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D2. Control de la transcripción en procariotas - Biología

D2. Control de la transcripción en procariotas - Biología



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La regulación de los genes implicados en la utilización de lactosa le valió a Jacob y Monod (de la fama del MWC) el Premio Nobel. En la transcripción y traducción, se produce una poli-proteína larga, que se escinde post-traduccionalmente para formar las proteínas individuales.

Figura: FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN LA UTILIZACIÓN DE GALACTOSA

Además, otro gen, el represor Gal, se encuentra aguas arriba de los genes de utilización de Gal. Tiene su propio promotor (PI). Un grupo de genes, que incluye el promotor y cualquier secuencia de ADN reguladora, se denomina operón, por ejemplo, el operón Lac. En este caso, la transcripción del operón se induce en respuesta a una señal molecular, es decir, la presencia de lactosa o alolactosa. La señal se une a la proteína represora, que se une al ADN operador, que en ausencia de la señal inhibe la transcripción. Cuando la señal, en este caso alolactosa u otro beta-galactósido, como el isopropiltiogalactósido (IPTG), se une a la proteína represora, se produce un cambio de conformación en el represor, lo que da como resultado una mayor Kd para el ADN operador y la posterior disociación de la proteína represora. complejo represor-galactósido. Se produce la transcripción.

Figura: Estructuras de IPTG y lactosa

IPTG es un inductor del operón lac pero no es un sustrato de las enzimas producidas.

Figura: INDUCCIÓN DE LAC OPERON

Se utilizan muchos métodos análogos pero distintos para controlar la transcripción de genes en procariotas. El control de la transcripción del operón lac es solo un ejemplo.


D2. Control de la transcripción en procariotas

  • Contribuido por Henry Jakubowski
  • Profesor (Química) en College of St. Benedict / St. Universidad de San Juan

La regulación de los genes implicados en la utilización de lactosa le valió a Jacob y Monod (de la fama del MWC) el Premio Nobel. La lactosa puede ser utilizada como única fuente de carbono por E. Coli. Se requieren tres genes para la utilización de lactosa, beta-galactosidasa (lac Z, escinde la lactosa en Gal y Glc), galactósido permeasa (lac Y, transporta Lac a la célula) y tiogalactósido transacetilasa (lac A, función desconocida). Estos genes se suceden en el ADN y tienen 1 región promotora. En la transcripción y traducción, se produce una poli-proteína larga, que se escinde post-traduccionalmente para formar las proteínas individuales.

Figura: FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN LA UTILIZACIÓN DE GALACTOSA

Además, otro gen, el represor Gal, se encuentra aguas arriba de los genes de utilización de Gal. Tiene su propio promotor (PI). Un grupo de genes, que incluye el promotor y cualquier secuencia de ADN reguladora, se denomina operón, por ejemplo, el operón Lac. En este caso, la transcripción del operón se induce en respuesta a una señal molecular, es decir, la presencia de lactosa o alolactosa. La señal se une a la proteína represora, que se une al ADN operador, que en ausencia de la señal inhibe la transcripción. Cuando la señal, en este caso alolactosa u otro beta-galactósido, como el isopropiltiogalactósido (IPTG), se une a la proteína represora, se produce un cambio de conformación en el represor, lo que da como resultado una mayor Kd para el ADN operador y la posterior disociación de la proteína represora. complejo represor-galactósido. Se produce la transcripción.

Figura: Estructuras de IPTG y lactosa

IPTG es un inductor del operón lac pero no es un sustrato de las enzimas producidas.

Figura: INDUCCIÓN DE LAC OPERON

Se utilizan muchos métodos análogos pero distintos para controlar la transcripción de genes en procariotas. El control de la transcripción del operón lac es solo un ejemplo.


Mecanismos mitocondriales para la importación y el ensamblaje de proteínas

Nils Wiedemann y Nikolaus Pfanner
Vol. 86, 2017

Abstracto

Las mitocondrias son orgánulos esenciales con numerosas funciones en el metabolismo celular y la homeostasis. La mayoría de las & gt1.000 proteínas mitocondriales diferentes se sintetizan como precursores en el citosol y se importan a las mitocondrias mediante cinco transportes. Lee mas

Figura 1: Descripción general de las cinco principales vías de importación de proteínas de las mitocondrias. Las preproteínas portadoras de presecuencia son importadas por la translocasa de la membrana mitocondrial externa (TOM) y el presequ.

Figura 2: La ruta de presecuencia hacia la matriz y la membrana interna mitocondrial (MI). La translocasa de la membrana externa (TOM) consta de tres proteínas receptoras, la proteína formadora de canales To.

Figura 3: Papel de la translocasa del ensamblaje de oxidasa (OXA) en la clasificación de proteínas. Las proteínas sintetizadas por los ribosomas mitocondriales son exportadas a la membrana interna (MI) por el OXA que transloca los ribos.

Figura 4: Vía del portador hacia la membrana interna. Los precursores de los portadores de metabolitos hidrófobos se sintetizan sin una presecuencia escindible. Los precursores se unen al chaperón citosólico.

Figura 5: Maquinaria de ensamblaje e importación de espacio intermembrana mitocondrial (MIA). Muchas proteínas del espacio intermembrana (IMS) contienen motivos de cisteína característicos. Los precursores se mantienen en un formato reducido.

Figura 6: Biogénesis de proteínas de barril β de la membrana mitocondrial externa. Los precursores de las proteínas de barril β son inicialmente importados por la translocasina de la membrana externa (TOM), se unen a los pequeños.

Figura 7: El papel dual de la distribución mitocondrial y la morfología de la proteína 10 (Mdm10) en el ensamblaje de proteínas y los sitios de contacto de los orgánulos. Mdm10 se asocia con la maquinaria de clasificación y ensamblaje (SAM).

Figura 8: Múltiples vías de importación para proteínas integrales α-helicoidales de la membrana externa mitocondrial. Los precursores de proteínas con una secuencia de anclaje de señal N-terminal se insertan típicamente en.

Figura 9: El sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS) interactúan con translocas de proteínas. MICOS consta de dos subunidades principales, Mic10 y Mic60. Mic10 forma oligómeros grandes th.


# 134 Control génico en procariotas (operón lac)


Tanto en procariotas como en eucariotas, la transcripción de un gen está controlada por factores de transcripción .

Los factores de transcripción son:

  • proteínas que se unen a una secuencia de ADN específica
  • control la formación de ARNm - & gt controlar el flujo de información del ADN al ARN

Operón lac procariota

  • lacZ - codificación de la β-galactosidasa (hidroliza la lactosa en glucosa + galactosa)
  • de encaje - codificación de la permeasa (permite que la lactosa entre en la célula)
  • laca - codificación de transacetilasa
  • códigos de genes reguladores para proteína represora *
  • represor se une a región del operador , cerca de lacZ
  • La ARN polimerasa no puede unirse al ADN en la región promotora
  • sin transcripción de los 3 genes estructurales
  • lactosa absorbida por la bacteria
  • lactosa se une a la proteína represora , distorsiona la forma y evita que se una a la región del operador en el ADN (cierra el sitio de unión al ADN)
  • la transcripción ya no se inhibe
  • ARNm producido de 3 genes estructurales

4 comentarios:

¡Gracias por las notas, pero hubiera sido mucho más fácil de entender si hubiera incluido un mini video con ejemplos y una explicación detallada! ¡Sin embargo, las notas son increíbles!


Abstracto

La terminación de la transcripción ocurre cuando la polimerasa se libera después de un evento de transcripción, delimitando así las unidades de transcripción; sin embargo, la importancia funcional de la terminación se extiende más allá de la mera definición de los límites del gen. Al determinar el destino celular de las transcripciones generadas, las vías de terminación de la transcripción dan forma al transcriptoma. Informes recientes han subrayado el papel crucial de estas vías en la limitación del alcance de la transcripción generalizada, lo que ha atraído el interés en los eventos posteriores a la iniciación en el control de la expresión génica. Las vías de terminación de la transcripción implicadas en la producción de ARN no codificantes, como la vía Nrd1-Nab3-Sen1 (NNS) en levaduras y la vía del complejo cap-binding (CBC) -ARS2 en humanos, son determinantes clave del control de calidad de la transcripción. La comprensión de los mecanismos que conducen al desmantelamiento oportuno y eficiente de los complejos de alargamiento sigue siendo un desafío importante no resuelto, pero en eucariotas se han obtenido nuevos conocimientos sobre la base molecular de la terminación en dianas de genes de ARN codificantes y no codificantes de ARNm.


D2. Control de la transcripción en procariotas - Biología

¿Qué es una mutación reguladora?

Todas las células de un organismo contienen el mismo genoma, es decir, los mismos genes dispuestos en el mismo orden a lo largo de los mismos cromosomas. Esta es una generalización: algunos genes se reorganizan dentro de ciertas células, pero esta es la excepción y no la regla. Por ejemplo, los genes que codifican las inmunoglobulinas (moléculas de anticuerpos) se reorganizan en los linfocitos B, así es como se crean nuevas estructuras de anticuerpos en respuesta a nuevos organismos o virus invasores. Además, los cromosomas a menudo se rompen y se vuelven a unir de manera aberrante en las células cancerosas. Y, por supuesto, las células germinales (espermatozoides y óvulos) contienen solo la mitad del número de cromosomas que las células somáticas (corporales) normales.

Sin embargo, la mayoría de las células contienen ADN idéntico. Lo que hace que un tipo de célula sea diferente de otro no son los genes que contienen, sino cuáles de estos genes expresan, es decir, qué genes transcriben en ARN y luego se traducen en proteínas. Una célula muscular se diferencia de una neurona en muchos de sus ARN y proteínas constituyentes. Por ejemplo, la célula muscular transcribe los genes que codifican la actina y la miosina del músculo, pero no el gen que codifica el neurofilamento, lo contrario ocurre con la célula neuronal. ¿Qué determina si un gen en particular se transcribe o no? Esto depende en gran medida de las otras proteínas que están presentes en la célula, en particular, proteínas que se conocen colectivamente como factores de transcripción.

Cada gen consta de una secuencia de codificación de proteínas, que puede ser contigua o dividida en una serie de exones e intrones, y que comienza con un codón START (ATG) y concluye con un codón STOP (TAA, TAG o TGA). Aparte de esto, un gen debe tener secuencias reguladoras asociado a ello. Se trata de tramos de ADN que por sí mismos no codifican proteínas, pero que actúan como sitios de unión para la ARN polimerasa y sus moléculas accesorias, así como una variedad de factores de transcripción. Juntas, las secuencias reguladoras con sus proteínas unidas actúan como interruptores moleculares que determinan el estado de actividad del gen, p. Ej. OFF o FULL-ON o, más a menudo, algo intermedio. Las secuencias reguladoras incluyen la promotor región junto con potenciador elementos.

Cada gen tiene un promotor, que es el sitio de unión del aparato transcripcional basal: la ARN polimerasa y sus cofactores. Esto proporciona la maquinaria mínima necesaria para permitir la transcripción del gen. Las regiones potenciadoras se encuentran a una distancia del promotor, en los lados 5 'o 3' del gen o dentro de los intrones. Por lo general, son tramos cortos de ADN (200 pb, digamos), cada uno formado por un grupo de secuencias aún más cortas (25 pb, digamos) que son los sitios de unión para una variedad de factores de transcripción específicos de células o regiones. Una vez unidos, estos complejos de factores de transcripción interactúan con la maquinaria transcripcional basal en el promotor para mejorar (o en ocasiones disminuir) la tasa de transcripción del gen. Tales interacciones son posibles debido a la naturaleza flexible del ADN que permite que los potenciadores se acerquen al promotor formando un bucle de ADN entre ellos (ver diagrama a continuación).

Podemos pensar en la función de activación de los potenciadores de la siguiente manera. La unión de la ARN polimerasa y la maquinaria de transcripción basal en el promotor del gen es como encender el motor y dejarlo inactivo en neutral. Cuando los factores de transcripción suplementarios ligados a los elementos potenciadores interactúan con la maquinaria basal, es como poner el motor en marcha y alejarse de la acera. (Alternativamente, para un sitio represor es como poner el freno de mano).

Con frecuencia, un gen determinado está sujeto a una regulación compleja. Es decir, podría tener que transcribirse en diferentes momentos y en diferentes lugares durante el desarrollo, o en respuesta a diferentes estímulos extracelulares. En el contexto actual (Drosophila embriogénesis) hemos visto que los genes de segmentación se expresan según su posición en el embrión. Un ejemplo es el incluso saltado (víspera), un gen de regla de par que se transcribe en parasegmentos embrionarios alternativos para generar un patrón de cebra de siete rayas. El estado transcripcional del víspera El gen, ya sea activado o desactivado según el parasegmento en el que nos encontremos, está bajo el control de una serie de elementos potenciadores, uno para cada franja. Cada elemento potenciador contiene sitios de unión para productos génicos de segmentación aguas arriba como Bicoid y Kruppel (que, como recordará, son factores de transcripción en sí mismos). Por lo tanto, la constelación particular de genes de efecto materno, genes gap y otros genes de reglas de pares que se expresan en un parasegmento dado determina si uno de los elementos potenciadores está o no completamente ocupado y, en consecuencia, si víspera la transcripción de genes está activada o no en ese parasegmento. La especificidad de los potenciadores se puede demostrar eliminando solo uno de ellos (el elemento que especifica la banda 2, digamos) e insertándolo corriente arriba de un gen indicador como la beta-galactosidasa bacteriana (Bgal). cuando se introduce en el embrión, Bgal se expresa en una sola franja, en la posición de la víspera raya 2. Alternativamente, los elementos potenciadores particulares se pueden eliminar de la normal víspera gen, resultando en la deleción de las franjas correspondientes de víspera expresión. Tal mutación, la pérdida de un elemento potenciador, se denomina regulador mutación. Afecta la regulación espacial o temporal del gen sin causar una pérdida universal del producto génico.

La parte superior de este diagrama muestra parte de la región reguladora del víspera gen: la parte más cercana al sitio de inicio de la transcripción (flecha roja). En esta región hay tres elementos potenciadores que controlan víspera expresión en las franjas 2, 3 y 7. Otros elementos, no mostrados en el diagrama, se encuentran más lejos del sitio de inicio de la transcripción (a la izquierda) y controlan víspera expresión en franjas 1, 4, 5 y 6. Al eliminar estos elementos ascendentes y dejar solo los que se muestran en el diagrama, se genera el patrón de expresión que se muestra arriba a la derecha: franjas 2, 3 y 7. Tomando solo uno de los elementos, el de stripe 2, y al vincularlo a un gen informador se obtiene el patrón que se muestra arriba en el centro: solo la raya 2. El tipo salvaje víspera El patrón de expresión se muestra arriba a la izquierda. (De Gilbert, Developmental Biology 4th edition Chapter 15, p549 y Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 3rd edition, Chapter 9 p428)

Algo similar ocurre con la regulación del Complejo Bithorax. Transcripción de Ubx, abd-A y Abd-B está controlado por una serie de elementos potenciadores, cada uno de los cuales es específico para un parasegmento particular. Pérdida de uno de los Ubx los potenciadores resultarán en la pérdida de Ubx expresión del correspondiente parasegmento y transformación de ese parasegmento. Las mutaciones BX-C recogidas por Lewis en su pantalla genética (bx, pbx, bxd, iab2 etc.) resultan ser mutaciones reguladoras de este tipo. Por ejemplo, bxd control S Ubx expresión en A1 mutaciones de bxd resultan en pérdida de expresión de Ubx en A1 y transformación homeótica de A1 en T3). Por lo tanto, las transformaciones de la identidad del segmento son el resultado de alteraciones sutiles, específicas de un parasegmento, de los patrones de expresión de Ubx, abd-A o Abd-B, no la pérdida completa de sus proteínas codificadas.


Abstracto

La duplicación precisa del genoma es la base de la homeostasis genética. La proteína de unión de metazoos Mdm2 (MTBP) forma una plataforma reguladora principal para la activación de origen junto con Treslin / TICRR y TopBP1 (proteína de unión 1 de topoisomerasa II (TopBP1), que interactúa con la proteína estimulante de la replicación / punto de control que interactúa con TopBP1 y regulador de la replicación). Divulgamos el primer análisis exhaustivo de MTBP y revela funciones de MTBP conservadas y específicas de metazoos en la replicación. Esto sugiere que los metazoos han desarrollado mecanismos moleculares específicos para adaptar los principios de replicación conservados con levadura a los requisitos específicos de las células metazoarias más complejas. Descubrimos uno de esos procesos específicos de metazoos: un nuevo factor de replicación, quinasa dependiente de ciclina 8/19-ciclina C (Cdk8 / 19-ciclina C), se une a un dominio central de MTBP. Esta interacción es necesaria para la duplicación completa del genoma en células humanas. En ausencia de la unión de MTBP a Cdk8 / 19-ciclina C, las células entran en mitosis con cromosomas duplicados de forma incompleta y la segregación cromosómica subsiguiente se produce de forma inexacta. Usando búsquedas remotas de homología, identificamos MTBP como el ortólogo metazoario de la levadura sintética letal con Dpb11 7 (Sld7). Esta homología finalmente demuestra que el conjunto de factores centrales de la levadura suficientes para el inicio de la replicación in vitro se conserva en los metazoos. MTBP y Sld7 contienen dos dominios homólogos que no están presentes en ninguna otra proteína, uno en cada uno de los extremos N y C. En MTBP, los extremos conservados flanquean la región de unión de Cdk8 / 19-ciclina C específica de metazoos y son necesarios para la activación de origen normal en células humanas. Los extremos N de MTBP y Sld7 comparten una función de disparo de origen esencial, la interacción con Treslin / TICRR o su ortólogo de levadura Sld3, respectivamente. Los extremos C pueden funcionar como dominios de homodimerización. Nuestra caracterización de procesos de iniciación ampliamente conservados y específicos de metazoos sienta las bases para una mayor disección mecanicista de la iniciación de la replicación en vertebrados. Es un primer paso para comprender las distinciones de origen que se disparan en eucariotas superiores.


Parte 2: Regulación genética: ¿por qué es tan compleja?

00: 00: 01.03 Mi nombre es Bob Tjian,
00: 00: 02.19 Soy profesor en la Universidad de California en Berkeley,
00: 00: 06.19 donde he enseñado durante muchos años en Biología Molecular y Bioquímica,
00: 00: 11.02 y más recientemente, también asumí el cargo de presidente del Instituto Médico Howard Hughes.
00: 00: 16.26 Y es un placer para mí continuar hoy con mi segunda conferencia en esta serie,
00: 00: 22.29 para describirle algunas ideas interesantes sobre cómo funciona la regulación genética,
00: 00: 30.25 particularmente en organismos más complejos.
00: 00: 34.21 Ahora, en mi última serie de conferencias, les dejé esta visión del tipo de complejidad que tiene que estar evolucionando.
00: 00: 48.26 para permitir el tipo de patrones de expresión genética que vemos en los muchos, muchos organismos que sabemos que existen en este planeta.
00: 01: 00.29 Y entonces, hay algunas preguntas realmente intrigantes que voy a abordar en esta segunda conferencia.
00: 01: 09.15 Y una cosa que les dejé fue una imagen de la interacción de muchas moléculas que tienen que unirse,
00: 01: 18.26 y aterrizar en un sitio particular de la molécula de ADN que es parte del cromosoma de un organismo
00: 01: 24.25 o dentro de una célula de un organismo, y cómo podría funcionar este proceso.
00: 01: 31.04 Pero, creo que la pregunta que nos ha atormentado durante décadas,
00: 01: 35.20 ahora que teníamos una mejor idea de cómo se ve esta maquinaria molecular que está involucrada en la decodificación de la información del ADN en expresión génica,
00: 01: 49.07 nos preguntamos por qué es tan complejo.
00: 01: 53.20 Y para comenzar a abordar este problema, permítanme llevarlos de regreso a un concepto simple.
00: 02: 01.10 Y recuerda que diferentes organismos tienen diferentes tamaños de sus genomas,
00: 02: 08.00 es decir, la cantidad de ADN que se requiere para codificar el organismo en particular.
00: 02: 14.23 Y aquí hay algunos ejemplos de ambas bacterias, organismos procariotas simples unicelulares,
00: 02: 22.18 así como organismos eucariotas unicelulares como la levadura de panadería, y luego está el pequeño y redondo gusano del suelo C. elegans,
00: 02: 30.25 y luego puedes subir a mamíferos y vertebrados.
00: 02: 33.29 Y verá, en primer lugar, que la cantidad de ADN puede variar mucho de unos pocos millones de pares de bases.
00: 02: 40.17 hasta 3 mil millones de pares de bases o más.
00: 02: 45.00 Para acompañar este tipo de nivel de expansión del ADN y la longitud del cromosoma, también tiene diferentes niveles de genes.
00: 02: 54.13 Ahora, notará que el rango de genes es mucho menor que el rango de longitud del ADN,
00: 03: 00.20 así que esto nos informa en parte sobre quizás por qué necesitamos la complejidad que finalmente descubrimos que está involucrada
00: 03: 10.26 en la formación de esta maquinaria molecular que es responsable de leer la información genética.
00: 03: 17.22 Así que esta es solo una pequeña tabla para volver a enfatizar que estos genomas más complejos, que también significan organismos más complejos,
00: 03: 28.15 lo que realmente significa muchos tipos de células diferentes, muchos comportamientos diferentes, interacciones complejas con su entorno, etc.
00: 03: 38.24 ¿Cómo se decodifica realmente toda esta información de nuestros genomas?
00: 03: 43.03 Y en un lado aquí, ves la maquinaria reguladora de genes del núcleo procariota,
00: 03: 50.07 o la maquinaria de transcripción central, y en casi todas las bacterias,
00: 03: 54.20 Son solo unos pocos polipéptidos. 5, 6, 7 polipéptidos.
00: 04: 00.00 Luego, de este lado, verá que los llamados organismos eucariotas,
00: 04: 05.00 y particularmente cuando se habla de organismos metazoarios multicelulares, ahora se ve una gran diversidad y cantidad de proteínas o,
00: 04: 15.17 como llamamos, factores de transcripción, que son necesarios para ensamblar en conjuntos muy grandes de múltiples subunidades
00: 04: 25.18 que se requieren para transcribir los 10,000 a 30,000 genes que definen estos organismos más complejos.
00: 04: 33.21 Entonces, de inmediato se puede ver que existe esta proliferación de las subunidades y la maquinaria y la complejidad.
00: 04: 43.00 Entonces, en esta conferencia, les voy a dar una pequeña idea de por qué tal vez este es el caso,
00: 04: 49.11 y lo que tiene de especial el organismo multicelular más complejo,
00: 04: 55.11 y por qué esta maquinaria puede tener que haber sido más elaborada a través de la evolución, en comparación con organismos más simples.
00: 05: 05.07 Ahora, una de las primeras cosas que te das cuenta cuando miras dentro de la celda,
00: 05: 10.03 o particularmente el núcleo de un organismo superior, digamos nuestras propias células, versus una bacteria,
00: 05: 17.10 es que el ADN, la misma molécula que forma la información genética, está empaquetada de una manera muy diferente.
00: 05: 25.11 Entonces, en todos los eucariotas, el ADN de doble hebra no se encuentra allí en la forma que llamaríamos
00: 05: 33.29 el ADN "desnudo", que se muestra en la parte superior aquí. Sino más bien,
00: 05: 38.17 este ADN está envuelto con un conjunto de proteínas, proteínas muy básicas, llamadas "nucleosomas",
00: 05: 46.00 y estos a su vez se empaquetan aún más hasta una forma altamente condensada
00: 05: 52.09 que finalmente forma los cromosomas que podrás ver bajo un microscopio.
00: 05: 57.26 Y las figuras azules de aquí y las figuras verdes solo te dan una vista del
00: 06: 02.29 estructura de alta resolución de un nucleosoma con ADN envuelto alrededor.
00: 06: 09.00 Entonces, ¿cuál es la consecuencia de tener todo nuestro ADN,
00: 06: 14.04 ¿todos nuestros cromosomas, condensados ​​y envueltos de esta manera?
00: 06: 18.09 Puede pensar que está empaquetado.
00: 06: 20.15 Bueno, una cosa es que puedes meter todo esto en un pequeño núcleo,
00: 06: 25.15 así que si colocamos nuestro ADN en cada célula de nuestro cuerpo, de un extremo a otro
00: 06: 31.20 y lo estiró como una cuerda, tiene casi un metro de largo.
00: 06: 35.12 Y, sin embargo, tienes que meter todo eso en un volumen diminuto.
00: 06: 39.10 Y parte de la forma en que eso sucede es que puedes compactar el ADN con estas estructuras.
00: 06: 46.24 Ahora, la consecuencia de eso es, por supuesto, que de alguna manera tienes que negociar
00: 06: 52.18 a través de esta forma de ADN altamente compactada para tener acceso a la información del ADN y los genes.
00: 07: 00.12 Entonces, para decirlo de otra manera, tienes que tener una maquinaria,
00: 07: 04.24 un aparato transcripcional cuyo trabajo es leer el ADN y, recuerdas de la primera conferencia,
00: 07: 10.27 convertir esa información de ADN en ARN, una molécula intermedia
00: 07: 14.23 que finalmente se traduce en un producto proteico.
00: 07: 18.19 Bueno, claramente una de las razones por las que tenemos esta maquinaria transcripcional tan elaborada
00: 07: 25.02 es en parte para lidiar con tener que navegar a través de una plantilla de cromatina, en contraposición a una plantilla de ADN desnudo.
00: 07: 33.24 Y entonces hay varias proteínas y complejos de proteínas que se llaman
00: 07: 38.29 "complejos remodeladores de cromatina", "complejos modificadores de cromatina",
00: 07: 44.12 y estos tienen que coordinarse con la maquinaria de transcripción aquí abajo en amarillo y naranja,
00: 07: 50.01 para navegar y básicamente expresar una serie de interacciones
00: 07: 55.08 que son transacciones entre la maquinaria proteica y el ADN.
00: 08: 00.29 Así que este es un problema muy desafiante.
00: 08: 04.10 Entonces eso es parte del problema, o parte de la razón por la que pensamos que hay tanta complejidad.
00: 08: 09.11 Entonces, ¿cómo llegamos a esta imagen?
00: 08: 12.05 ¿Cómo pudimos finalmente darnos cuenta de que había más de 85 proteínas que tenían que ensamblarse en una plantilla de cromatina?
00: 08: 21.16 para darle expresión y transcripción de genes, en el lugar correcto, en el momento correcto?
00: 08: 26.25 Y solo quiero darles una especie de vistazo rápido a una tecnología que se puede usar para abordar el problema de,
00: 08: 37.03 ¿cómo dividimos esta compleja maquinaria en unidades comprensibles?
00: 08: 42.29 Y como dije en la primera conferencia, hay muchas herramientas que los biólogos moleculares
00: 08: 47.18 y los bioquímicos pueden utilizar para tratar de desentrañar estas complejas transacciones moleculares.
00: 08: 53.18 Uno de ellos, por supuesto, es usar la genética, que es usar la mutación genética
00: 08: 58.29 para eliminar o alterar un producto genético en particular y luego preguntar cuál es la consecuencia.
00: 09: 05.06 La otra forma de hacerlo es tomar una celda con toda su complejidad
00: 09: 10.02 y descomponerlo literalmente en sus partes componentes, y luego intentar volver a armarlo
00: 09: 14.09 nuevamente en una forma funcional. Y eso es lo que les voy a mostrar hoy.
00: 09: 18.00 Y es una tecnología que llamo "ensayo de complementación bioquímica".
00: 09: 23.03 Y es muy simple: preguntas, ¿cuáles son los componentes mínimos,
00: 09: 27.24 por ejemplo, en el caso de un gen humano. ¿Cuáles son los componentes proteicos mínimos del aparato transcripcional?
00: 09: 33.29 que puedes extraer del núcleo de una célula que necesitas poner en un tubo de ensayo
00: 09: 38.19 que le permitirá reconstruir esencialmente o, como decimos,
00: 09: 42.19 reconstituir la actividad que le permitirá leer el gen de una manera precisa?
00: 09: 48.19 Y puedes seguir agregando o quitando diferentes proteínas,
00: 09: 53.13 las amarillas, las verdes, las naranjas, etc.
00: 09: 56.24 y pregunte, ¿hay alguna diferencia?
00: 09: 59.11 Y al reproducir este ensayo de suma y resta, o "complementación bioquímica",
00: 10: 04.29 puede descubrir muy rápidamente cuáles son los componentes mínimos que necesita para activar un gen de manera regulada,
00: 10: 11.12 y qué otras cosas podrían ser necesarias para apoyar esta actividad.
00: 10: 16.15 Entonces, la primera pregunta que se hizo fue del análisis bioquímico de aproximadamente
00: 10: 24.02 Cuatro docenas de proteínas diferentes: ¿Cuáles son realmente necesarias y suficientes?
00: 10: 30.07 En otras palabras, ¿cuál es el conjunto mínimo de componentes que necesita para darle una transcripción regulada?
00: 10: 36.29 Así que ahora estamos haciendo una pregunta más complicada.
00: 10: 39.09 No solo lo que es necesario para simplemente brindarle la transcripción, en otras palabras, la conversión de ADN en ARN,
00: 10: 45.29 pero hacerlo de manera regulada.
00: 10: 47.27 Porque después de todo, eso es lo realmente interesante.
00: 10: 50.23 es por eso que una celda lo hace de una manera y una celda diferente tiene un programa diferente.
00: 10: 55.25 Y este experimento aquí dice que nuestro factor de transcripción clásico específico de secuencia que
00: 11: 02.00 une el ADN en su región promotora reguladora, junto con lo que llamaremos el "núcleo" o
00: 11: 09.07 La maquinaria "basal" de transcripción es necesaria pero no suficiente.
00: 11: 14.07 Entonces, más o menos el activador Sp1 no hace ninguna diferencia,
00: 11: 19.16 a pesar de que sabemos que en una célula viva, Sp1 activa en gran medida este gen que estamos viendo.
00:11: 26.16 Entonces, eso significa que falta algo en este experimento de reconstitución.
00:11: 31.16 Entonces, ¿cómo vamos a encontrar lo que falta?
00: 11: 35.03 Y esta complementación bioquímica realmente depende de nuestra capacidad para tomar las células que contienen los componentes necesarios
00: 11: 43.25 y los componentes suficientes, y luego comenzar a extraerlo
00: 11: 47.28 y para encontrar qué moléculas faltan que aún no estamos agregando a nuestra reacción.
00:11: 54.05 Y para hacer eso, básicamente tenemos que tomar las células, en este caso, células humanas,
00: 11: 58.28 romper las células, extraer el núcleo, eliminar todas las proteínas del núcleo,
00: 12: 04.03 y comenzar a separar las miles de proteínas diferentes
00: 12: 08.05 que están en el núcleo en diferentes grupos, si lo desea.
00: 12: 12.08 Y los separamos en función de sus propiedades físicas y químicas,
00:12: 17.19 y algunos de ustedes probablemente hayan tenido alguna experiencia en la ejecución de cromatógrafos de columna.
00: 12: 23.16 Esta es básicamente una forma de separar proteínas en función de su carga positiva, carga negativa, tamaño molecular,
00: 12: 32.16 hidrofobicidad (en otras palabras, qué tan grasosos son. Qué tan bien interactúan con el agua), y así sucesivamente.
00: 12: 38.20 Entonces, si lo hace iterativamente, como se muestra aquí en una serie de intercambio aniónico diferente
00: 12: 45.23 e intercambio catiónico, así como filtración en gel, cromatógrafos,
00: 12: 50.12 eventualmente puede separar los miles de componentes diferentes de un extracto nuclear en sus partes individuales.
00: 12: 59.00 Y luego puedes probar cada uno para ver si es la pieza que falta.
00: 13: 03.15 Y cuando haces eso, he aquí, te das cuenta de que faltan un par de piezas
00: 13: 07.22 que son necesarios para volver a agregar, en otras palabras, reconstituir, la reacción
00: 13: 13.12 para que ahora tengas la transcripción regulada.
00: 13: 15.27 A diferencia de los datos anteriores que les mostré,
00: 13: 19.14 ahora puede ver que la maquinaria es más compleja y, lo más importante,
00: 13: 24.23 también puede ver que la maquinaria ahora responde al activador.
00: 13: 29.19 Entonces, la señal con el activador, más Sp1, es mucho más oscura que en la señal sin Sp1.
00: 13: 36.13 Eso significa que hay una transcripción activada que es Sp1-, un factor de transcripción clásico, dependiente.
00:13: 43.11 Eso nos permitió identificar dos componentes clave muy importantes que no conocíamos antes de hacer este experimento:
00: 13: 51.29 Uno es un complejo de múltiples subunidades llamado "Factor de transcripción II D",
00: 13: 57.25 y el otro se llama complejo Mediador.
00: 14: 01.01 Y estos resultan realmente definir una clase completamente nueva de factores de transcripción, que son los llamados cofactores.
00: 14: 09.27 Así que les voy a contar un poco más sobre uno de estos cofactores,
00: 14: 13.15 porque ambos realmente realizan funciones similares,
00:14: 16.13 pero resulta que sabemos bastante más sobre uno de ellos que sobre el otro.
00: 14: 20.17 Entonces, este llamado complejo TFIID tiene aproximadamente 15 subunidades, en otras palabras,
00: 14: 25.28 15 proteínas separadas que tienen que unirse para formar un complejo.
00:14:31.22 And it's a very large macromolecule, so it's a million daltons.
00:14:36.23 that's a very, very large, floppy molecule, with many pieces to it.
00:14:41.12 One of its functions you already know about,
00:14:43.16 because it contains as one of its subunits the so-called "TATA-binding protein."
00:14:48.12 That's that saddle-shaped molecule that binds to double-stranded DNA,
00:14:55.02 at the AT-rich sequence called a TATA box,
00:14:58.06 which is associated with many genes in animal cells.
00:15:02.09 But what we've come to learn in the last decade or so is that this little complex
00:15:07.22 is doing much more than just simply binding to the TATA box
00:15:11.18 it's doing a whole bunch of other things that we didn't have any idea about.
00:15:15.12 And now that we knew the existence of this activity and that it was critical not only for TATA binding,
00:15:22.08 but also for mediating or potentiating transcription activation, we then could break down
00:15:28.04 more of its functions of individual subunits, because you remember there's 15 different polypeptides here.
00:15:34.09 And this is just a little summary showing you that this complex of proteins
00:15:38.11 is doing a lot of different functions.
00:15:41.18 It's recognizing the nucleosomes, which have a basic protein called a "histone,"
00:15:49.26 and so it recognizes histones only when it's got
00:15:53.09 a certain chemical modification called an acetylation event.
00:15:59.12 This big orange complex also itself has enzymatic activity, including kinase activity,
00:16:06.06 which can put phosphate groups on other proteins and enzymes.
00:16:10.04 It has acetylase activity, and of course, it has to interact directly
00:16:15.05 with activators in order to potentiate their function in turning on transcriptional activation.
00:16:22.07 And I'm probably safe in speculating that
00:16:26.20 there are yet unknown functions of this large complex that we still have to discover,
00:16:32.23 because we've really only understood maybe half of the subunits, and even there,
00:16:37.25 only partially understood the functions of that half of the subunits that are part of this complex.
00:16:44.05 So, there's clearly much more work to be done, but I think what's clear from these experiments
00:16:48.25 is that these proteins are doing a lot more than just binding DNA.
00:16:53.08 They're what I would think of as integrators of information.
00:16:58.01 So, this integrator of information means that this structure and the function is very complex, and so,
00:17:04.27 one of the things that we've had to do.
00:17:08.00 it's been a very challenging problem that remains challenging,
00:17:11.21 because we haven't solved all the technical problems.
00:17:13.18 is that because it's a large, megadalton, floppy molecule, solving the three-dimensional
00:17:19.25 structure of such large assemblies has proven to be rather technically challenging.
00:17:26.08 And we have to use many different techniques to try to address this in:
00:17:31.28 X-ray crystallography, NMR.
00:17:34.07 but one of the techniques that's emerging, that's very, very powerful
00:17:38.09 for solving the structures of these large assemblies is something called "cryo-electron microscopy."
00:17:46.24 It's basically a way of freezing these large assemblies in place,
00:17:52.18 and then solving their structure by microscopy.
00:17:55.29 And this is just about a 25 angstrom, so relatively low-resolution structural determination,
00:18:03.17 of the human TFIID complex and, most importantly,
00:18:08.24 its relationship to two other transcription factors that are part of the assembly
00:18:14.03 that has to align itself up on the promoter to start transcription,
00:18:18.08 and that's the other two transcription factors TFIIA and B, which are shown in green and purple here.
00:18:24.13 So you can slowly start building up the entire complex in pretty accurate three-dimensional space
00:18:33.00 to figure out what its shape will inform us about its function,
00:18:37.15 and that's something that's an ongoing project in many laboratories in molecular biology.
00:18:43.01 So, this cartoon. and again I want to emphasize that
00:18:46.27 all the figures there and the colored blobs are more a part of our imagination at this point,
00:18:53.16 although, as I just showed you, we actually have real structures of some components of this pre-initiation complex.
00:19:02.25 This slide just emphasizes the point that there's a lot of information integration going on,
00:19:09.22 and that there is protein-protein and protein-nucleic acid interactions
00:19:15.06 that are critical for the regulatory functions of these large, macromolecular assemblies.
00:19:21.02 And this also reminds you that there are at least three separate classes of transcription factors
00:19:27.17 that are playing a key role in the regulation of genes:
00:19:30.28 the classical activator and repressor that are sequence-specific DNA-binding proteins,
00:19:35.26 like the Sp1 protein I talked to you about earlier, just shown here in pink
00:19:41.11 there are the components of the core machinery, which are shown in yellow
00:19:45.27 and then you have these things we call co-factors or co-activators,
00:19:49.12 that are integrating information between the activators and the core machinery.
00:19:56.06 So this kind of gives you a slightly better view of why there's this kind of complexity,
00:20:04.06 but it still doesn't really address all of the issues with respect to:
00:20:09.22 Why do you need 85 proteins to do this?
00:20:12.09 So, let me dig a little deeper into this.
00:20:15.00 So, first, let me just pose some of the questions that are really still largely unresolved in the field,
00:20:21.14 even though this is a pretty mature area of study
00:20:24.10 we've been trying to address these issues for a couple of decades,
00:20:28.14 and it goes to show how difficult it is to really tease apart this complex molecular machinery.
00:20:34.23 And I should say that the complexity of this machinery is not unique
00:20:38.19 to the transcriptional apparatus. Many other biological processes are also dependent on
00:20:43.23 macromolecular machines that are very similar in complexity to this one.
00:20:49.04 So I think things that we learn about the transcriptional machinery could be applied in principle to many other machineries.
00:20:56.20 So, couple of interesting questions:
00:21:00.20 What are the transcriptional mechanisms that regulate complex cell types?
00:21:06.29 Because, after all, multicellular organisms evolved to having many, many different
00:21:13.12 cell types, so our bodies are made up of many different cell types,
00:21:18.23 which means that each cell's performing a different function.
00:21:22.02 Our hair follicle cells are producing hair, our red blood cells are
00:21:27.02 producing hemoglobin and doing something else, our skin cells are protecting us.
00:21:31.17 Each cell type is doing a different thing, so how does this happen,
00:21:36.01 how do we generate this diversity of cell types through the gene regulatory networks?
00:21:42.17 And then, knowing what we now know about the first level of complexity of the machinery
00:21:49.04 that's responsible for decoding this information, what more can we learn about the process of regulation now?
00:21:57.03 Particularly, what is the division of labor between the core machinery
00:22:03.24 (which binds to the promoter), the activators, and the co-activators?
00:22:08.22 So, what is their relationship, and what's their respective roles in defining cell type-specific gene expression?
00:22:16.19 That's really the last topic that I want to cover in this lecture.
00:22:21.06 So, let's review a few basic facts about individual cell types.
00:22:26.13 So, let's take two well-recognized cell types: fat cells and muscle cells.
00:22:33.12 Very different cells that perform very different functions,
00:22:36.27 but every cell in a particular organism has the same genetic information.
00:22:43.04 It has the same DNA, it has the same set of chromosomes.
00:22:46.08 That means that these two cells have to be using different parts of the information
00:22:52.09 from the genome to give it their distinct identities.
00:22:56.20 So, each cell must only express some subset of the genes,
00:23:03.21 and that particular subset would define the function of a fat cell versus a muscle cell.
00:23:10.11 And, so then the question becomes:
00:23:12.26 Okay, that makes sense, but how do you get there?
00:23:15.02 How do you get cell type-dependent differential gene expression patterns?
00:23:20.16 How do you turn on the right genes to make fat
00:23:22.27 versus keeping the muscle cell gene functions turned off, and vice versa?
00:23:29.06 So that is a fundamental question of trying to understand the process of cellular differentiation,
00:23:36.19 cell-specific function, and really, developmental biology.
00:23:41.09 Another set of interesting points to make is that, of the 20,000 to 30,000 genes
00:23:46.18 that a typical metazoan organism encodes, a pretty big chunk of it is devoted
00:23:54.03 to the very machinery that I'm talking about, in other words, the transcription factors.
00:23:59.04 So roughly somewhere between 5 and 10% of the entire coding capacity
00:24:04.02 of genes in a genome is devoted to encoding transcription factors.
00:24:10.11 So this is clearly a very important class of molecules.
00:24:13.02 So that means there are several thousand transcription factors.
00:24:16.28 But now if you start thinking about the many, many thousands of cell types and the behavior of different cells,
00:24:23.16 are a few thousand transcription factors, in and of themselves, enough to generate the diversity of function?
00:24:31.14 And this is where we have to start thinking about,
00:24:33.21 how do you create really large numbers of distinct transcriptional networks?
00:24:40.28 And they really are networks, as you'll see in a minute.
00:24:43.15 And one thing that became clear as we defined what genes look like and what a promoter as a transcriptional unit looks like,
00:24:51.22 we come to understand that the only way to create the kind of huge levels of diversity of distinct transcriptional
00:24:58.20 components and patterns, is to do it by combinatorial regulation.
00:25:03.12 And what do I mean by that?
00:25:04.27 So, one way to think about it is that you might only have ten cards,
00:25:09.25 but if you shuffle those ten cards and pick four at a time,
00:25:13.06 you can have many, many combinations.
00:25:15.11 So here's a perfect example of three different cell types, could be in the same organism,
00:25:20.11 and each of those symbols represents binding sites,
00:25:25.22 and then the little boxes and triangles above them represent the binding proteins.
00:25:32.18 And you can see that those three cell types might express these sets of genes in similar ways,
00:25:38.25 but they use different combinations of proteins to do it.
00:25:42.08 And this is really the notion of combinatorial mechanisms for gene regulation,
00:25:46.27 and we now know that that is indeed the way, at least in part,
00:25:51.05 that gives us the ability to create many different specific transcription patterns.
00:26:00.04 I have to now also tell you about another, I would say, defining,
00:26:04.23 unusual property of transcription in animal cells,
00:26:09.06 and this is a hard one sometimes to get your head around.
00:26:12.19 And that is that these different little units of DNA that specify the activity of a gene
00:26:18.20 don't have to be sitting, linearly and spatially, directly next to the gene that it's activating or repressing.
00:26:26.21 They can sit tens of thousands of base pairs away from the site.
00:26:32.04 So these we call long-distance enhancers or silencers, so they can both upregulate a gene.
00:26:39.01 in other words, make more of the gene or less or the gene.
00:26:41.27 And the thing that was so surprising was that the intervening DNA can be very, very long
00:26:48.04 it can be thousands and maybe even millions of base pairs.
00:26:53.00 So how does this work?
00:26:53.28 How can something sit so far away actually influence transcription at a very remote site?
00:27:00.26 And this is one of the big conundrums that we still face in the field.
00:27:05.15 We have some models and we have some ideas that we can test,
00:27:08.09 and I'll end my lecture with a few speculations about that.
00:27:11.24 But clearly, we don't fully understand this so-called long-distance regulation,
00:27:16.27 which clearly is regulated by activators and repressors just like
00:27:21.09 the same players that we've been talking about, like the Sp1 molecule and other activators.
00:27:26.12 But yet, how they can reach across long distances of the chromosome to grab on to the core machinery to actually impart information
00:27:36.06 and to create the kind of specific regulatory events is still somewhat obscure.
00:27:43.28 So, another thing that I should say is that,
00:27:47.07 because of the combinatorial mechanisms of generating diversity was so dependent
00:27:54.18 on the distinct sets of sequence-specific DNA-binding proteins,
00:28:00.12 over the last two decades we've come to kind of a traditional model that the core machinery stays relatively invariant.
00:28:10.04 In fact, we kind of think of it as universal, because if you break open a nucleus of a very
00:28:15.11 simple organism like yeast, or you break open the nucleus of a human cell,
00:28:21.22 that machinery looks remarkably similar to each other.
00:28:24.26 And yet, their gene networks are very, very different, so we thought,
00:28:29.05 well, maybe it's all having to do with the sequence-specific DNA-binding proteins,
00:28:34.07 that will generate the diversity through combinatorial regulation.
00:28:38.25 And that's probably true in fact, there's a lot of evidence to support that.
00:28:42.27 But it was only part of the story.
00:28:45.04 So, a kind of related question would be:
00:28:47.25 Are we really right in thinking that the core machinery is universal and invariant?
00:28:54.03 And that turns out to be an oversimplification.
00:28:57.06 So it turns out evolution didn't work that way.
00:29:02.26 And when we looked very carefully in the last few years, particularly at individual,
00:29:07.02 different, distinct cell types, let's say muscle versus fat, or neuron, or liver cell,
00:29:13.01 we certainly see differences in the activators, as we would expect, and indeed they are working in combinatorial fashion,
00:29:20.02 but they're not only working combinatorially with each other,
00:29:23.06 but they are combining in different combinations with the core machinery, which is itself variable.
00:29:29.23 And that was kind of a revelation that's really become more clear just in the last few years.
00:29:35.29 So, in addition to the sequence-specific binding proteins and their diversity,
00:29:41.10 there turns out to be a much greater degree of diversity in the core machinery,
00:29:46.09 the parts that we thought were invariant, than we ever imagined.
00:29:50.11 Now, once you realize that that's the case,
00:29:54.07 that opens up a whole other level of generating diversity that we didn't anticipate,
00:29:59.13 and that of course really allows multicellular organisms to diversify in unbelievable ways.
00:30:06.18 So, let's drill down finally a little bit at how did we find this out, and where are we going?
00:30:13.08 So now, unlike a few decades ago when we first began to study the process of transcription
00:30:20.02 and discovered all of this initial complexity, in those days we mainly worked on just a few different cell types.
00:30:28.13 But today, we have the ability technically to work with just about any cell type,
00:30:33.18 from the most complex, such as embryonic stem cells,
00:30:37.13 to perhaps the simple cell, like the skeletal muscle, and everything in between.
00:30:41.18 liver cells, neuronal cells, and so forth.
00:30:45.03 And this has really opened up our view of just how diverse, interesting,
00:30:51.17 and variable the transcriptional apparatus is, that is probably really necessary
00:30:56.18 from an evolutionary standpoint to drive the diversity of gene expression and cell types that we see.
00:31:04.10 The first hint that this core machinery that we thought was so invariant may not be so invariant,
00:31:10.14 came from studying the development of the skeletal muscle.
00:31:14.21 So when you go from a precursor cell called a myoblast, which looks like most every other mammalian cell,
00:31:21.13 with its standard, prototypic core machinery, and then when you look at it when that cell type differentiates, in other words,
00:31:29.16 specializes into a myotube (which will ultimately form skeletal muscle, which is the muscle around your large bones
00:31:37.03 that makes you be able to move),
00:31:39.16 it turns out that it not only shifts which transcriptional activators it uses,
00:31:45.05 but it also jettisons the prototypic core machinery and substitutes it with some modified versions of that core machinery,
00:31:53.21 which is shown down here in the purple and the bright blue.
00:31:57.29 So this was really a change in the paradigm of the way we're thinking about regulation,
00:32:03.08 and of course, this was just the first example.
00:32:07.08 One wanted to know if similar things were happening in other different cell types, and very quickly,
00:32:13.04 if you look at hepatocytes or liver cells, if you look at adipocytes or fat cells,
00:32:18.21 if you look at neuronal cells, and you compare what's going on in muscle,
00:32:23.07 in every case, one can find changes in the core machinery, either because a particular component
00:32:28.28 like one of the TBP-associated factors is highly upregulated (that means its concentration went way up,
00:32:35.15 when all the other ones went down), or some other permutation.
00:32:39.09 In other words, clearly, components of the so-called core machinery were variable from cell type to cell type,
00:32:46.20 and that really changed the way we thought about how regulation of multicellular organisms works.
00:32:54.28 At the same time that we were looking at these,
00:32:57.17 what we would call mature, terminally differentiated cell types,
00:33:01.20 we were also looking at perhaps one of the most interesting cell types that we could study,
00:33:06.18 particularly if we're interested in understanding the process of mammalian development,
00:33:11.23 and those are of course the embryonic stem cells.
00:33:14.14 These are those amazing cells that, when tickled with just the right chemicals or physiological signals,
00:33:21.08 can turn themselves into every cell type of an organism, maybe 10,000 different cell types.
00:33:31.06 So, this so-called pluripotency made these human and mouse embryonic stem cells very special for all kinds of reasons,
00:33:41.05 partly because they are amazing models to study this process of development and differentiation,
00:33:46.18 but partly because of biomedical possibilities for cell regeneration and therapeutics.
00:33:57.02 So we've studied this, and these are very, very new studies,
00:34:01.27 and I'll just very quickly touch on it. We really were curious,
00:34:05.23 how can these cells be so pluripotent?
00:34:09.08 That is, their capacity to turn into every other cell type seems so amazing, what is the mechanism,
00:34:15.07 what's the machinery that's going to allow these cells to be able to differentiate into every cell type in the body?
00:34:22.16 And so, we began to probe this.
00:34:24.27 In some cases, we did it by the genetic technology, which is we made
00:34:29.08 mutations in certain candidate regulatory factors and transcription factors,
00:34:34.10 and then asked, does that have a consequence on the development of different cell types?
00:34:41.10 In other cases, we used a standard biochemical complementation technology to figure out what's going on.
00:34:47.21 So, I'll finish with two quick stories.
00:34:51.06 So, using the genetic tools of knocking genes out and asking
00:34:55.02 what effect it has on differentiation and pluripotency, we discovered that
00:35:01.15 a component of the core machinery (or at least we used to think of it as being purely of the core machinery),
00:35:07.07 that is, one of the TBP-associated factors, particularly TAF3,
00:35:11.26 turns out to be extremely important for the regulation and
00:35:15.23 expression of genes that will ultimately define the so-called endoderm.
00:35:23.17 And that's true for both the so-called primitive endoderm and the definitive endoderm,
00:35:28.04 which ultimately will give rise to the placenta, the yolk sac, lungs, liver,
00:35:32.12 pancreas, intestines, and so forth.
00:35:34.17 At the same time, knocking out this TAF3 had the opposite effect on the other two major germ layers,
00:35:42.09 which are the mesoderm and the ectoderm.
00:35:44.13 So here was a really beautiful case of differential function of a transcription factor
00:35:50.28 that was not a standard sequence-specific binding protein.
00:35:55.09 This core machinery factor, which by the way, probably on its own doesn't even bind to DNA directly,
00:36:01.20 when you knock it out, you lose the ability to form endoderm,
00:36:05.22 but you elevate the probabilities of forming mesoderm and ectoderm.
00:36:09.18 In other words, the balance between these different cell types gets messed up,
00:36:13.20 and of course this will cause major difficulties for a developing embryo.
00:36:21.16 Even more interesting and intriguing, and this really goes to show the level of information that we still lack,
00:36:28.15 although TAF3 was originally defined both genetically
00:36:32.04 and biochemically as part of the TFIID core promoter recognition complex,
00:36:37.02 and it is absolutely true that that is the case,
00:36:40.04 it had another life that it led that we didn't know about.
00:36:43.17 So TAF3, it turns out, it doesn't have to strictly function as part of this large multi-subunit core promoter complex,
00:36:52.17 but it can also do other jobs, and in this case, it pairs up, or partners up,
00:36:57.06 with a different transcription factor called CTCF (doesn't really matter what the name is)
00:37:03.02 and now it does its job in a completely different way.
00:37:06.16 And in fact, the most recent experiments suggest that TAF3 and CTCF get together
00:37:12.03 to partly allow that amazing property of long-distance regulation.
00:37:17.25 So, regulators bound at thousands of base pairs away from the site of activity
00:37:24.21 can be brought together in three-dimensional space by what's known as "DNA looping,"
00:37:31.04 and it turns out that TAF3 is involved in this DNA looping, together with a whole bunch of other proteins,
00:37:38.00 whose relationship to TAF3 is still not entirely clear.
00:37:45.02 And we find it particularly intriguing and exciting that this type of long-distance function is being
00:37:50.06 carried by a TAF and in the context of embryonic stem cell differentiation potential to form endoderm.
00:37:57.19 So this is a very, very new type of way of thinking about the core transcription factors.
00:38:06.11 Likewise, when we looked at the embryonic stem cell transcriptional circuitry and asked,
00:38:13.20 what other transcriptional co-regulators, or regulators and co-factors,
00:38:17.18 are necessary to allow this so-called pluripotency program?
00:38:23.01 This amazing ability of these cells to be able to differentiate into every other cell type,
00:38:27.03 how does that happen? What is allowing that to happen
00:38:30.23 in this particular cell type, and not in other cell types?
00:38:33.23 And again, using the biochemical complementation technology,
00:38:38.00 we recently were able to identify a new co-factor complex, again a multi-subunit complex,
00:38:45.15 called the SCC, or "stem cell co-factor."
00:38:49.25 And remarkably, this SCC-B turns out to be a well-known protein that again had a different lifestyle in other cell types.
00:38:59.18 It's a protein complex that had previously been described as XPC,
00:39:03.29 which stands for "Xeroderma pigmentosum, complex C,"
00:39:08.22 which means that it's involved in DNA repair.
00:39:11.07 So up until now, we thought XPC was only functioning as a DNA repair complex,
00:39:16.14 and now we know that it's doing something quite different,
00:39:19.12 but only in the context of ES cells, which is to form a co-factor complex that will potentiate
00:39:25.27 the activity of two critical transcriptional activators, Oct4 and Sox2,
00:39:31.21 which define the pluripotent, self-renewing state of ES cells.
00:39:36.20 So these are just two examples of sort of what we're learning about,
00:39:41.21 the continuing saga of how transcriptional machinery evolved and works in animal cells.
00:39:50.26 And I'll finish with this last model slide,
00:39:54.00 which just simply reiterates what I just said:
00:39:57.00 We have to keep in mind that, in generating large sets of combinatorial, specific gene networks,
00:40:07.07 we have to use the diversity not only of sequence-specific DNA-binding proteins,
00:40:11.29 but we more and more see examples that components of the previously thought to be invariant core machinery
00:40:19.14 are an integral part of diversifying the combinatorial regulation of gene expression.
00:40:26.18 And this of course opens up many new possibilities,
00:40:30.08 and I suspect that there are many question marks yet about what exactly each of these components
00:40:36.27 is doing to drive complex regulation that gives rise to complexity like human beings,
00:40:44.12 the human brain, all the physiology that goes on.
00:40:48.03 And of course, as we understand these mechanisms in greater detail,
00:40:51.23 I think we have a much better chance of tackling the problems of human disease and diseases of other organisms.
00:40:59.10 Because ultimately, we have to understand the molecular basis of disease,
00:41:03.21 and I think a big part of that is understanding the mechanisms of gene regulation.

  • Part 1: Gene Regulation: An Introduction

Difference between Eukaryotic and Prokaryotic Promoters

In prokaryotes, the promoter consists of two short sequences at -10 and -35 positions up­stream from the transcription start site.

I. The sequence at -10 is called the Pribnow box, or the -10 element, and usually consists of the six nucleotides TATAAT. The Pribnow box is absolutely essential to start transcrip­tion in prokaryotes (Fig. 8.6).

ii. The other sequence at -35 (the -35 element) usually consists of the six nucleotides TTGACA. Its presence allows a very high transcription rate.

Difference # Eukaryotic Promoters:

Eukaryotic promoters are extremely diverse and are difficult to characterize. They typically lie upstream of the gene and can have regulatory elements several kilobases away from the transcriptional start site. In eukaryotes, the transcriptional complex can cause the DNA to bend hack on itself, which allows for placement of regulatory sequences far from the actual site of transcription. Many eukaryotic promoters, contain a TATA box (sequence TA- TAAA), which in turn binds a TATA binding protein which assists in the formation of the RNA polymerase transcriptional complex. The TATA box typically lies very close (Fig. 8.7) to the transcriptional start site (often within 50 bases).

Promoters in eukaryotic organisms- e.g. plants, animals- comprise multiple elements, some of which are found in nearly all promoters (Table 8.3).

A consensus sequence close to -80 bp from the start point (+1). It plays an important role in promoter efficiency, by increasing its strength, and it seems to function in either orientation. This box is replaced in plants by a consensus sequence called the AGGA box.

A sequence usually located around 25 bp upstream of the start point. The TATA box tends to be surrounded by GC rich sequences. The TATA box binds RNA polymerase II and a series of transcription factors [TFIIX, X being a letter that identifies an individual transcription factor (TF)] to form an initiation complex.

A sequence rich in guanidine (G) and cytidine (C) nucleotides, is usually found in multiple copies in the promoter region, normally surrounding the TATA box.

A transcription initiation sequence or start point defined as +1, at which the transcription process actually starts.

RNA polymerase II is the enzyme that transcribes a gene into RNA. It works in conjunc­tion with other transcription factors that recognize signals embodied in the promoter region. RNA polymerase II starts its “journey” at the TATA region where it binds and travels along the DNA until it reaches the CAP site where the actual synthesis of RNA starts. The tran­scription process only takes place in the downstream direction, from 5′ (left) to 3′ (right).


D2. Control of Transcription in Prokaryotes - Biology

An organism's DNA encodes all of the RNA and protein molecules required to construct its cells. Yet organisms are able to differentially express their genes to make cell-specific products necessary for cellular development at specific times. In the next section, we'll look at these processes in eukaryotic cells for now, we'll focus on the regulatory processes governing gene expression in prokaryotes&mdashrules that are necessary in determining which subset of genes are selectively expressed or silenced in the prokaryotic cell.

The simplest example of an on–off switch that regulates gene expression levels in prokaryotes was discovered in E. coli. E. coli regulates the expression of many genes according to food sources that are available in the environment. For example, five genes in E. coli encode for enzymes that manufacture the amino acid tryptophan, and these are arranged in a cluster on the chromosome. By sharing a single common promoter region on the DNA sequence, these genes are transcribed as a group. This type of structure is called an operón&mdasha cluster of genes transcribed as a single mRNA this particular cluster in E. coli es conocido como el trp operón. Operons are incredibly common in the prokaryotic cell.

los Jacob–Monod Model is used to describe the structure and function of operons. In this model, operons contain structural genes, an operator site, a promoter site, and a regulator gene, as shown in Figure 7.14. los structural gene codes for the protein of interest. Upstream of the structural gene is the operator site, a nontranscribable region of DNA that is capable of binding a repressor protein. Further upstream is the promoter site, which is similar in function to promoters in eukaryotes: it provides a place for RNA polymerase to bind. Furthest upstream is theregulator gene, which codes for a protein known as the repressor. There are two types of operons: inducible systems and repressible systems.

Figura 7.14. Inducible Systems Allow for gene transcription only when an inducer is present to bind the otherwise present repressor protein.

CONCEPTO CLAVE

Operons include both inducible and repressible systems, and offer a simple on–off switch for gene control in prokaryotes.

En inducible systems, the repressor is bound tightly to the operator system and thereby acts as a roadblock. RNA polymerase is unable to get from the promoter to the structural gene because the repressor is in the way. To remove that block, an inducer must bind the repressor protein so that RNA polymerase can move down the gene, as shown in Figure 7.14. Inducible systems operate on a principle analogous to competitive inhibition for enzyme activity: as the concentration of the inducer increases, it will pull more copies of the repressor off of the operator region, freeing up those genes for transcription. This system is useful because it allows gene products to be produced only when they are needed. Inducible systems are sometimes referred to as control positivo mechanisms.

A classic example of an inducible system is the laca operon, which contains the gene for lactase, as demonstrated in Figure 7.15. Bacteria can digest lactose, but it is more energetically expensive than digesting glucose. Therefore, bacteria only want to use this option if lactose is high and glucose is low. los laca operon is induced by the presence of lactose thus, these genes are only transcribed when it is useful to the cell.

los laca operon is assisted by binding of the catabolite activator protein (GORRA). CAP is a transcriptional activator used by E. coli when glucose levels are low to signal that alternative carbon sources should be used. Falling levels of glucose cause an increase in the signaling molecule cyclic AMP (cAMP), which binds to CAP. This induces a conformational change in CAP that allows it to bind the promoter region of the operon, further increasing transcription of the lactase gene.

Figura 7.15. The lac Operon An example of an inducible system.

Repressible systems allow constant production of a protein product. In contrast to the inducible system, the repressor made by the regulator gene is inactive until it binds to a copresor. This complex then binds the operator site to prevent further transcription, as shown in Figure 7.16. Repressible systems tend to serve as negative feedback often, the final structural product can serve as a corepressor. Thus, as its levels increase, it can bind the repressor, and the complex will attach to the operator region to prevent further transcription of the same gene. Repressible systems are sometimes referred to as control negativo mechanisms.

CONCEPTO CLAVE

Positive control is accomplished by inducible systems, in which a repressor is removed from the operon by the inducer to promote transcription of a gene. Negative control is accomplished by repressible systems, in which a repressor–corepressor complex binds to the operon to prevent transcription.

los trp operon, described above, operates in this way. When tryptophan is high in the local environment, it acts as a corepressor. The binding of two molecules of tryptophan to the repressor causes the repressor to bind the operator site. Thus, the cell turns off its machinery to synthesize its own tryptophan, which is an energetically expensive process because of its easy availability in the environment.

Figura 7.16. Repressible Systems Continually allow gene transcription unless a corepressor binds to the repressor to stop transcription.

MCAT Concept Check 7.4:

Antes de continuar, evalúe su comprensión del material con estas preguntas.

1. What type of operon is the trp operón? los laca operón?

2. From 5&prime to 3&prime, what are the components of the operon, and what are their roles?

3. What is required to turn on a positive control system? What is required to turn off a negative control system?

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Networks of transcriptional regulation

With genome-wide technologies becoming more accessible and increasingly high throughput, it is becoming possible to analyze how multiple factors together contribute to transcriptional regulation across a genome. For example, Frank Pugh (Pennsylvania State University) described the use of ChIP-chip to identify occupancies of 200 factors at each of the 6,000 genes in yeast. Approximately 600 genes had 75 or more proteins bound. When genes regulated by Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) were compared with transcription factor IID (TFIID)-regulated genes, the SAGA genes had a larger repertoire of bound factors, and these were also present at higher levels. Pugh also described ChIP-exo, which incorporates exonuclease digestion into a ChIP-seq assay to map transcription factor binding sites with base-pair resolution. Approximately 95% of Reb1 occupancy sites identified with this technique were within 1 bp of a Reb1 cognate sequence.

Bas van Steensel (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, the Netherlands) defined different types of chromatin domains on the basis of differential occupancies of 53 proteins across the Drosophila genome using DNA adenine methyltransferase identification (DamID). Hidden Markov modeling of the 53-dimensional dataset revealed five chromatin domains defined by unique combinations of proteins. The most surprising domain occupied about 55% of the genome, showed little transcriptional activity but no known repressive chromatin modifications, and is poorly understood. Interestingly, preferences emerged for which chromatin domain is adjacent to other chromatin domains.

To analyze and ultimately understand regulatory processes in a global manner, Frank Holstege (University Medical Center Utrecht, the Netherlands) described the use of high-throughput microarray experiments to define mRNA profiles after knockout of signaling pathway components and transcription machinery in yeast, with approximately 1,000 knockouts analyzed so far. Analyses of gene expression from cells with double-deletions of kinases and phosphatases have revealed three phenotypes of expression: complete redundancy, quantitative redundancy, and incongruent redundancy. The latter category was unexpected yet is relatively common and can arise from partial redundancy between two factors coupled to unidirectional inhibition of one factor by the other.

Rather than focusing on multiple transcription factors, work presented by Michael Wilson (Cambridge Research Institute, Cancer Research UK, Cambridge, UK) focused on multiple genomes. With the goal of exploring the evolution of gene regulation, he used ChIP-seq against two transcription factors (CCAAT enhancer binding protein alpha (CEBPA) and hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4A)) and determined their locations across five vertebrate genomes. The data revealed significant differences in factor occupancy between species. Ultraconserved binding events that aligned in all five species occurred only rarely. When an expected binding event was missing in one species, occupancy by that factor within 10 kb was observed only about half the time. From this work, the plasticity of regulatory interactions during divergence among vertebrates is emerging.

Lastly, the network of transcriptional control in response to estrogen stimulation was described by Lee Kraus (Cornell University). His laboratory used GRO-seq to determine how the map of transcriptionally engaged Pol II molecules changes in human breast cancer cells during a time course of estrogen treatment. The sensitivity of this approach meant that they could identify about tenfold more protein-coding genes rapidly regulated by estrogen than did microarrays. Moreover, the data revealed changes in Pol I and Pol III transcripts, divergent transcription, antisense transcription, microRNA transcription, and transcription from non-genic regions. From these data a new picture of signal-induced transcriptional regulation emerges that was not obtainable using previous genomic technologies.

In summary, this meeting was filled with applications of genomic technologies that revealed new insight into mechanisms of transcriptional regulation, involving paused polymerases, chromatin structure, and the interplay between many protein factors.


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