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8.1: Aislamiento de ADN genómico - Biología

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Las estrategias de purificación del ADN se basan en las propiedades químicas del ADN que lo distinguen de otras moléculas en la célula, es decir, que es una molécula muy larga con carga negativa. Para extraer ADN purificado de una muestra de tejido, las células se abren triturando o lisis en una solución que contiene sustancias químicas que protegen el ADN al mismo tiempo que interrumpen otros componentes de la célula (Figura ( PageIndex {2} )). Estos productos químicos pueden incluir detergentes, que disuelven las membranas lipídicas y desnaturalizan las proteínas. Un catión como Na+ ayuda a estabilizar el ADN cargado negativamente y a separarlo de proteínas como las histonas. Se agrega un agente quelante, como EDTA, para proteger el ADN secuestrando Mg2+ iones, que de otro modo pueden servir como un cofactor necesario para nucleasas (enzimas que digieren el ADN). Como resultado, las moléculas de ADN de doble hebra libres se liberan de la cromatina al tampón de extracción, que también contiene proteínas y todos los demás componentes celulares. (Los conceptos básicos de este procedimiento se pueden realizar con productos químicos domésticos y se presentan en YouTube).

Las moléculas de ADN libres se aíslan posteriormente mediante uno de varios métodos. Por lo general, las proteínas se eliminan ajustando la concentración de sal para que precipiten. los flotante, que contiene ADN y otros metabolitos más pequeños, se mezcla con etanol, lo que hace que el ADN se precipite. Un pequeño bolita de ADN se puede recolectar por centrifugación y, después de eliminar el etanol, el sedimento de ADN se puede disolver en agua (generalmente con una pequeña cantidad de EDTA y un tampón de pH) para su uso en otras reacciones. Tenga en cuenta que este proceso ha purificado todo el ADN de una muestra de tejido; si queremos aislar aún más un gen específico o un fragmento de ADN, debemos utilizar técnicas adicionales, como la PCR.


Aislamiento de ADN genómico de tejidos animales

Introducción
Una rápida expansión del análisis de ADN en la investigación médica, biotecnológica y básica ha creado la necesidad de métodos comerciales simples y eficientes para aislar el ADN genómico. Se encuentran disponibles muchos métodos y tecnologías diferentes para el aislamiento de ADN genómico. En general, todos los métodos implican la rotura y lisis del material de partida seguido de la eliminación de proteínas y otros contaminantes y finalmente la recuperación del ADN. La eliminación de proteínas se logra típicamente mediante digestión con proteinasa K, seguida de salazón, extracción orgánica o unión del ADN a un soporte de fase sólida (ya sea por intercambio de aniones o tecnología de sílice). El ADN se recupera habitualmente mediante precipitación con etanol o isopropanol. La elección de un método depende de muchos factores: la cantidad y el peso molecular requeridos del ADN, la pureza requerida para las aplicaciones posteriores y el tiempo y los gastos. La separación del ADN de los componentes celulares se puede dividir en cuatro etapas. Disrupción, Lisis, Eliminación de proteínas y contaminantes y Recuperación de ADN.

Objetivo
1. Aprenda a aislar ADN genómico de tejido animal.
2. Observar las fases del tejido animal en microcentrífuga.

Materiales
1. Tejido fresco de animal (pescado)
2. Mortal y mortero,
3. Placa de Petri
4. Tampón de lisis
5. Tubo de centrífuga de 1,5 ml
6. Fenol: cloroformo (1: 1)
7. Proteinasa K
8. NaOAc 3 M (ph 6,0)
9. Etanol absoluto
10. 70% de etanol
11. Tampón TE / agua destilada

Procedimiento
1) El pescado fresco se cortó a 0,5 cm.
2) Tejido de pescado lavado con alcohol al 70%
3) Humedecer el tejido con una gota de alcohol al 70% (en placa de Petri) 4) Picar el tejido con mortero y mortero
5) Se transfirió tejido picado a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml 6) Se agregaron 500 ml de tampón de lisis
7) Se agregaron 50 ml de proteinasa k
8) Suspensión incubada (20 min, 65 ° C)
9) Mezclado el.


Referencias: 1. PubMed
2. Ramirez-Solis R, Rivera-Prez J, Wallace JD, Wims M, Zheng H, Bradley A. Microextracción de ADN genómico: un método para analizar numerosas muestras. Anal Biochem. 1992


ADN (bibliotecas de genes): construcción, bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc

Una biblioteca de ADN es un conjunto de fragmentos clonados que representan colectivamente los genes de un organismo en particular. Se pueden aislar genes particulares a partir de bibliotecas de ADN, al igual que se pueden obtener libros de bibliotecas convencionales.

El secreto es saber dónde y cómo mirar. Hay dos tipos generales de biblioteca de genes: una biblioteca genómica, que consiste en el ADN cromosómico total de un organismo y una biblioteca de ADNc, que representa el ARNm de una célula o tejido en un momento específico.

La elección del tipo particular de biblioteca de genes depende de varios factores, siendo el más importante la aplicación final de cualquier fragmento de ADN derivado de la biblioteca. Si el objetivo final comprende el control de la producción de proteínas para un gen en particular o su arquitectura, entonces deben usarse bibliotecas genómicas.

Sin embargo, si el objetivo es la producción de proteínas nuevas o modificadas, o la determinación de la expresión específica de tejido de patrones de tiempo, las bibliotecas de ADNc son más apropiadas. La consideración principal en la construcción de bibliotecas genómicas o de ADNc es, por lo tanto, el material de partida de ácido nucleico. Dado que el genoma de un organismo es fijo, el ADN cromosómico puede aislarse de casi cualquier tipo de célula para preparar ADN genómico.

Sin embargo, por el contrario, las bibliotecas de ADNc representan solo ARNm que se produce a partir de un tipo de célula específico en un momento particular del desarrollo de la célula. Por tanto, es importante considerar cuidadosamente el tipo de célula o tejido del que se derivará el ARNm en la construcción de bibliotecas de ADNc.

Hay una variedad de vectores de clonación disponibles, muchos de ellos basados ​​en moléculas naturales como plásmidos bacterianos o virus que infectan bacterias. La elección del vector también depende de si se construye una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc.

Construcción de bibliotecas de genes:

Digestión de moléculas de ADN genómico:

Una vez que se ha aislado y purificado el ADN genómico, se digiere con endonucleasas de restricción. Estas enzimas son la clave para la clonación molecular debido a la especificidad que tienen para determinadas secuencias de ADN. Es importante tener en cuenta que cada copia de una molécula de ADN dada de un organismo específico dará el mismo conjunto de fragmentos cuando se digiera con una enzima en particular.

El ADN de diferentes organismos, en general, dará diferentes conjuntos de fragmentos cuando se trata con la misma enzima. Al digerir el ADN genómico complejo de un organismo, es posible dividir de manera reproducible su genoma en una gran cantidad de pequeños fragmentos, cada uno aproximadamente del tamaño de un solo gen. Algunas enzimas cortan directamente a través del ADN para dar extremos lisos o romos.

Otras enzimas de restricción hacen cortes escalonados de una sola hebra, produciendo proyecciones cortas de una sola hebra en cada extremo del ADN digerido. Estos extremos no solo son idénticos sino complementarios y se emparejarán entre sí; por lo tanto, se conocen como extremos cohesivos o pegajosos. Además, la proyección del extremo 5 & # 8242 del ADN siempre retiene los grupos fosfato.

Se han caracterizado más de 500 enzimas de restricción, que reconocen más de 200 sitios diferentes. La elección de qué enzima utilizar depende de varios factores. Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de 6 pb ocurrirá, en promedio, cada 4096 (4 6) bases, asumiendo una secuencia aleatoria de cada una de las cuatro bases.

Esto significa que la digestión del ADN genómico con EcoRI, que reconoce la secuencia 5 & # 8242-GAATTC-3 & # 8242, producirá fragmentos cada uno de los cuales tiene, en promedio, algo más de 4 kb. Las enzimas con secuencias de reconocimiento de 8 pb producen fragmentos mucho más largos. Por lo tanto, los genomas muy grandes, como el ADN humano, generalmente se digieren con enzimas que producen fragmentos de ADN largos. Esto hace que los pasos posteriores sean más manejables, ya que es necesario clonar y analizar posteriormente un número menor de esos fragmentos.

Ligadura de moléculas de ADN:

Los productos de ADN que resultan de la digestión por restricción para formar extremos pegajosos pueden unirse a cualquier otro fragmento de ADN tratado con la misma enzima de restricción. Por tanto, cuando los dos conjuntos de fragmentos se mezclan, el apareamiento de bases entre los extremos pegajosos dará como resultado el apareamiento de fragmentos que se derivaron de diferentes ADN de partida. Por supuesto, también habrá un apareamiento de fragmentos derivados de las mismas moléculas de ADN de partida, lo que se denomina reasociación.

Todos estos emparejamientos son transitorios, debido a la debilidad del enlace de hidrógeno entre las pocas bases en los extremos pegajosos, pero pueden estabilizarse mediante el uso de una enzima, ADN ligasa, en un proceso denominado ligadura. Esta enzima, generalmente aislada del bacteriófago T4 y llamada ADN ligasa T4, forma un enlace covalente entre el 5 & # 8242-fosfato al final de una hebra y el 3 & # 8242-hidroxilo de la hebra adyacente.

La reacción que depende de ATP se lleva a cabo a menudo a 10 ° C para disminuir la energía cinética de las moléculas y así reducir las posibilidades de que los extremos pegajosos emparejados con bases se separen antes de que se hayan estabilizado mediante ligación. Sin embargo, se necesitan tiempos de reacción prolongados para compensar la baja actividad de la ADN ligasa en el frío. También es posible unir extremos romos de moléculas de ADN, aunque la eficiencia de esta reacción es mucho menor que en las ligaciones de extremos pegajosos.

Dado que la ligación reconstruye el sitio de escisión, las moléculas recombinantes producidas por ligación de extremos pegajosos se pueden escindir nuevamente en las & # 8216uniones & # 8217, usando la misma enzima de restricción que se usó para generar los fragmentos inicialmente. Para propagar el ADN digerido de un organismo es necesario unir o ligar ese ADN con una molécula portadora de ADN especializada denominada vector.

Cada fragmento de ADN se inserta mediante ligación en la molécula de ADN del vector, lo que permite que el ADN recombinante completo se replique indefinidamente dentro de las células microbianas. De esta manera, se puede clonar un fragmento de ADN para proporcionar material suficiente para un análisis más detallado o para manipulaciones adicionales. Por lo tanto, todo el ADN extraído de un organismo y digerido con una enzima de restricción dará como resultado una colección de clones. Esta colección de clones se conoce como biblioteca de genes.

Bibliotecas genómicas:

Cualquier gen en particular constituye solo una pequeña parte del genoma de un organismo. Por ejemplo, si el organismo es un mamífero cuyo genoma completo abarca unos 106 kpb y el gen es de 10 kpb, entonces el gen representa solo el 0,001% del ADN nuclear total. No es práctico intentar recuperar secuencias tan raras directamente del ADN nuclear aislado debido a la abrumadora cantidad de secuencias de ADN extrañas.

En cambio, se prepara una biblioteca genómica aislando el ADN total del organismo, digiriéndolo en fragmentos de tamaño adecuado y clonando los fragmentos en un vector apropiado. Este enfoque se llama clonación de escopeta porque la estrategia no tiene forma de apuntar a un gen en particular, sino que busca clonar todos los genes del organismo a la vez.

La intención es que al menos un clon recombinante contenga al menos parte del gen de interés. Esto se puede lograr mediante digestión de restricción parcial con una enzima que reconoce secuencias de tetranucleótidos. La digestión completa con dicha enzima produciría una gran cantidad de fragmentos muy cortos, pero, si se permite que la enzima escinda solo algunos de sus posibles sitios de restricción antes de que se detenga la reacción, cada molécula de ADN se cortará en fragmentos relativamente grandes.

El tamaño medio de los fragmentos dependerá de las concentraciones relativas de ADN y enzima de restricción y, en particular, de las condiciones y duraciones de la incubación. También es posible producir fragmentos de ADN mediante cizallamiento físico, aunque es posible que sea necesario reparar los extremos de los fragmentos para que queden al ras. Esto se logra mediante el uso de una ADN polimerasa modificada denominada polimerasa de Klenow.

Esta se prepara por escisión de la ADN polimerasa con subtilización, dando un gran fragmento de enzima que no tiene actividad exonucleasa 5 & # 8217 → 3 & # 8242, pero que todavía actúa como polimerasa 5 & # 8217 → 3 & # 8242. Usando los dNTP apropiados, esto llenará cualquier extremo rebajado 3 & # 8242 en el ADN cortado. La mezcla de fragmentos de ADN se liga luego con un vector y posteriormente se clona.

Si se producen suficientes clones, habrá una probabilidad muy alta de que cualquier fragmento de ADN particular, como un gen, esté presente en al menos uno de los clones. Para mantener el número de clones en un tamaño manejable, se necesitan fragmentos de aproximadamente 10 kb de longitud para las bibliotecas de procariotas, pero la longitud debe aumentarse a aproximadamente 40 kb para las bibliotecas de mammalismo.

Se han preparado bibliotecas genómicas a partir de cientos de especies diferentes. Se deben crear muchos clones para estar seguro de que la biblioteca genómica contiene el gen de interés. La probabilidad, P, de que cierto número de clones, N, contenga un fragmento particular que represente una fracción, f, del genoma es

Por ejemplo, si la biblioteca consta de fragmentos de 10 kpb del genoma de E. coli (4640 kpb en total), se deben cribar más de 2000 clones individuales para tener una probabilidad del 99% (P = 0,99) de encontrar un fragmento particular. Dado que / = 10/4640 = 0.0022 y P & # 8211 0.99, N = 2093. Para una probabilidad del 99% de encontrar una secuencia particular dentro del genoma humano de 3 x 10 6 kpb, N sería igual a casi 1.4 millones si los fragmentos clonados promedian 10 kbp de tamaño. La necesidad de vectores de clonación capaces de transportar insertos de ADN muy grandes se hace evidente a partir de estos números.

Bibliotecas combinatorias:

El reconocimiento y la unión específicos de otras moléculas es una característica definitoria de cualquier proteína o ácido nucleico. A menudo, se desconocen los ligandos diana de una proteína particular o, en otros casos, se puede buscar un ligando único para una proteína conocida con la esperanza de bloquear la actividad de la proteína o perturbar su función.

Las bibliotecas combinatorias son el producto de estrategias emergentes para facilitar la identificación y caracterización de posibles ligandos para una proteína. Estas estrategias también son aplicables al estudio de los ácidos nucleicos. A diferencia de las bibliotecas genómicas, las bibliotecas combinatorias consisten en oligómeros sintéticos. Las matrices de oligonucleótidos sintéticos impresos como pequeños puntos sobre soportes sólidos en miniatura se conocen como chips de ADN.

Específicamente, las bibliotecas combinatorias contienen un gran número de moléculas sintetizadas químicamente (como péptidos u oligonucleótidos) con secuencias o estructuras aleatorias. Dichas bibliotecas se diseñan y construyen con la esperanza de que una molécula entre un gran número sea reconocida como ligando por la proteína (o ácido nucleico) de interés.

Si es así, tal vez esa molécula sea útil en una aplicación farmacéutica, por ejemplo, como fármaco para tratar una enfermedad que involucra a la proteína a la que se une. Un ejemplo de esta estrategia es la preparación de una biblioteca combinatoria sintética de hexapéptidos. El número máximo de combinaciones de secuencias para hexapéptidos es 20 6 o 64 000 000.

Un enfoque para simplificar la preparación y las posibilidades de selección de una biblioteca de este tipo es especificar los dos primeros aminoácidos en el hexapéptido, mientras que los cuatro siguientes se eligen al azar. En este enfoque, se sintetizan 400 bibliotecas (20 2), cada una de las cuales es única en términos de aminoácidos en las posiciones 1 y 2, pero aleatoria en las otras cuatro posiciones (como en AAXXXX, ACXXXX, ADXXXX, etc.) de modo que cada una de las 400 bibliotecas contiene 20 4 o 1 60 000 combinaciones de secuencias diferentes.

El cribado de estas bibliotecas con la proteína de interés revela cuál de las 400 bibliotecas contiene un ligando con alta afinidad. Luego, esta biblioteca se expande sistemáticamente especificando los primeros 3 aminoácidos (sabiendo de las bibliotecas elegidas 1 de 400 qué aminoácidos son mejores que los primeros 2), solo se fabrican 20 bibliotecas sintéticas (cada una de las cuales contiene 20 3 u 8000 hexapéptidos). (una para cada posibilidad de tercera posición, las tres posiciones restantes son aleatorias).

La selección para la unión del ligando, de nuevo con la proteína de interés, revela lo mejor de estas 20, y esta biblioteca en particular luego se varía sistemáticamente en la cuarta posición, creando 20 bibliotecas más (cada una de las cuales contiene 20 2 o 400 hexapéptidos). Este ciclo de síntesis, cribado y selección se repite hasta que las seis posiciones del hexapéptido se optimizan para crear el mejor ligando para la proteína.

Una variación de esta estrategia básica utilizando oligonucleótidos sintéticos en lugar de péptidos identificó un único 15-mer (secuencia GGTTGGTGTGGTTGG) con alta afinidad (KD = 2,7 nM) hacia la trombina, una serina proteasa en la vía de coagulación sanguínea. La trombina es un objetivo importante para la prevención farmacológica de la formación de coágulos en la trombosis coronaria.

Bibliotecas de cribado:

Un método común de cribado de bibliotecas genómicas basadas en plásmidos es realizar un experimento de hibridación de colonias. El protocolo es similar para las bibliotecas basadas en fagos, excepto que se examinan las placas de bacteriófagos, no las colonias bacterianas. En un experimento típico, las bacterias hospedadoras que contienen una biblioteca basada en plásmidos o bacteriófagos se colocan en placas en una placa de Petri y se dejan crecer durante la noche para formar colonias (o en el caso de bibliotecas de fagos, placas) (Fig 4.10).

Luego se obtiene una réplica de las colonias bacterianas (o placas) superponiendo la placa con un disco de nitrocelulosa. El disco se retira, se trata con álcali para disociar los dúplex de ADN unidos en ADN monocatenario, se seca y se coloca en una bolsa sellada con una sonda etiquetada. Si el ADN de la sonda es ADN dúplex, debe desnaturalizarse calentándolo a 70 ° C.

Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN diana deben estar en una forma monocatenaria si se van a hibridar entre sí. Cualquier secuencia de ADN complementaria al ADN de la sonda se revelará mediante autorradiografía del disco de nitrocelulosa. Las colonias bacterianas (placas de fagos) que contienen clones que llevan ADN diana se identifican en la película y se pueden recuperar de la placa maestra.

Sondas para la hibridación del sur:

Claramente, las sondas específicas son reactivos esenciales si el objetivo es identificar un gen particular en un contexto de innumerables secuencias de ADN. Normalmente, las sondas que se utilizan para cribar bibliotecas son secuencias de nucleótidos que son complementarias a alguna parte del gen diana. Para hacer sondas útiles se requiere cierta información sobre la secuencia de nucleótidos del gen.

A veces, esta información está disponible. Alternativamente, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen, es posible trabajar hacia atrás a través del código genético hasta la secuencia de ADN (fig. 4.11). Debido a que el código genético está degenerado (es decir, varios codones pueden especificar el mismo aminoácido), las sondas diseñadas por este enfoque son generalmente oligonucleótidos degenerados de aproximadamente 17 a 50 residuos de longitud (tales oligonucleótidos se denominan de 17 a 50 meros).

Los oligonucleótidos se sintetizan de modo que se incorporen diferentes bases en los sitios donde se producen degeneraciones en los codones. Por tanto, la preparación final consiste en una mezcla de oligonucleótidos de igual longitud cuyas secuencias varían para adaptarse a las degeneraciones. Presumiblemente, una secuencia de oligonucleótidos en la mezcla se hibridará con el gen diana. Estas sondas de oligonucleótidos son al menos 17-meros porque los oligonucleótidos degenerados más cortos podrían hibridar con secuencias no relacionadas con la secuencia diana.

Un fragmento de ADN del gen correspondiente en un organismo relacionado también se puede utilizar como sonda en el cribado de una biblioteca para un gen particular. Estas sondas se denominan sondas heterólogas porque no se derivan del organismo homólogo (el mismo). Surgen problemas si un gen eucariota completo es el objetivo de clonación. Los genes eucariotas pueden tener decenas o incluso cientos de pares de kilo-bases de tamaño.

Los genes de este tamaño están fragmentados en la mayoría de los procedimientos de clonación. Por tanto, el ADN identificado por la sonda puede representar un clon que lleva solo una parte del gen deseado. Sin embargo, la mayoría de las estrategias de clonación se basan en una digestión parcial del ADN genómico, una técnica que genera un conjunto superpuesto de fragmentos genómicos.

Siendo esto así, los segmentos de ADN de los extremos del clon identificado ahora pueden usarse para sondear la biblioteca en busca de clones que lleven secuencias de ADN que flanquean el aislado original en el genoma. La repetición de este proceso finalmente produce el gen completo entre un subconjunto de clones superpuestos.

Bibliotecas de ADNc:

Los ADNc son moléculas de ADN copiadas de moldes de ARNm. Las bibliotecas de ADNc se construyen sintetizando ADNc a partir de ARNm celular purificado. Estas bibliotecas presentan una estrategia alternativa para el aislamiento de genes, especialmente genes eucariotas. Debido a que la mayoría de los ARNm eucariotas portan colas 3 & # 8242-poli (A), el ARNm puede aislarse selectivamente de preparaciones de ARN celular total mediante cromatografía de oligo (dT) -celulosa (fig. 4.12). Las copias de ADN de los ARNm purificados se sintetizan hibridando primero cadenas cortas de oligo (dT) con las colas poli (A).

Estas cadenas de oligo (dT) sirven como cebadores para la síntesis de ADN impulsada por transcriptasa inversa (fig. 4.13). (Los oligonucleótidos aleatorios también se pueden usar como cebadores, con las ventajas de una menor dependencia de los tractos poli (A) y una mayor probabilidad de crear clones que representen los extremos 5 & # 8242 de los ARNm). La transcriptasa inversa es una enzima que sintetiza una hebra de ADN, copiando ARN como plantilla. La ADN polimerasa se usa luego para copiar la cadena de ADN y formar una molécula de doble cadena (ADN dúplex).

La ligación de fragmentos de ADN de extremos romos no es tan eficaz como la ligación de extremos pegajosos, por lo tanto, con moléculas de ADNc se llevan a cabo procedimientos adicionales antes de la ligación con vectores de clonación. Un método consiste en añadir moléculas pequeñas de ADNc de doble hebra con un sitio interno para una endonucleasa de restricción, que se denominan enlazadores de ácido nucleico. Numerosos enlazadores están disponibles comercialmente con restricción interna para muchas de las enzimas de restricción más comúnmente utilizadas.

Los enlazadores se ligan al ADNc en los extremos romos, pero dado que se añaden mucho más que el ADNc, el proceso de ligación es razonablemente satisfactorio. Posteriormente, los enlazadores se digieren con la enzima de restricción apropiada, que proporciona los extremos pegajosos para una unión eficaz a un vector digerido con la misma enzima. Este proceso puede facilitarse mediante la adición de adaptadores en lugar de enlazadores, que son idénticos excepto que se realizan los extremos pegajosos y, por lo tanto, no hay necesidad de digestión de restricción después de la ligadura.

Por lo tanto, por último, se añaden enlazadores a los dúplex de ADN generados a partir de las plantillas de ARNm, y el ADNc se clona en un vector adecuado. Una vez que se ha identificado un ADNc derivado de un gen particular, el ADNc se convierte en una sonda eficaz para seleccionar bibliotecas genómicas para el aislamiento del propio gen.

Debido a que diferentes tipos de células en organismos eucariotas expresan subconjuntos seleccionados de genes, las preparaciones de ARN de células o tejidos en los que se transcriben selectivamente genes de interés se enriquecen para los ARNm deseados. Las bibliotecas de ADNc preparadas a partir de dicho ARNm son representativas del patrón y el grado de expresión génica que definen de forma única tipos particulares de células diferenciadas.

Las bibliotecas de ADNc de muchos tipos de células humanas normales y enfermas están disponibles comercialmente, incluidas las bibliotecas de ADNc de muchas células tumorales. La comparación de bibliotecas de ADNc normales y anormales, junto con el análisis electroforético en gel bidimensional de las proteínas producidas en células normales y anormales, es una nueva estrategia prometedora en la medicina clínica para comprender los mecanismos de la enfermedad.


¿Cómo aislar el ADN? (Con Protocolos) | Biotecnología

En este artículo discutiremos sobre el aislamiento de ADN con su protocolo. Aprenda a aislar: 1. ADN plasmídico 2. ADN genómico bacteriano 3. ADN genómico de levadura 4. ADN genómico de la sangre 5. ADN de células animales 6. ADN genómico de tejidos eucariotas 7. ADN vegetal mediante el método de extracción CTAB 8. Cloroplasto ADN 9. ADN mitocondrial.

  1. ¿Cómo aislar el ADN plasmídico?
  2. ¿Cómo aislar el ADN genómico bacteriano?
  3. ¿Cómo aislar el ADN genómico de levadura?
  4. ¿Cómo aislar el ADN genómico de la sangre?
  5. ¿Cómo aislar el ADN de las células animales?
  6. ¿Cómo aislar el ADN genómico de los tejidos eucariotas?
  7. ¿Cómo aislar el ADN vegetal mediante el método de extracción CTAB?
  8. ¿Cómo aislar el ADN del cloroplasto?
  9. ¿Cómo aislar el ADN mitocondrial?

Cohen y Boyer (1973) llevaron a cabo el primer experimento de clonación. Aprovecharon dos novedades. Uno fue el aislamiento de enzimas conocidas como enzimas de restricción que podían cortar el ADN en ubicaciones específicas y predecibles.

El segundo fue la capacidad de unir moléculas individuales resultantes de la digestión por restricción utilizando la enzima ligasa. Por tanto, un segmento de ADN genómico podría insertarse en un ADN extracromosómico autorreplicante de una bacteria y podría usarse para hacer crecer muchas copias o clones del segmento de ADN genómico clonado.

El aislamiento de ADN plasmídico de E. coli es el procedimiento más común y rutinario en los laboratorios de investigación. Los plásmidos son moléculas de ADN circular de doble hebra que tienen la propiedad de autorreplicarse, independientemente del ADN cromosómico bacteriano.

Aunque la presencia de un plásmido en una célula bacteriana se detecta genéticamente como un cambio en el fenotipo de la bacteria, a menudo es necesario aislar el ADN del plásmido para estudios moleculares como determinación del tamaño, mapeo de enzimas de restricción, secuenciación de nucleótidos o para la construcción de un nuevo híbrido. plásmidos, PCR, expresión de proteínas, transfección y terapia génica.

El ADN plasmídico de las bacterias son moléculas circulares cerradas de ADN bicatenario que varían en tamaño desde 1 kb hasta más de 200 kb. Se encuentran en bacterias como unidades hereditarias adicionales y se replican independientemente del cromosoma bacteriano.

Sin embargo, los plásmidos dependen de enzimas y proteínas de su anfitrión para su transcripción y replicación exitosas. Los plásmidos son útiles para las células bacterianas porque pueden portar genes que codifican enzimas que pueden estar involucradas en la resistencia a antibióticos, toxinas en condiciones ambientales no ideales o producción de toxinas dentro de la propia bacteria.

Hay muchos métodos disponibles para aislar plásmidos de bacterias. El procedimiento más practicado es la lisis alcalina de células. Este protocolo a menudo se denomina & # 8216mini-prep & # 8217, y produce ADN bastante limpio, rápida y fácilmente.

1. Inocular las colonias bacterianas (preferiblemente una sola colonia de una placa bacteriana) utilizando un asa estéril en 5 ml de caldo nutritivo (caldo Luria-Bertani o medio (LB)) con ampicilina o cualquier otro antibiótico apropiado y cultivar durante la noche, agitando vigorosamente (180 rpm) a 37 ° C.

2. Centrifugue el cultivo tomado en microtubos usando una microcentrífuga durante 1 minuto a 10,000 rpm. Retirar el sobrenadante y escurrir los tubos brevemente sobre una toalla de papel.

3. Repita el paso 2 con el mismo tubo, llenando de nuevo el tubo con más cultivo bacteriano.

4. Añada 0,2 ml de Solución I helada al sedimento bacteriano y vuelva a suspender las células tanto como sea posible utilizando una micropunta desechable o un asa de inoculación.

5. Añada 0,4 ml de Solución II, tape los tubos e invierta varias veces suavemente. Mantenga los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos.

6. Añada 0,3 ml de Solución III helada e invierta los tubos varias veces con suavidad. Incubar los tubos en hielo durante 10 minutos.

7. Centrifugue los tubos durante 5 minutos a 10.000 rpm en una microcentrífuga y transfiera el sobrenadante a tubos nuevos. Trate de evitar tomar cualquier precipitado blanco durante la transferencia. Es mejor dejar un poco de sobrenadante para evitar tomar accidentalmente el precipitado.

8. Añada 1,0 ml de isopropanol a los tubos de microcentrífuga y déjelo a temperatura ambiente durante 2 minutos.

9. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2-5 minutos. Desechar el líquido sobrenadante y escurrir los tubos sobre una toalla de papel.

10. Agregue 1 ml de etanol al 70% helado. Mezclar invirtiendo varias veces. Centrifugue los tubos durante 1 minuto a 10.000 rpm. Desechar el sobrenadante y escurrir los tubos sobre una toalla de papel.

11. Deje que los tubos se sequen durante 5 minutos. Agregue 50 μI de TE a los tubos y disuelva el ADN plasmídico.

I. Se requiere antibiótico para proporcionar una presión selectiva para mantener el plásmido dentro de las células bacterianas. Sin esta presión selectiva, las bacterias tienden a perder el plásmido y no replican el plásmido extracromosómico si no es & # 8216 necesario & # 8217.

ii. El método incluye pasos (paso 3 del protocolo) para aumentar el volumen inicial de células de modo que se pueda aislar más ADN plasmídico en una sola preparación.

iii. La solución I contiene glucosa, Tris y EDTA. Se agrega glucosa para aumentar la presión osmótica fuera de las células. Tris es un agente tampón que se usa para mantener un pH constante (8.0). El EDTA protege el ADN de las enzimas degradantes (DNasas). El EDTA se une a los cationes divalentes que son necesarios para la actividad DNasa.

iv. La Solución II contiene hidróxido de sodio (NaOH) y dodecilsulfato de sodio (detergente SDS). La mezcla alcalina rompe las células y el detergente rompe la membrana lipídica y solubiliza las proteínas celulares. El NaOH también desnaturaliza el ADN en hebras simples.

v. La solución III contiene una mezcla de ácido acético y acetato de potasio. El ácido acético neutraliza el pH, permitiendo la renaturalización de las cadenas de ADN. El acetato de potasio precipita el SDS de la solución junto con los restos celulares. El ADN cromosómico de E. coli, una maraña parcialmente renaturalizada en este paso, queda atrapado en el precipitado. El ADN plasmídico permanece en solución.

vi. El paso de fraccionamiento (paso 7 del protocolo) separa el ADN plasmídico de los restos celulares y el ADN cromosómico en el sedimento.

vii. El isopropanol precipita eficazmente los ácidos nucleicos, pero es mucho menos eficaz con las proteínas. Por tanto, una precipitación rápida puede purificar el ADN de las proteínas contaminantes.

viii. El último paso de fraccionamiento purifica aún más el ADN plasmídico de los contaminantes.

ix. El etanol ayuda a eliminar las sales restantes y el SDS de la preparación.

Disuelva 100 g de glucosa (dextrosa) en 150 ml de agua destilada. Preparar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave.

Tris-HCl 1 M pH 8.0 (500 ml):

Disolver 60,55 g de Tris en 400 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.5 con HCl concentrado. Completar el volumen a 500 ml.

EDTA 0,5 M pH 8,0 (100 ml):

Disolver 16,8 g de sal disódica anhidra de EDTA en 70 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 8.0 usando gránulos de NaOH. Más EDTA se disolverá a medida que el pH se acerque a 8.0. Completar el volumen a 100 ml y esterilizar en autoclave.

Disuelva 10 g en 100 ml de agua destilada. Calentar suavemente para que el SDS se disuelva.

Hidróxido de sodio 1 N (100 ml):

Disuelva 4 g en 100 ml de agua destilada.

Acetato de potasio 5 M (500 ml):

Disuelva 245,5 g en 400 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 5,5 con ácido acético glacial. Completar el volumen a 500 ml.

El aislamiento de ADN de bacterias es un proceso relativamente simple. El organismo que se va a utilizar debe cultivarse en un medio favorable a una temperatura óptima, y ​​debe recolectarse en la fase & # 8216late log & # 8217 a & # 8216primer estacionaria & # 8217 para obtener el máximo rendimiento.

A continuación, se pueden lisar las células y aislar el ADN. Después de la lisis, los constituyentes celulares se eliminan selectivamente. Una vez que esto se logra, el ADN puede precipitarse de la solución con alcohol y disolverse en un tampón apropiado.

La lisis de las bacterias se inicia resuspendiendo el sedimento bacteriano en un tampón que contiene lisozima y EDTA. The EDTA disrupts the outer membrane of the gram-negative envelope by removing the Mg 2+ from the lipopolysaccharide layer and additionally inhibits DNases.

This allows the lysozyme access to the peptidoglycan. After partial disruption of the peptidoglycan by the enzyme, a detergent such as SDS is added to lyse the cells. Most gram-negative cells are lysed after this treatment and many can even be lysed without lysozyme. Once the cells are lysed, the solution should be treated gently to prevent breakage of the DNA strands.

Subsequent steps involve the separation of the DNA from other macromolecules in the lysate. Both phenol (that has been equilibrated with Tris buffer) and chloroform (with isoamyl alcohol as a de-foaming agent) are commonly used to dissociate protein from nucleic acids.

These reagents also remove lipids and some polysaccharides. Proteolytic enzymes such as pronase or proteinase K are often added to further remove protein. Proteinase K is a particularly useful enzyme it is not denatured by SDS and in fact works more effectively in the presence of SDS.

The nucleic acids (including RNA) may then be precipitated in ice cold ethanol if the ionic strength of the solution is high. This is followed by RNase treatment to degrade the RNA. The solution may then be re-precipitated with ethanol.

In this precipitation, the ribonucleotides from RNase treatment will remain in solution leaving purified DNA in the pellet. The pellet can then be dissolved in an appropriate buffer.

Alcohol precipitations of DNA and RNA are widely used in molecular biology and are valuable because they allow the nucleic acids to be concentrated by removing them from solution as an insoluble pellet.

If concentrations of DNA are relatively high (> 1 μg/ml) DNA can be effectively precipitated in 10-15 minutes by shielding the negative charge with monovalent cations (0.3 M sodium or 2.5 M ammonium ions are commonly used) followed by the addition of 2 volumes of 95% ethanol.

A major consideration in any DNA isolation procedure is the inhibition or inactivation of DNases which can hydrolyze DNA. The buffer in which the cells are suspended should have a high pH (8.0 or greater) which is above the optimum of most DNases.

EDTA is also included in the re-suspension buffer to chelate divalent cations (such as Mg 2+ ) which are required by DNases. The SDS also reduces DNase activity by denaturing these enzymes.

DNase activity is further controlled by keeping cells and reagents cold, using proteolytic enzymes such as pronase or proteinase K, and a heating step that will thermally denature DNase (but not hot enough to denature the DNA).

The procedure used here is useful for isolating DNA from a large variety of gram negative bacteria. It yields partially purified DNA of sufficient quality for most techniques, such as restriction digestion, ligation and cloning.

Further purification by additional solvent extraction may be required for experiments needing purer DNA (example – physical and chemical studies, such as melting curves).

1. Grow cells overnight in nutrient rich broth (LB broth).

2. Transfer 1.5 ml of culture to a micro-centrifuge tube and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes. Collect the pellet and repeat with another 1.5 ml of culture containing cells. Drain the tubes on a paper towel briefly.

3. Re-suspend the pellet in 450 μl of TE buffer.

4. Add 45 μl of 10% SDS and 5 μl of 20 mg/ml proteinase K, mix and incubate for 1 hour at 37°C.

5. Add 500 μl phenol-chloroform and mix well by inverting the tube until the phases are completely mixed.

6. Centrifuge the mixture at 10,000 rpm in a microfuge for 2 minutes.

7. Transfer the upper aqueous phase to a new tube and re-extract by adding an equal volume (about 500 μl) of phenol-chloroform. Again centrifuge the mixture at 10,000 rpm in a microfuge for 5 minutes. Transfer the upper aqueous phase to a new tube.

8. Add 50 μl of sodium acetate and mix.

9. Add 300 μl of isopropanol and mix gently to precipitate the DNA.

10. Spool out the DNA with the help of an inoculation loop (or centrifuge at 10,000 rpm for 2-5 minutes).

11. Wash the DNA by dipping the end of the loop into 1 ml of 70% ethanol for 30 seconds and centrifuge briefly (or add 1 ml of 70% ethanol. Mix by inverting several times. Drain the tubes on a paper towel).

12. Re-suspend the DNA in 100-200 μl TE buffer (complete re-suspension may take several days).

13. Keep the DNA at 4°C for short-term and –20°C or –80°C for long-term storage.

Preparation of Solutions:

Dissolve 10 g SDS in 100 ml of distilled water. Heat gently to get SDS into solution.

Dissolve 20 mg proteinase K in 1 ml of distilled water.

Mix 50 ml of buffered phenol with 50 ml of chloroform.

3 M Sodium Acetate pH 5.2 (500 ml):

Dissolve 123 g in 450 ml of distilled water. Adjust the pH to 5.2 with glacial acetic acid. Make up to 500 ml.

The yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a simple eukaryotic organism well suited as a tool for analysis of mammalian gene regulation. Development of yeast artificial chromosomes (YACs) greatly facilitated analysis of complex mammalian genetic loci by allowing cloning, maintenance, and manipulation of large stretches of exogenous DNA in yeast.

More recently, YACs have been used to generate transgenic mice. Introduction of mutations into YACs by homologous recombination coupled with the ability to produce transgenics provided a system to analyze the effect of the mutation in the context of the whole locus within an animal model.

1. Grow yeast in 100 ml culture medium for 8 hours.

2. Centrifuge the culture at 3000 rpm for 3 minutes.

3. Re-suspend the cells in 6 ml of distilled water. Aliquot into 1.5 ml microfuge tubes. Cen­trifuge at 3000 rpm for 3 minutes. Remove the supernatant.

4. Add 200 μl of isolation medium, 200 μl of phenol-chloroform and 0.3 g acid washed glass beads. Vortex for 2 minutes.

5. Add 200 μl TE pH 8.0 and centrifuge at 10,000 rpm for 5 minutes.

6. Preserve the supernatant and add 1 ml of 100% ethanol mix by inversion. Centrifuge for 2 minutes at 10,000 rpm, remove the supernatant.

7. Reconstitute the pellet in 400 μl of TE pH 8.0 with 30 μg/ml RNase-A.

8. Incubate for 5 minutes at 37°C add 40 μl 5M sodium acetate and 1ml ethanol and store at -20°C for a few hours.

9. Centrifuge for 10 minutes at 10,000 rpm and dissolve the DNA pellet in 25-50 μl of TE buffer.

Dissolve in 100 ml distilled water.

Add a pinch of streptomycin to the culture medium after sterilization.

Saboured dextrose broth or yeast peptone dextrose broth can also be used.

Blood contain a number of enzyme inhibitors that can interfere with isolation of DNA. Common anticoagulants such as heparin and EDTA can also interfere in DNA isolation. Erythrocytes (RBCs) from birds, fish and frogs contain nuclei and hence have genomic DNA, while those from mammals do not have nuclei.

Healthy mammalian blood contains approximately 1000 times more RBC- than WBC-containing nuclei—comprising leukocytes, lymphocytes, monocytes and granulocytes.

So it is better to remove all RBCs prior to DNA isolation to obtain higher yields. Selective lysis of erythrocytes using hypotonic solutions easily removes RBCs which are more susceptible to hypotonic buffers than WBCs. Alternatively Ficoll density-gradient centrifugation can be performed to recover mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) and remove RBCs.

Cells without cell walls, like animal cells including blood cells, can be lysed efficiently by chemical or physical means. A common chemical method is to use a detergent to lyse the cells.

A detergent applied to cells will dissolve the fatty and proteinaceous cell membrane, so that the cells are lysed. A simple physical method for lysing cells is boiling. This also disrupts the cell membrane, lysing the cells.

The samples stored in deep freezers in EDTA vacutainer tubes are thawed, standard citrate buffer is added, mixed, and the tubes are centrifuged. The top portion of the supernatant is discarded and additional buffer is added, mixed, and the tube is again centrifuged. After the supernatant is discarded, the pellet is re-suspended in a solution of SDS detergent and proteinase K, and the mixture is incubated at 55°C for one hour.

The sample then is phenol extracted once with a phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution, and after centrifugation the aqueous layer is removed to a fresh micro-centrifuge tube.

The DNA is ethanol precipitated, re-suspended in buffer, and then ethanol precipitated a second time. The pellet is dried, buffer is added and the DNA is re-suspended by incubation at 55°C overnight.

1. Add 0.8 ml of IX SSC buffer to 1 ml of sample, and mix.

2. Centrifuge for 1 minute at 12,000 rpm in a microfuge and discard 1 ml of supernatant.

3. Add 1 ml of IX SSC buffer again, vortex, and centrifuge at 12,000 rpm for 1 minute, and remove all of the supernatant.

4. Add 370 μl of 0.2 M sodium acetate to each pellet and mix by inverting the tubes briefly.

5. Add 25 μl of 10% SDS and 5 μl of proteinase K (20 mg/ml), mix by inverting the tubes briefly and incubate for 1 hour at 55°C.

6. Add 100 μl phenol-chloroform-isoamyl alcohol and mix for 30 seconds.

7. Centrifuge for 2 minutes at 12,000 rpm in a micro-centrifuge tube.

8. Collect the aqueous layer (top layer) carefully in a new micro-centrifuge tube, add 1 ml of cold 100% ethanol, mix, and incubate for 15 minutes at -20°C.

9. Centrifuge for 2 minutes at 12,000 rpm in a micro-centrifuge. Remove the supernatant and drain the tubes.

10. Add 180 μl 1X TE buffer, vortex, and incubate at 55°C for 10 minutes.

11. Add 20 μl 2 M sodium acetate and mix.

12. Add 500 μl of cold 100% ethanol, mix. Centrifuge for 1 minute at 12,000 rpm in a micro centrifuge.

13. Decant the supernatant and rinse the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge for 1 minute at 12,000 rpm in a micro-centrifuge.

14. Decant the supernatant, and dry the pellet in a Speed-Vac for 10 minutes, or until dry at room temperature.

15. Re-suspend the pellet by adding 200 μl of 1X TE buffer. Incubate overnight at 55°C, vortexing periodically to dissolve the genomic DNA.

16. Store the samples at -20°C.

Dissolve in 80 ml distilled water. Adjust the pH to 7.0 with concentrated HCl.

Make up the volume to 100 ml.

0.2 M Sodium Acetate (100 ml):

Dissolve 2.74 g sodium acetate in 80 ml distilled water.

Adjust the pH to 5.2 with glacial acetic acid.

Make up the volume to 100 ml

Dissolve 5 g in 50 ml distilled water.

Dissolve 20 mg in 1 ml distilled water.

To harvest, centrifuge cells from cell cultures, remove supernatant and then store the cells at -20°C or -80°C. These cells can be efficiently lysed using lysis buffer and proteinase K. Mechanical disruption using a homogenizer or mortar and pestle prior to lysis can reduce the lysis time.

1. Collect animal cells by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes at 4°C.

2. Re-suspend the cell pellet in cold cell lysis buffer (approximately 10 8 cells/ml).

3. Homogenize the cells in a glass homogenizer with a loose fitting pestle.

4. Centrifuge at 4000 rpm for 20 minutes at 4°C to pellet the nuclei.

5. Re-suspend the pellet in 8 ml of EDTA-NaCl, and add 0.8 ml of 10% or 1/10th the vol­ume of cell lysis buffer from step 2.

6. Mix briefly by vortexing.

7. Add 50 μl of the proteinase K solution (10 mg/ml stock) and incubate at 37°C for 3-5 hours.

8. Add 0.5 ml of 5 M sodium acetate (or potassium acetate) and 8 ml of phenol-chloro- form-isoamyl alcohol. Mix gently by inverting the tube for 1 minute.

9. Centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes at 4°C.

10. Collect the upper aqueous phase.

11. Add an equal volume of chloroform-isoamyl alcohol. Mix gently by inverting the tube for 1 minute.

12. Centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes at 4°C. Collect the upper aqueous phase.

13. Add 2 volumes of 100% ethanol to precipitate the DNA.

14. Spool out the DNA with the inoculation loop. Dissolve in 1 ml of TE buffer.

15. Add 100 μl of 20X SSC and 10 μl of DNase-free RNase-A. Incubate for 1 hour at 37°C.

16. Extract the solution two times with chloroform-isoamyl alcohol.

17. Precipitate the DNA by adding 2 volumes of 100% ethanol.

18. Centrifuge at 5,000 rpm for 5 minutes at 4°C.

19. Wash the DNA pellet with 70% ethanol. Air dry briefly.

20. Dissolve the DNA in 200 μl of TE buffer.

Note – Do not over-dry the DNA pellet. It will be very difficult to dissolve the DNA in TE buffer.

Freshly collected tissues can be stored immediately at -20°C or-80°C, or in liquid nitrogen. Animal and human tissues can also be fixed in alcohol and formalin. However, long term storage of tissues in formalin will result in chemical modification of DNA.

These tissues can be effectively lysed using lysis buffer and proteinase K. Fresh and frozen tissues can be cut into pieces to aid lysis. Skeletal muscle, heart and skin tissues have an abundance of contractile proteins, connective tissue and collagen and care should be taken to ensure complete digestion with proteinase K. The method is also suitable for insect tissues, prawn and fish samples, and a wide variety of eukaryotic tissues.

1. Mince the tissue quickly and freeze in liquid nitrogen.

2. Immediately grind with pre-chilled mortar and pestle to a fine powder. Suspend in 1 ml digestion buffer per 100 mg of tissue.

3. Incubate samples with occasional shaking, in tightly capped microtubes, 30 to 60 minutes at 50°C.

4. Extract samples with an equal volume of phenol-chloroform-isoamyl alcohol.

5. Centrifuge for 10 minutes at 2000 rpm.

6. If phases do not resolve well, add another volume digestion buffer, omitting proteinase K, and repeat centrifugation. (If thick white material appears at interface, repeat organic extraction).

7. Transfer top aqueous layer to a new tube.

8. Add 0.5 volume of 7.5 M ammonium acetate and 2 volumes of 100% ethanol.

9. Centrifuge for 2 minutes at 2000 rpm (optional: to prevent shearing of high molecular weight DNA, remove organic solvents and salt by two dialyses against 100 volume TE buffer for > 24 hours omit last step).

10. Wash with 70% ethanol, air dry, and re-suspend in TE buffer at 1mg/ml.

11. Remove residual RNA by adding 0.1% SDS and 1 μg/ml DNase-free RNase, incubating 1 hour at 37°C, and repeating ammonium acetate and ethanol precipitation of DNA and centrifugation.

Isolation of DNA from plant material presents special challenges and commonly used techniques often require adaptations before they can be used with plant samples. Several plant metabolites have chemical properties similar to those of nucleic acids, and are difficult to remove from DNA preparations.

Each plant is different and the cells of each kind of plant often contain special compounds, which must be extracted away from the DNA. Some plants, the cells of the tissue contain mucilage.

Mucilage is a very sticky, jelly-like substance whose function in the plant cells is not known for certain, but it is thought to act as antifreeze. Chemically, mucilage is a highly complex polysaccharide—very big, linear molecules, which have the ability to form large complexes with other large molecules such as DNA.

The mucilage is contained within the cytoplasm of the cell, while the DNA is contained within the nucleus (and within mitochondria and chloroplasts). To isolate DNA from the tissue of plants, the mucilage must be prevented from coming into contact with the DNA and complexing with it. In order to accomplish this, the DNA must remain within the nuclei while the mucilage is released from the cell and then poured off.

In this method the charged DNA molecules are initially dissolved in the polar salt-water CTAB solution. When this solution is mixed with chloroform, the non-polar compounds in the mixture dissolve into the chloroform layer, away from the aqueous DNA layer.

Subsequently, when the weakly polar isopropyl alcohol is added to the aqueous solution, the large negatively charged DNA molecules are no longer soluble in the solution, and they precipitate out as visible strands.

1. Chill a homogenizer with liquid nitrogen or dry ice.

2. Grind plant tissue to a fine powder using liquid nitrogen and transfer the frozen tissue to the tubes.

3. Add warm CTAB extraction buffer (maintained at 65°C) to the pulverized tissue and mix to wet thoroughly.

4. Incubate 10 to 60 minutes at 65°C with occasional mixing.

5. Extract the homogenate with an equal volume of chloroform-isoamyl alcohol. Mix well by inversion.

6. Centrifuge for 5 minutes at 8000 rpm at 4°C. Collect the upper aqueous phase.

7. Add 1/10 volume of CTAB-NaCl solution to the aqueous phase and mix well by inversion.

8. Extract with an equal volume of chloroform-isoamyl alcohol.

9. Mix, centrifuge and collect the upper phase.

10. Add 1 volume of CTAB precipitation solution.

11. Mix well by inversion. If precipitate is visible, proceed to next step. If not, incubate mix­ture for 30 minutes at 65°C.

12. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpm at 4°C.

13. Re-suspend the pellet in high-salt TE buffer. If the pellet is difficult to re-suspend, incu­bate 30 minutes at 65°C. Repeat until all or most of the pellet is dissolved (0.5 to 1 ml per gram of starting material).

14. Precipitate the nucleic acid by adding 0.6 volume isopropanol. Mix well.

15. Centrifuge for 15 minutes at 8000 rpm at 4°C.

16. Wash the pellet with 70% ethanol, dry, and re-suspend in a minimal volume of TE buffer.

17. Remove residual RNA by adding 0.1 % SDS and 1 μg/ml DNase-free RNase by incubating at 37°C for 1 hour.

18. Repeat CTAB-NaCl and ethanol precipitation of DNA.

Allow some time for the CTAB to dissolve and heat it to 65°C. The buffer is usually pH 8.0 with­out any adjustment. Do not autoclave CTAB buffer. Add 2-mercaptoethanol to the required amount of CTAB extraction buffer to give a final concentration of 2% (v/v).

In all terrestrial plants and algae, chloroplast DNA has been found to exist as single circular molecules ranging in molecular weight from 80 to 300 kb. The chloroplast genome is densely packed with genes and their functions are identified. They are involved in photosynthesis or occur as components of the chloroplast protein synthesizing system.

The physiological state of the starting leaf material is absolutely crucial to the success of a chloroplast DNA extraction. Wherever possible, only the freshest, youngest, and healthiest green leaves should be used.

It is far better to replant and wait for new growth than to extract from leaves that are beginning to yellow and senesce, or that have been stressed during growth, or that have wilted one or more times.

Some plants grown under high light intensities accumulate within their chloroplasts very high levels of starch that are very difficult to deplete, even by prolonged dark treatment.

This results in highly damaged chloroplasts and low DNA yields. In these cases the best solution is to grow the plants under moderate or low light intensities, example, under a greenhouse bench rather than on top of it.

If obtaining intact chloroplasts is difficult, incorporate 10%-25% (w/v) PEG 4000 in the homogenization buffer and all subsequent rinse buffers. Polyvinylpyrrolidone (PVP) at a concentration of 0.1% (w/v) in the homogenization buffer can also serve an effective adsorbent for tannins and other secondary plant compounds. Addition of 0.1% (w/v) antifoam to the homogenization buffer is useful with plant material that foams excessively during homogenization.

1. Keep the plants in the dark for 48 hours to reduce chloroplast starch levels.

2. Collect young and healthy leaves.

3. Wash leaves thoroughly in tap water and cool them to 0°C.

4. Place 1 g of leaves (cut into small pieces) in 4 ml of ice-cold isolation buffer.

5. Homogenize in a pre-chilled mortar and pestle for few minutes.

6. Filter the homogenate through dense nylon mesh (50 μM).

7. Centrifuge at 1000 rpm for 15 minutes at 4°C.

8. Collect the supernatant and re-centrifuge for 20 minutes at 4000 rpm.

9. Re-suspend the pellet in 400 μL wash buffer (for 1 g starting material) by vigorous swirl­ing of the tubes.

10. Centrifuge at 4000 rpm for 20 minutes. Collect the chloroplast pellet.

1. Re-suspend the chloroplast pellet in 1 ml of DNase-I buffer (for 10 g starting material).

2. Incubate on ice for 1 hour.

3. Add three volumes of wash buffer and centrifuge at 2500 rpm for 15 minutes at 4°C.

4. Re-suspend pellet in wash buffer. Repeat washing and centrifuging for two times.

5. After final wash re-suspend pellet in 0.1 to 2.0 ml of wash buffer.

6. Add one-tenth volume of pronase (10 mg/ml self-digested for 2 hours at 37°C) and incu­bate for 2 minutes at room temperature.

7. Gently add one-fifth volume of lysis buffer and mix by slowly inverting the tube several times over a period of 10-15 minutes at room temperature.

8. Remove residual starch and cell wall debris from the chloroplast lysate by centrifuging at 10,000 rpm for 10 minutes at room temperature.

9. Collect the supernatant. Mix intensely for 5 minutes with an equal volume of buffer equil­ibrated phenol.

10. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 rpm. Collect the upper aqueous phase.

11. Add equal volume of phenol-chloroform (1:1) and repeat step 10.

12. Collect the upper aqueous phase. Add equal volume of chloroform-isoamyl alcohol (24:1) and repeat the centrifugation step.

13. Precipitate the DNA with 1/10 volume of 5 M ammonium acetate and 1 volume of isopro­panol at -20°C for 2-3 hours or overnight.

14. Centrifuge for 3-5 minutes at 12,000 rpm.

15. Wash the pellet with 70% ethanol, air dry and dissolve in 20 μl of TE buffer.

Mitochondria Isolation:

1. Place 1 g of chilled leaves (cut into small pieces) or other tissues (animal origin) in 4 ml of ice-cold isolation buffer.

2. Homogenize in a pre-chilled mortar and pestle for few minutes.

3. Filter the homogenate through dense nylon mesh (50 μM).

4. Centrifuge at 1,000 rpm for 15 minutes at 4°C.

5. Collect the supernatant and re-centrifuge for 20 minutes at 4000 rpm.

6. Re-suspend the pellet in 400 μl rinse buffer (for 1 g starting material) by vigorous swirl­ing of the tubes.

7. Centrifuge at 12,000 rpm for 20 minutes. Collect the mitochondria pellet.

Isolation of Mitochondrial DNA by DNase-l Treatment Method:

1. Re-suspend the pellet in 100 μl of DNase-I buffer (for 1 g starting material).

2. Incubate on ice for 1 hour.

3. Add three volumes of wash buffer and centrifuge at 2500 rpm for 15 minutes at 4°C.

4. Re-suspend pellet in wash buffer. Repeat washing and centrifuging twice.

5. After final wash re-suspend pellet in 0.1 to 2.0 ml of wash buffer.

6. Add one-tenth volume of pronase (10 mg/ml self-digested for 2 hours at 37°C) and incu­bate for 2 minutes at room temperature.

7. Gently add one-fifth volume of lysis buffer and mix by slowly inverting the tube several times over a period of 10-15 minutes at room temperature.

8. Remove residual starch and cell wall debris from the mitochondrial lysate by centrifuging at 10,000 rpm for 10 minutes at room temperature.

9. Collect the supernatant and mix intensely for 5 minutes with an equal volume of buffer equilibrated phenol.

10. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 rpm. Collect the upper aqueous phase.

11. Add equal volume of phenol-chloroform (1:1) and repeat step 10.

12. Collect the upper aqueous phase. Add equal volume of chloroform-isoamyl alcohol (24:1) and repeat the centrifugation step.

13. Precipitate the DNA with 1/10 volume of 5 M ammonium acetate and 1 volume of isopro­panol at -20°C for 2-3 hours or overnight.

14. Centrifuge for 3-5 minutes at 12,000 rpm.

15. Wash the pellet with 70% ethanol, air-dry and dissolve in 20 μI of TE buffer.


GSure® DNA isolation kit delivers high amount of DNA from minimum amount of sample source. Purified DNA is free of protein and any sort of contamination. This kit provides a simple and convenient technique to isolate high-quality DNA from fresh or stored samples. GSure® kit combines the advantages of a silica-based system with a microspin format. The buffers of each type of GSure® DNA Isolation Kit are designed in such a way that they can deliver maximum yield from the corresponding tissue types.
Buffers of each individual isolation kit are such formulated that one optimized common protocol is fixed for isolation of gDNA. Sample preparation is the most crucial factor for better yield. Extracted DNA always maintains the absorbance ratio of 260 nm / 280 nm between 1.78-1.82, manifesting the quality and purity of the isolated DNA.

The kit is extremely robust. GSure® DNA Isolation kit can isolate up to 10mg of DNA only from 20mg of tissue .Buffers are extremely effective for lysis, making the kit the fastest for gDNA isolation.

Isolated gDNA is compatible for all sorts of downstream application like restriction digestion, southern blotting, PCR amplification, next generation sequencing etc.


8.1: Isolating Genomic DNA - Biology

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Genomic DNA isolation steps

Most nucleic acid extraction techniques involve steps to break open the cell, and then the use of enzymatic reactions to destroy all undesired macromolecules.

Precipitate DNA with an alcohol - usually ethanol or isopropanol.

Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation.

This step also removes alcohol-soluble salt.

Cells are broken open using a detergent solution containing buffering compounds.

To prevent degradation and contamination, macromolecules such as proteins and RNA are inactivated using enzymes.

The DNA is then brought out of solution using alcohol.

The resulting DNA, because it is made up of long polymers, forms a gelatinous mass.

RNA is studied to understand gene expression patterns in cells.

RNA is naturally very unstable because enzymes that break down RNA are commonly present in nature.


Tools and tech notes about cDNA synthesis.

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Genomic DNA isolation steps

Most nucleic acid extraction techniques involve steps to break open the cell, and then the use of enzymatic reactions to destroy all undesired macromolecules.

Precipitate DNA with an alcohol - usually ethanol or isopropanol.

Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation.

This step also removes alcohol-soluble salt.

Cells are broken open using a detergent solution containing buffering compounds.

To prevent degradation and contamination, macromolecules such as proteins and RNA are inactivated using enzymes.

The DNA is then brought out of solution using alcohol.

The resulting DNA, because it is made up of long polymers, forms a gelatinous mass.

RNA is studied to understand gene expression patterns in cells.

RNA is naturally very unstable because enzymes that break down RNA are commonly present in nature.


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