encontradas se debieron principalmente a sustituciones de nucleótidos sin preferencia por transiciones o transversiones. Las mutaciones también parecían ocurrir en grupos probablemente causadas por reparaciones propensas a errores que ocurren durante los ciclos de división celular. Por lo tanto, los estudios de Gearhart concluyeron que la mutación somática ocurre en genes reordenados en grupos debido a algún tipo de mecanismos de reparación erróneos.

Otra influencia que tiene la mutación somática sobre la diversidad de anticuerpos es que, cuando se produce de forma extensa, ayudará a producir anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno. Esto ocurre cuando los antígenos reaccionan con las células T y así estimulan a las células B para que expresen anticuerpos de superficie de baja afinidad. Otros factores de crecimiento y diferenciación inducirán una mayor proliferación y diferenciación de la célula formadora de anticuerpos. Esto será seleccionado por antígenos. Este potencial de mutación somática para producir aumentos en la afinidad se ha demostrado mediante mutagénesis específica de sitio, para reconstruir anticuerpos que han sufrido esta transformación. Esto también plantea la posibilidad de que tras la interacción con un antígeno, un anticuerpo pueda sufrir cambios que darán como resultado una disminución o un aumento de la reactividad con un antígeno.

El tiempo en la diferenciación de células B cuando ocurre la mutación también se ha estudiado con el uso de anticuerpos monoclonales de regiones variables de la línea germinal. Se encontró que los anticuerpos de IgM e IgG no mostraban mutaciones somáticas durante los primeros siete días después de la exposición al antígeno. Los anticuerpos producidos catorce días o más después de la exposición habían sufrido muchos cambios de base. Una vez que ha comenzado la mutación somática, se producen rondas repetidas durante un período de unas pocas divisiones celulares y, por lo tanto, las exposiciones posteriores al antígeno conducen a aumentos progresivos de la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Sin embargo, todos los cambios de base no ocurren en una división celular y es probable que la mutación somática se apague cuando la célula B se diferencia en una célula plasmática que secreta grandes cantidades de anticuerpo.

Los tres factores principales que influyen en la generación de diversidad de anticuerpos no son los únicos. Muchos otros mecanismos y rarezas también influyen en la cantidad de diversidad.

Los pseudogenes, que se encuentran en todos los tipos de segmentos, carecen de las secuencias de bases necesarias para permitir que se recombinen, lo que los convierte en un intrón eficaz. Se cree que hasta un tercio de los genes de la línea germinal son pseudogenes. Los pseudogenes afectan la diversidad al disminuir el número de segmentos de genes involucrados en la generación del anticuerpo. Sin embargo, se desconoce el papel exacto de los pseudogenes. Pueden actuar en eventos de recombinación y aumentar la extensión del repertorio aunque no sean funcionales. Se pueden introducir elementos de pseudogenes en genes funcionales a través de la conversión de genes (que se discutirá más adelante), aumentando así la diversidad.

Otra situación que conduce a una mayor diversidad es la adición de nucleótidos entre los segmentos de cadena pesada D y J y entre los segmentos de cadena pesada variable y los segmentos D. Este proceso es facilitado por la enzima desoxinucleótido transferasa terminal. Esto se conoce como diversidad de la región N.

El emparejamiento de cadenas ligeras y cadenas pesadas también tiene un efecto sobre la diversidad de anticuerpos. La gran mayoría de los datos experimentales sugiere que se puede utilizar alguna forma de emparejamiento combinatorio aleatorio de cadenas pesadas y cadenas ligeras para amplificar la diversidad de anticuerpos. Existe evidencia de que diferentes cadenas ligeras pueden combinarse con las mismas cadenas pesadas. En el ratón BALB / c, el mismo gen T15 codifica la cadena pesada, pero hay tres genes de cadena ligera distintos para el anticuerpo antifosforilcolina. Cada una de estas cadenas ligeras puede combinarse con la cadena pesada única, de modo que existen tres familias de anticuerpos antifosforilcolina.

La conversión de genes es otro factor importante en la generación de diversidad de anticuerpos. La conversión de genes es el mecanismo por el cual dos genes estrechamente relacionados interactúan de manera que toda o parte de la secuencia de ADN de uno se vuelve idéntica a la del otro. Este proceso se ha demostrado en levaduras y puede estar presente en mamíferos. Un mamífero de particular interés es el conejo. La región cromosómica de la cadena pesada en conejos es similar a la de otros mamíferos, excepto que un gen pesado variable (V-h1) se utiliza preferentemente cuando las combinaciones aleatorias que unen los múltiples segmentos de genes pesados ​​variables, pesados ​​D y pesados ​​J no son contribuyente principal a la diversidad de anticuerpos. En estos casos, ¿cuál es el principal contribuyente a la diversidad de anticuerpos? En los estudios de Becker y Knight (1990) de siete genes V-D-J de conejos, identificaron al menos cinco eventos potenciales de conversión de genes. La alta frecuencia de estos eventos sugiere que la conversión de genes es un medio importante para generar diversidad de anticuerpos en conejos. Puede ocurrir somáticamente o puede ocurrir entre genes de la línea germinal porque el proceso puede ocurrir tanto en la meiosis como en la mitosis. Puede explicar la conservación de las regiones marco de inmunoglobulina en diferentes subgrupos o especies. Si se produce durante la diferenciación, la diversidad puede amplificarse produciendo moléculas quotíbridas que expresan segmentos codificados por varios genes relacionados. Aún se necesita más investigación en esta área.

Otro caso que da como resultado una mayor diversidad de anticuerpos es el reemplazo de secuencias señal recombinantes. Esto ocurre cuando las secuencias señal de un segmento génico de peso variable se fusionan intactas al extremo 5 'de una secuencia codificante de D-Jh, lo que puede dar como resultado la pérdida de nucleótidos de la secuencia D-Jh. Esto puede deberse a la resolución alternativa de un intermedio en la recombinación Vh a D-Jh. Esta ocurrencia proporciona los medios para alterar la dirección de los segmentos de genes de inmunoglobulina. Esto también puede explicar la aparición de la unión Vh-Jh in vivo en la que se elimina la secuencia D.

The Future Appears Bright & # 02 Los anticuerpos son, por supuesto, muy importantes para nosotros y se puede ver que durante los últimos 100 años se han planteado muchas teorías para tratar de explicar su diversidad. Las teorías de Ehrlich, incluida su teoría selectiva, a principios de siglo, aunque erróneas, finalmente llevaron a la postulación de la teoría de la selección clonal. También se demostró que la teoría instructiva o de la plantilla estaba equivocada, pero las ideas que se crearon también inspiraron más investigaciones. En la segunda mitad del siglo, dos nuevas teorías opuestas gozaron de mayor popularidad como fuentes de diversidad de anticuerpos. Estas teorías, la teoría de la línea germinal y la teoría de la mutación somática, se investigaron con bastante profundidad y los resultados nunca apuntaron claramente a ninguno de los mecanismos. Al final se decidió que ambas teorías eran correctas y que se combinaban con otros factores, como la recombinación, para generar diversidad. Algunos de los factores que contribuyeron a la diversidad de anticuerpos son los pseudogenes, la conversión de genes, la diversidad de la región N y el diferente emparejamiento de cadenas ligeras y pesadas, y el reemplazo de la secuencia señal. También se señaló que diferentes especies podrían sufrir diferentes eventos de recombinación que conduzcan a una mayor o menor diversidad. Al final, este artículo intentó tocar brevemente algunos de los muchos factores que afectan la diversidad de anticuerpos. En el futuro, seguramente habrá más descubrimientos y una mayor comprensión del problema en cuestión.

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Reordenamiento y diversidad de genes de anticuerpos En vivo

Sin embargo, antes de sintetizar cadenas de Ig, los genes de Ig deben ensamblarse dentro de un genoma de células en diferenciación (reordenamiento). El proceso general de ensamblaje de alto nivel para el ensamblaje de genes de cadena pesada y cadena ligera y la traducción en una secuencia de anticuerpos IgG se muestra en la Fig. 2. La extraordinaria diversidad de anticuerpos humanos proviene de la combinación del ensamblaje de diferentes VH, DH y JH, Vκ y Jκ segmentos, o Vλ y Jλ segmentos y emparejamiento de las cadenas pesada y ligera, para generar el repertorio de anticuerpos primarios. El proceso de diversificación de Ig en humanos es muy complejo y está vinculado jerárquicamente con las cinco etapas del desarrollo de las células B en la médula ósea, y cada etapa bioquímica y genética es necesaria para el siguiente paso y se corresponde con una etapa de desarrollo celular.

Fig.2 Ensamblaje de proteínas y genes de anticuerpos en vivo

Abreviaturas: C: cadena constante D: segmento de diversidad J: cadena de unión V: cadena variable. Tenga en cuenta que, si bien solo se muestran regiones V, J, D y C individuales para simplificar, estas se seleccionan de un gran número de genes. Los principales procesos que conducen al siguiente paso en el ensamblaje de anticuerpos se indican a la izquierda. Las transcripciones de ARN se indican con "AAA" que designa las colas poli-A.

Los siguientes pasos independientes del antígeno en el desarrollo de células B ocurren en la médula ósea:

  1. Los genes de cadena pesada de células madre (IGH) y de cadena ligera kappa (κ) y lambda (λ) (IGK e IGL) están en configuración de línea germinal.
  2. Célula pro-B temprana: el IGH sufre un reordenamiento del gen D – J con pérdida de ADN entre los segmentos D y J unidos. Tras la inducción del gen de activación de recombinación 1 (RAG1), RAG2 y TdT en las células pro-B, los segmentos de los genes DH y JH se unen primero mediante un proceso dependiente de RAG-1, 2.
  3. Célula pro-B tardía: el IGH sufre un reordenamiento V-DJ (reordenamiento VDJ) con pérdida de ADN entre los segmentos V y D unidos. La recombinación puede ser algo imprecisa, ya que durante este proceso se pueden eliminar o agregar varios nucleótidos de una unión, por lo que la combinación de segmentos VDJ de cadenas H da como resultado una gran cantidad de posibles secuencias (es decir, anticuerpos). Este proceso de reorganización, conocido como unión combinatoria, es la fuente predominante de anticuerpos
  4. Células pequeñas pre-B: reordenamiento V-J de los genes de la cadena ligera. La cadena κ se reordena primero y luego, si el reordenamiento de ambos alelos κ no tiene éxito, la cadena λ se reordena.
  5. Células pre-B grandes: expresión intracelular y expresión superficial transitoria de la cadena m con pseudocadena ligera invariante (receptor de células pre-B). La expresión exitosa en la superficie celular del receptor de células pre-B desencadena la exclusión alélica para prevenir el reordenamiento del segundo alelo y también inicia la proliferación de células pre-B, lo que da como resultado diferentes cadenas ligeras emparejadas con el mismo reordenamiento de cadena pesada en diferentes células hijas.

Los siguientes pasos dependientes del antígeno en el desarrollo de las células B tienen lugar en la periferia:

  1. Célula B inmadura - Expresión de superficie de IgM. En el escenario más común, un segmento VDJ se une primero con Cμ genes, y posteriormente con Cγ, Cε, Cα genes, con síntesis de una cadena H IgM completa, etc. Sin una cadena L asociada, la expresión superficial no es posible y solo citoplásmica μ se encuentra (células pre-B).
  2. Células B maduras vírgenes: IgD e IgM expresadas en la superficie celular, elaboradas a partir de transcripciones empalmadas alternativamente.
  3. Linfoblastos: el empalme alternativo produce IgM secretada.
  4. Célula B de memoria: cambio de isotipo a IgG. La hipermutación somática de IGH ocurre en el centro germinal de los ganglios linfáticos. Las Ig mutadas se seleccionan para mejorar la unión al antígeno en un proceso denominado maduración por afinidad.
  5. El subconjunto de células B que expresan IgD e IgM de superficie se somete a una reordenación de ADN adicional, cambio de clase, que da como resultado la expresión de IgG, IgA o IgE, cambiando la región constante de IgH y, por lo tanto, las funciones efectoras asociadas con la Ig, sin cambiar la especificidad
  6. Un subconjunto de células B sobrevive como células B de memoria de larga duración, que responden rápidamente al antígeno y se diferencian en células plasmáticas productoras de anticuerpos.
  7. Célula plasmática diferenciada terminalmente: el corte y empalme alternativo produce Ig tanto unida a la membrana como secretada.

El mecanismo de reordenamiento genético se detalla aquí:

La recombinación de VDJ procede a través de una escisión precisa del ADN iniciada por las proteínas RAG (RAG-1 y RAG-2) en secuencias señal conservadas cortas [128]. Cualquiera que sea su función precisa, la expresión coordinada en pre-B es esencial para el reordenamiento de los genes de Ig, pero la actividad de RAG se desactiva en los linfocitos maduros. Los reordenamientos están cuidadosamente orquestados, siguiendo el principio de exclusión alélica, es decir, en cada célula B se transcribe el producto génico de solo uno de cada par de cromosomas. El gen ubicado en el segundo cromosoma generalmente no se usa, para prevenir la síntesis contemporánea de cadenas H con dominios V diferentes en cualquier célula dada, es un alelo, término que designa dos genes o dos o más formas alternativas de un solo gen que ocupa el mismo lugar. El gen en el segundo cromosoma no se reordena a menos que se produzca un reordenamiento no productivo cuando los reordenamientos no son productivos en ambos cromosomas, se produce la muerte celular, aclarando así por qué los mismos linfocitos B durante toda su vida pueden producir solo un tipo único de cadena L (κ o λ). Los segmentos de genes de Ig V, D y J están flanqueados por conservados secuencias señal de recombinación (RSS), que consta de un heptámero y un nonámero separados por un espaciador no conservado de 12 o 23 nucleótidos. La regla de 12-23 pares de bases se postuló por primera vez para explicar el reordenamiento del gen de Ig. Prácticamente, durante un reordenamiento, un gen con una secuencia flanqueante que contiene un espaciador de 12 pares de bases solo puede unirse a un gen cuya secuencia flanqueante tiene un espaciador de 23 pares de bases y viceversa, aclarando así el orden preciso de las transcripciones de genes de Ig. En primer lugar, RAG-1 reconoce RSS y forma un complejo de RAG-1 / RAG-2 que corta una sola secuencia de ADN. Y luego se forma una horquilla mediante la adición de copias de los últimos nucleótidos de la región codificante (plantillas o adiciones & # 8220P & # 8221) o mediante adiciones aleatorias de nucleótidos por la enzima TdT (adiciones TdT, & # 8220N & # 8221). La unión de los extremos de codificación de los segmentos de genes reorganizados es imprecisa debido a adiciones de bases, pérdidas de bases y unión fuera del marco. Esta imprecisión de la unión genera diversidad & # 8220junctional & # 8221. Existe un mecanismo de reordenamiento genético similar en las células T (linfocitos T).

El principio de diversidad de anticuerpos se comprende completamente. Existe una relación muy estrecha entre la secuencia de aminoácidos y la función del anticuerpo. Como sabemos, existe una función enormemente diversa entre dos anticuerpos que tienen casi el mismo aminoácido incluso si un aminoácido es diferente. Sobre esta base, la precisión de la secuenciación de anticuerpos es muy importante en la investigación relacionada. Creative Biolabs proporciona servicios de secuenciación de anticuerpos de novocon 100% de precisión para las industrias de investigación, diagnóstico y terapéuticas.

Referencia: Anne Davidson. El papel de los reordenamientos de genes de regiones variables en la generación de autoanticuerpos. Inmunología contemporánea. págs. 177-19.


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Números de clonación

Cada número de clon representa una línea celular específica que se utilizó para producir el anticuerpo. Dado que los anticuerpos son producidos por más de un huésped, cada línea celular clonada recibe un número de clon único. Cada clon de células de hibridoma produce solo un tipo de anticuerpo puro.

  • Un animal inyectado con un antígeno generará múltiples anticuerpos contra muchos epítopos. Dado que los anticuerpos son producidos por las células B, un solo clon de células B puede producir anticuerpos contra un solo epítopo.
  • Los anticuerpos monoclonales se derivan de un solo clon de células y se pueden generar en grandes cantidades.
  • Los anticuerpos policlonales contienen múltiples clones de anticuerpos producidos contra diferentes epítopos del antígeno. Por ejemplo, si hay cuatro epítopos en el antígeno, se producirán cuatro clones diferentes de anticuerpos.
  • Los diferentes clones de anticuerpos pueden tener diferentes propiedades e incluso pueden ser de diferentes isotipos. También pueden funcionar en diferentes aplicaciones. Por lo tanto, es mejor seleccionar un clon de anticuerpo que funcione de manera óptima en su elección de aplicación.
  • Es importante reconocer que un número de clon no es sinónimo del número de lote, que a menudo indica la fecha de fabricación.

¿MMR juega un papel directo o indirecto en SHM y RSE?

El hecho de que los ratones deficientes en MSH2 cambien los espectros de SHM, la frecuencia de CSR y las características de los sitios de recombinación en CSR sugiere que la MMR juega un papel directo e importante en ambos procesos (Martin y Scharff 2002a). Sin embargo, algunos investigadores han sugerido que los defectos en estos procesos en los ratones deficientes en MMR condujeron a una detención del desarrollo de las células B debido a la inestabilidad genómica en las células B que se dividen rápidamente oa la pérdida de señales apoptóticas u otras (Frey et al. 1998 Vora et al. 1999). Esta preocupación también surge de la observación de que los defectos en SHM que se han observado en ratones MSH2 - / - o MSH6 - / - son más pronunciados que los defectos en ratones deficientes en MLH1 o PMS2, aunque estos últimos actúan aguas abajo en el proceso de MMR y se esperaría que condujera a los mismos defectos (para una revisión, ver Martin y Scharff 2002a). Este enigma se ve agravado por la observación de que las uniones S se ven diferentes en los ratones con deficiencias en diferentes proteínas MMR. Se esperaba que las secuencias de estos sitios de recombinación revelarían los procesos bioquímicos que habían ocurrido (Stavnezer 2000). Las uniones Sμ-Sγ3 de las células B esplénicas de ratones deficientes en MSH2 estimulados para cambiar in vitro mostraron microhomologías más cortas, uniones más romas y más inserciones que los ratones de tipo salvaje (Schrader et al. 2002). Inesperadamente, los ratones deficientes en PMS2 o MLH1 exhibieron microhomologías más largas en las uniones S que los ratones de tipo salvaje (Ehrenstein et al. 2001 Schrader et al. 2002). Además, los ratones MSH2 / MLH1 doblemente deficientes exhiben uniones de conmutación similares a las de los ratones deficientes en MLH1, pero no a las de los ratones deficientes en MSH2, aunque los ratones con deficiencia doble y única exhiben un grado similar de reducción en el cambio a diferentes isotipos en comparación con los controles de tipo salvaje. (Schrader et al. 2003). Lo que es especialmente interesante es que los ratones MSH2 deficientes en ATPasa exhiben un fenotipo mixto de uniones de conmutación, es decir, tienen microhomologías más largas, como los ratones deficientes en PMS2 o MLH1, y tienen más inserciones, como los ratones deficientes en MSH2 ( Martin et al.2003). Es difícil explicar el significado de microhomologías e inserciones de diferentes tamaños en las uniones S en los ratones que carecen de varias proteínas MMR. Debido a que el mecanismo exacto de la RSC no está claro en este momento, se requerirán experimentos adicionales in vivo e in vitro para aclarar esto.

A pesar de estas incertidumbres, es difícil imaginar cómo estas diferencias en los patrones de mutación en SHM y las características de las uniones S podrían surgir como resultado de alguna detención inespecífica en el desarrollo de las células B, por lo que estas observaciones parecen respaldar un papel directo para MMR en SHM y CSR. El papel directo de la MMR en la SHM está respaldado por nuestra reciente observación de que la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con anticuerpos contra Exo1 y Mlh1 revelan que están físicamente asociados con la región V pero no con la región C en las células BL2 que se someten a SHM (PD Bardwell y MD Scharff, no publicado). Además, los ratones mutantes MSH2 ATPasa, que son deficientes en la reparación de errores de emparejamiento pero conservan la capacidad de señalizar la apoptosis, exhiben características de SHM y CSR similares a las de los ratones con inactivación completa de MSH2, lo que sugiere que es la actividad de MMR per se lo que es participan en el proceso de diversificación de anticuerpos en lugar de desencadenar la apoptosis (Martin et al. 2003).


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Las cadenas ligeras y pesadas constan de regiones constantes y variables

La comparación de las secuencias de aminoácidos de diferentes moléculas de anticuerpos revela una característica sorprendente con importantes implicaciones genéticas. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas tienen una secuencia variable en sus extremos N-terminales pero una secuencia constante en sus extremos C-terminales. En consecuencia, cuando se comparan las secuencias de aminoácidos de muchas cadenas de & # x003ba diferentes, las mitades C-terminales son las mismas o muestran solo diferencias menores, mientras que las mitades N-terminales son todas muy diferentes. Las cadenas ligeras tienen un región constante aproximadamente 110 aminoácidos de largo y una región variable del mismo tamaño. La región variable de las cadenas pesadas (en su extremo N-terminal) también tiene una longitud de aproximadamente 110 aminoácidos, pero la región constante de la cadena pesada es aproximadamente tres o cuatro veces más larga (330 o 440 aminoácidos), según la clase (Figura 24-30).

Figura 24-30.

Regiones constantes y variables de cadenas de inmunoglobulinas. Tanto las cadenas ligeras como pesadas de una molécula de anticuerpo tienen distintas regiones constantes y variables.

Son los extremos N-terminales de las cadenas ligera y pesada los que se unen para formar el sitio de unión al antígeno (figura 24-21), y la variabilidad de sus secuencias de aminoácidos proporciona la base estructural para la diversidad de unión al antígeno. sitios. La diversidad en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas está en su mayor parte restringida a tres pequeñas regiones hipervariables en cada cadena, las partes restantes de la región variable, conocida como regiones marco, son relativamente constantes. Sólo los 5 & # x0201310 aminoácidos de cada región hipervariable forman el sitio de unión al antígeno (figura 24-31). Como resultado, el tamaño del determinante antigénico que reconoce un anticuerpo es generalmente comparativamente pequeño. Puede constar de menos de 25 aminoácidos en la superficie de una proteína globular, por ejemplo.

Figura 24-31.

Regiones hipervariables de anticuerpos. Dibujo muy esquematizado de cómo las tres regiones hipervariables en cada cadena ligera y pesada forman juntas el sitio de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo.


La generación de la diversidad: la teoría de la selección clonal y el auge de la inmunología molecular

En las últimas décadas, la inmunología ha sido uno de los campos más interesantes y exitosos de la investigación biomédica. Durante los últimos treinta años, los inmunólogos han adquirido una comprensión detallada del mecanismo de reconocimiento único del sistema inmunológico y de los medios celulares y químicos utilizados para destruir o neutralizar los organismos invasores. Esta comprensión se ha formulado en términos de la teoría de la selección clonal, la explicación dominante del comportamiento inmunológico. Esa historia es el tema de La generación de la diversidad.

Un problema importante para los inmunólogos había sido durante mucho tiempo determinar cómo las células del sistema inmunológico podían producir millones de anticuerpos distintos y producirlos a demanda. La teoría de la selección clonal explica que las células con instrucciones genéticas para producir cada anticuerpo existen en el cuerpo en pequeñas cantidades hasta que la exposición a la molécula correcta, el antígeno, desencadena la clonación selectiva que reproducirá exactamente la célula necesaria. Pero, ¿cómo se pueden generar tantas células productoras de anticuerpos diferentes a partir de un material genético tan limitado? La solución a esta pregunta provino de nuevas aplicaciones de la biología molecular y, como argumentan los autores, el impacto de las nuevas técnicas cambió tanto los métodos como los conceptos de inmunología.

La generación de la diversidad es una historia intelectual del principal problema teórico de la inmunología y su resolución en el período posterior a la Segunda Guerra Mundial. Proporcionará a los inmunólogos los antecedentes esenciales para comprender los conflictos conceptuales que ocurren hoy en día en el campo.


La generación de diversidad de anticuerpos en la tortuga.

La respuesta Ab en reptiles se ha estudiado a nivel de proteínas, y en las tortugas algunos aspectos se parecen a los de los vertebrados de sangre fría de otras clases. Las bases genéticas de estas características no están claras. El presente estudio es el primero sobre la organización y complejidad de IgH de un sistema de genes de Ig de reptiles. El enfoque para la clonación de secuencias de tortuga (Pseudemys scripta) se basa completamente en la PCR, y su eficacia se demuestra mediante la obtención de información extensa sobre un sistema de genes de Ig hasta ahora inexplorado. Se aislaron varias secuencias de VH genómicas, que representan posiblemente cuatro familias, al igual que un clon de C mu 4 genómico. Estas secuencias, utilizadas como sondas, proporcionaron pruebas de que en la tortuga hay un solo locus de IgH con múltiples genes VH y un gen C mu. En las hibridaciones Northern, la sonda C mu 4 detectó dos transcripciones de los cuatro grupos VH, solo se expresó uno y múltiples bandas indicaron la presencia de al menos dos transcripciones no mu. Utilizando PCR de transcripción inversa en ARN de bazo o hígado, se obtuvo una secuencia de cadena pesada de IgM, al igual que varios reordenamientos de VDJ. Entre 32 reordenamientos VDJ únicos de un animal, había 22 variantes de secuencia en el marco 4, lo que sugiere un gran número de segmentos J o una modificación somática en la región variable. La última interpretación está respaldada por mutaciones puntuales encontradas en el marco 3 y CDR3. El número de cambios es considerablemente mayor que la tasa de incorporación errónea de Taq deducida (0,05%).