Información

Difusión de lípidos

Difusión de lípidos



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Las células epiteliales del intestino delgado absorben lípidos mediante difusión simple, pero ¿cómo se produce la difusión de lípidos en primer lugar si son insolubles en agua? Pensé que las sustancias deben disolverse para tener concentración y, por lo tanto, un gradiente de concentración.


Figura 1. Estructura de fosfolípidos. Una molécula de fosfolípido consta de una "cabeza" de fosfato polar, que es hidrófila y una "cola" de lípidos no polares, que es hidrófoba. Los ácidos grasos insaturados producen torceduras en las colas hidrófobas.

los membrana celular es una estructura extremadamente flexible compuesta principalmente de fosfolípidos consecutivos (una "bicapa"). El colesterol también está presente, lo que contribuye a la fluidez de la membrana, y hay varias proteínas incrustadas dentro de la membrana que tienen una variedad de funciones. Una sola molécula de fosfolípido tiene un grupo fosfato en un extremo, llamado "cabeza", y dos cadenas de ácidos grasos una al lado de la otra que forman las colas lipídicas (Figura 1). El grupo fosfato está cargado negativamente, lo que hace que la cabeza sea polar e hidrófila, o "amante del agua".

A hidrofílico molécula (o región de una molécula) es aquella que se siente atraída por el agua. Por tanto, las cabezas de fosfato son atraídas por las moléculas de agua de los entornos extracelular e intracelular. Las colas de lípidos, por otro lado, no están cargadas o son apolares, y son hidrófobas o "temerosas del agua".

A hidrofóbico molécula (o región de una molécula) se repele y es repelida por el agua. Algunas colas de lípidos consisten en ácidos grasos saturados y algunas contienen ácidos grasos insaturados. Esta combinación se suma a la fluidez de las colas que están en constante movimiento. Los fosfolípidos son, por tanto, moléculas anfipáticas.

Un anfipático La molécula es aquella que contiene una región tanto hidrófila como hidrófoba. De hecho, el jabón funciona para eliminar las manchas de aceite y grasa porque tiene propiedades anfipáticas. La porción hidrófila se puede disolver en agua mientras que la porción hidrófoba puede atrapar grasa en micelas que luego se pueden lavar.

Figura 2. Bicapa de fospolípidos. La bicapa de fosfolípidos consta de dos láminas adyacentes de fosfolípidos, dispuestas cola con cola. Las colas hidrofóbicas se asocian entre sí, formando el interior de la membrana. Las cabezas polares entran en contacto con el fluido dentro y fuera de la celda.

La membrana celular consta de dos capas adyacentes de fosfolípidos. Las colas de lípidos de una capa se enfrentan a las colas de lípidos de la otra capa, encontrándose en la interfaz de las dos capas. Las cabezas de fosfolípidos miran hacia afuera, una capa expuesta al interior de la celda y una capa expuesta al exterior (Figura 2).

Debido a que los grupos fosfato son polares e hidrófilos, son atraídos por el agua del líquido intracelular. Líquido intracelular (ICF) es el interior fluido de la celda. Los grupos fosfato también son atraídos por el líquido extracelular. Líquido extracelular (ECF) es el entorno fluido fuera del recinto de la membrana celular. Líquido intersticial (IF) es el término que se le da al líquido extracelular que no se encuentra dentro de los vasos sanguíneos. Debido a que las colas lipídicas son hidrófobas, se encuentran en la región interna de la membrana, excluyendo el líquido intracelular y extracelular acuoso de este espacio. La membrana celular tiene muchas proteínas, así como otros lípidos (como el colesterol), que están asociados con la bicapa de fosfolípidos. Una característica importante de la membrana es que permanece fluida; los lípidos y las proteínas de la membrana celular no están rígidamente bloqueados en su lugar.

Proteínas de membrana

La bicapa lipídica forma la base de la membrana celular, pero está salpicada de varias proteínas. Dos tipos diferentes de proteínas que se asocian comúnmente con la membrana celular son las proteínas integrales y la proteína periférica (Figura 3). Como sugiere su nombre, un Proteína integral es una proteína que está incrustada en la membrana. A proteína de canal es un ejemplo de una proteína integral que permite selectivamente que materiales particulares, como ciertos iones, entren o salgan de la célula.

Figura 3. Membrana celular. La membrana celular de la célula es una bicapa de fosfolípidos que contiene muchos componentes moleculares diferentes, incluidas proteínas y colesterol, algunos con grupos de carbohidratos unidos.

Otro grupo importante de proteínas integrales son las proteínas de reconocimiento celular, que sirven para marcar la identidad de una célula para que pueda ser reconocida por otras células. A receptor es un tipo de proteína de reconocimiento que puede unirse selectivamente a una molécula específica fuera de la célula, y esta unión induce una reacción química dentro de la célula. A ligando es la molécula específica que se une a un receptor y lo activa. Algunas proteínas integrales cumplen funciones duales como receptor y canal iónico. Un ejemplo de interacción receptor-ligando son los receptores de las células nerviosas que se unen a neurotransmisores, como la dopamina. Cuando una molécula de dopamina se une a una proteína receptora de dopamina, se abre un canal dentro de la proteína transmembrana para permitir que ciertos iones fluyan hacia la célula.

Algunas proteínas integrales de la membrana son glicoproteínas. A glicoproteína es una proteína que tiene moléculas de carbohidratos unidas, que se extienden hacia la matriz extracelular. Las etiquetas de carbohidratos adjuntas a las glicoproteínas ayudan en el reconocimiento celular. Los carbohidratos que se extienden desde las proteínas de la membrana e incluso desde algunos lípidos de la membrana forman colectivamente el glucocáliz.

los glucocáliz es una capa de apariencia borrosa alrededor de la célula formada a partir de glicoproteínas y otros carbohidratos adheridos a la membrana celular. El glucocáliz puede tener varias funciones. Por ejemplo, puede tener moléculas que permitan que la célula se una a otra célula, puede contener receptores para hormonas o puede tener enzimas para descomponer los nutrientes. Los glicocálculos que se encuentran en el cuerpo de una persona son productos de la composición genética de esa persona. Le dan a cada uno de los billones de células del individuo la "identidad" de pertenencia al cuerpo de la persona. Esta identidad es la principal forma en que las células de defensa inmunológica de una persona "saben" que no deben atacar las células del propio cuerpo de la persona, pero también es la razón por la que los órganos donados por otra persona pueden ser rechazados.

Proteínas periféricas se encuentran típicamente en la superficie interna o externa de la bicapa lipídica, pero también se pueden unir a la superficie interna o externa de una proteína integral. Estas proteínas suelen realizar una función específica para la célula. Algunas proteínas periféricas en la superficie de las células intestinales, por ejemplo, actúan como enzimas digestivas para descomponer los nutrientes en tamaños que pueden pasar a través de las células hacia el torrente sanguíneo.

Transporte a través de la membrana celular

Una de las grandes maravillas de la membrana celular es su capacidad para regular la concentración de sustancias dentro de la célula. Estas sustancias incluyen iones como Ca 2+, Na +, K + y Cl - nutrientes que incluyen azúcares, ácidos grasos y aminoácidos y productos de desecho, particularmente dióxido de carbono (CO2), que debe salir de la celda. La estructura bicapa lipídica de la membrana proporciona el primer nivel de control. Los fosfolípidos están fuertemente empaquetados y la membrana tiene un interior hidrofóbico. Esta estructura hace que la membrana sea selectivamente permeable.

Permeabilidad selectiva

Una membrana que tiene permeabilidad selectiva permite que solo las sustancias que cumplan ciertos criterios pasen a través de él sin ayuda. En el caso de la membrana celular, solo los materiales apolares relativamente pequeños pueden moverse a través de la bicapa lipídica (recuerde, las colas lipídicas de la membrana son apolares). Algunos ejemplos de estos son otros lípidos, gases de oxígeno y dióxido de carbono y alcohol. Sin embargo, los materiales solubles en agua, como la glucosa, los aminoácidos y los electrolitos, necesitan algo de ayuda para cruzar la membrana porque son repelidos por las colas hidrófobas de la bicapa de fosfolípidos. Todas las sustancias que se mueven a través de la membrana lo hacen mediante uno de dos métodos generales, que se clasifican en función de si se requiere energía o no.

Paso pasivo y activo a través de la membrana celular

Transporte pasivo es el movimiento de sustancias a través de la membrana sin gasto de energía celular. A diferencia de, transporte activo es el movimiento de sustancias a través de la membrana utilizando energía del trifosfato de adenosina (ATP).

Transporte pasivo

Los procesos pasivos no utilizan ATP, pero necesitan algún tipo de fuerza impulsora. Suele ser de energía cinética en forma de gradiente de concentración. Las moléculas tenderán a moverse de concentraciones altas a bajas por el movimiento aleatorio de moléculas. Hay 3 tipos principales de procesos pasivos.

En orden para entender cómo Las sustancias se mueven pasivamente a través de la membrana celular, es necesario comprender los gradientes de concentración y la difusión. A gradiente de concentración es la diferencia de concentración de una sustancia en un espacio. Las moléculas (o iones) se esparcirán / difundirán desde donde están más concentradas hasta donde están menos concentradas hasta que se distribuyan por igual en ese espacio. (Cuando las moléculas se mueven de esta manera, se dice que se mueven abajo su gradiente de concentración.) Difusión es el movimiento de partículas de un área de mayor concentración a un área de menor concentración. Un par de ejemplos comunes ayudarán a ilustrar este concepto. Imagínese estar dentro de un baño cerrado. Si se rociara una botella de perfume, las moléculas de olor se difundirían naturalmente desde el lugar donde dejaron la botella a todos los rincones del baño, y esta difusión continuaría hasta que no quedara más gradiente de concentración. Otro ejemplo es una cucharada de azúcar colocada en una taza de té. Con el tiempo, el azúcar se difundirá por todo el té hasta que no quede ningún gradiente de concentración. En ambos casos, si la habitación es más cálida o el té más caliente, la difusión ocurre aún más rápido ya que las moléculas chocan entre sí y se extienden más rápido que a temperaturas más frías. Tener una temperatura corporal interna de alrededor de 98.6 ° F también ayuda en la difusión de partículas dentro del cuerpo.

Siempre que una sustancia exista en mayor concentración en un lado de una membrana semipermeable, como las membranas celulares, cualquier sustancia que pueda descender por su gradiente de concentración a través de la membrana lo hará. Considere las sustancias que pueden difundirse fácilmente a través de la bicapa lipídica de la membrana celular, como los gases oxígeno (O2) y compañía2. O2 generalmente se difunde en las células porque está más concentrado fuera de ellas, y el CO2 normalmente se difunde fuera de las células porque está más concentrado dentro de ellas. Ninguno de estos ejemplos requiere energía por parte de la célula y, por lo tanto, utilizan el transporte pasivo para moverse a través de la membrana. Antes de continuar, debe revisar los gases que pueden difundirse a través de la membrana celular. Debido a que las células consumen oxígeno rápidamente durante el metabolismo, generalmente hay una concentración más baja de O2 dentro de la celda que fuera. Como resultado, el oxígeno se difundirá desde el líquido intersticial directamente a través de la bicapa lipídica de la membrana y hacia el citoplasma dentro de la célula. Por otro lado, debido a que las células producen CO2 como subproducto del metabolismo, CO2 las concentraciones aumentan dentro del citoplasma, por lo tanto, CO2 pasará de la célula a través de la bicapa lipídica y al líquido intersticial, donde su concentración es menor. Este mecanismo de propagación de moléculas desde donde están más concentradas hasta donde están menos concentradas es una forma de transporte pasivo llamado difusión simple (Figura 4).

Figura 4. Difusión simple a través de la membrana celular (plasma). La estructura de la bicapa lipídica permite que solo pequeñas sustancias no polares como el oxígeno y el dióxido de carbono pasen a través de la membrana celular, en su gradiente de concentración, por simple difusión.

Los solutos disueltos en agua a ambos lados de la membrana celular tenderán a difundirse en sus gradientes de concentración, pero debido a que la mayoría de las sustancias no pueden pasar libremente a través de la bicapa lipídica de la membrana celular, su movimiento está restringido a los canales de proteínas y a los mecanismos de transporte especializados en la membrana. . Difusión facilitada es el proceso de difusión utilizado para aquellas sustancias que no pueden atravesar la bicapa lipídica debido a su tamaño y / o polaridad (Figura 5). Un ejemplo común de difusión facilitada es el movimiento de glucosa al interior de la célula, donde se utiliza para producir ATP. Aunque la glucosa puede estar más concentrada fuera de una célula, no puede atravesar la bicapa lipídica por difusión simple porque es grande y polar. Para resolver esto, una proteína transportadora especializada llamada transportador de glucosa transferirá moléculas de glucosa a la célula para facilitar su difusión hacia el interior.

Figura 5. Difusión facilitada. (a) La difusión facilitada de sustancias que atraviesan la membrana celular (plasmática) tiene lugar con la ayuda de proteínas como las proteínas del canal y las proteínas transportadoras. Las proteínas de canal son menos selectivas que las proteínas transportadoras y, por lo general, discriminan levemente entre su carga en función del tamaño y la carga. (b) Las proteínas portadoras son más selectivas, a menudo solo permiten que se cruce un tipo particular de molécula.

Aunque los iones de sodio (Na +) están muy concentrados fuera de las células, estos electrolitos están polarizados y no pueden atravesar la bicapa lipídica no polar de la membrana. Su difusión se ve facilitada por proteínas de membrana que forman canales de sodio (o "poros"), de modo que los iones de Na + pueden descender por su gradiente de concentración desde el exterior de las células hacia el interior de las células. Hay muchos otros solutos que deben someterse a una difusión facilitada para pasar al interior de una célula, como los aminoácidos, o para salir de una célula, como los desechos. Dado que la difusión facilitada es un proceso pasivo, no requiere gasto de energía por parte de la célula. El agua también puede moverse libremente a través de la membrana celular de todas las células, ya sea a través de los canales de proteínas o deslizándose entre las colas lipídicas de la propia membrana.

Osmosises la difusión del agua a través de una membrana semipermeable (Figura 6).

Figura 6. Ósmosis. La ósmosis es la difusión de agua a través de una membrana semipermeable a lo largo de su gradiente de concentración. Si una membrana es permeable al agua, aunque no a un soluto, el agua igualará su propia concentración al difundirse al lado de menor concentración de agua (y por lo tanto al lado de mayor concentración de soluto). En el vaso de precipitados de la izquierda, la solución del lado derecho de la membrana es hipertónica.

El movimiento de las moléculas de agua no está regulado en sí mismo por las células, por lo que es importante que las células estén expuestas a un entorno en el que la concentración de solutos fuera de las células (en el líquido extracelular) sea igual a la concentración de solutos dentro de las células ( en el citoplasma). Se dice que dos soluciones que tienen la misma concentración de solutos son isotónico (igual tensión). Cuando las células y sus entornos extracelulares son isotónicos, la concentración de moléculas de agua es la misma fuera y dentro de las células, y las células mantienen su forma (y función) normal. La ósmosis ocurre cuando hay un desequilibrio de solutos fuera de una célula frente a dentro de la célula. Una solución que tiene una mayor concentración de solutos que otra solución se dice que es hipertónico, y las moléculas de agua tienden a difundirse en una solución hipertónica (Figura 7). Las células en una solución hipertónica se marchitarán cuando el agua abandone la célula por ósmosis. Por el contrario, una solución que tiene una concentración de solutos más baja que otra solución se dice que es hipotónico, y las moléculas de agua tienden a difundirse fuera de una solución hipotónica. Las células en una solución hipotónica absorberán demasiada agua y se hincharán, con el riesgo de estallar eventualmente. Un aspecto crítico de la homeostasis en los seres vivos es crear un entorno interno en el que todas las células del cuerpo se encuentren en una solución isotónica. Varios sistemas de órganos, en particular los riñones, trabajan para mantener esta homeostasis.

Figura 7. Concentración de soluciones. Una solución hipertónica tiene una concentración de soluto más alta que otra solución. Una solución isotónica tiene una concentración de soluto igual a otra solución. Una solución hipotónica tiene una concentración de soluto más baja que otra solución.

Otro mecanismo además de la difusión para transportar materiales pasivamente entre compartimentos es la filtración. A diferencia de la difusión de una sustancia desde donde está más concentrada a menos concentrada, la filtración usa un gradiente de presión hidrostática que empuja el fluido (y los solutos dentro de él) desde un área de mayor presión a un área de menor presión. La filtración es un proceso extremadamente importante en el cuerpo. Por ejemplo, el sistema circulatorio utiliza la filtración para mover el plasma y las sustancias a través del revestimiento endotelial de los capilares y hacia los tejidos circundantes, suministrando los nutrientes a las células. La presión de filtración en los riñones proporciona el mecanismo para eliminar los desechos del torrente sanguíneo.

Transporte activo

Acaba de terminar de investigar los métodos de transporte pasivos, ahora veamos los métodos activos. En los métodos activos, la célula debe gastar energía (ATP) para realizar el trabajo de mover moléculas. El transporte activo a menudo ocurre cuando la molécula se mueve en contra de su gradiente de concentración o cuando se mueven moléculas muy grandes hacia el exterior de la célula. Hay 3 tipos principales de procesos activos.

Durante el transporte activo, se requiere ATP para mover una sustancia a través de una membrana, a menudo con la ayuda de transportadores de proteínas, y generalmente contra su gradiente de concentración. Uno de los tipos más comunes de transporte activo involucra proteínas que sirven como bombas. La palabra "bomba" probablemente evoca pensamientos sobre el uso de energía para inflar el neumático de una bicicleta o una pelota de baloncesto. De manera similar, la energía del ATP es necesaria para que estas proteínas de membrana transporten sustancias (moléculas o iones) a través de la membrana, generalmente en contra de sus gradientes de concentración (de un área de baja concentración a un área de alta concentración). los bomba de sodio-potasio, que también se llama N + / K + ATPasa, transporta el sodio fuera de la célula mientras mueve el potasio al interior de la célula. La bomba de Na + / K + es una importante bomba de iones que se encuentra en las membranas de muchos tipos de células. Estas bombas son particularmente abundantes en las células nerviosas, que constantemente bombean iones de sodio y atraen iones de potasio para mantener un gradiente eléctrico a través de sus membranas celulares. Un gradiente electrico es una diferencia de carga eléctrica en un espacio. En el caso de las células nerviosas, por ejemplo, el gradiente eléctrico existe entre el interior y el exterior de la célula, con el interior cargado negativamente (alrededor de -70 mV) con respecto al exterior. El gradiente eléctrico negativo se mantiene porque cada bomba de Na + / K + mueve tres iones Na + fuera de la célula y dos iones K + dentro de la célula por cada molécula de ATP que se utiliza (Figura 8). Este proceso es tan importante para las células nerviosas que representa la mayor parte de su uso de ATP.

Figura 8. Bomba de sodio y potasio. La bomba de sodio-potasio se encuentra en muchas membranas celulares (plasmáticas). Impulsada por ATP, la bomba mueve los iones de sodio y potasio en direcciones opuestas, cada uno contra su gradiente de concentración. En un solo ciclo de la bomba, se extruyen tres iones de sodio y se importan dos iones de potasio a la celda.

Otras formas de transporte activo no involucran portadores de membrana. Endocitosis (traer "dentro de la célula") es el proceso en el que una célula ingiere material envolviéndolo en una parte de su membrana celular y luego pellizcando esa parte de la membrana (Figura 9). Una vez pellizcada, la porción de membrana y su contenido se convierte en una vesícula intracelular independiente. A vesícula es un saco membranoso, un orgánulo esférico y hueco delimitado por una membrana bicapa lipídica. La endocitosis a menudo introduce materiales en la célula que deben descomponerse o digerirse. Fagocitosis ("Comer células") es la endocitosis de partículas grandes. Muchas células inmunes participan en la fagocitosis de patógenos invasores. Como los pequeños Pac-men, su trabajo es patrullar los tejidos del cuerpo en busca de materia no deseada, como células bacterianas invasoras, fagocitarlas y digerirlas. En contraste con la fagocitosis, pinocitosis ("Beber de las células") lleva líquido que contiene sustancias disueltas a una célula a través de vesículas de membrana.

Figura 9. Tres formas de endocitosis. La endocitosis es una forma de transporte activo en el que una célula envuelve materiales extracelulares utilizando su membrana celular. (a) En la fagocitosis, que es relativamente no selectiva, la célula absorbe una partícula grande. (b) En la pinocitosis, la célula absorbe pequeñas partículas en un líquido. (c) Por el contrario, la endocitosis mediada por receptores es bastante selectiva. Cuando los receptores externos se unen a un ligando específico, la célula responde endocitosando el ligando.

Figura 10. Exocitosis. La exocitosis es muy parecida a la endocitosis a la inversa. El material destinado a la exportación se empaqueta en una vesícula dentro de la célula. La membrana de la vesícula se fusiona con la membrana celular y el contenido se libera al espacio extracelular.

La fagocitosis y la pinocitosis absorben grandes porciones de material extracelular y, por lo general, no son muy selectivas en las sustancias que aportan. Las células regulan la endocitosis de sustancias específicas a través de la endocitosis mediada por receptores. Endocitosis mediada por receptores es la endocitosis por una parte de la membrana celular que contiene muchos receptores que son específicos para una determinada sustancia. Una vez que los receptores de superficie se han unido a cantidades suficientes de la sustancia específica (el ligando del receptor), la célula endocitará la parte de la membrana celular que contiene los complejos receptor-ligando. El hierro, un componente necesario de la hemoglobina, es endocitosado por los glóbulos rojos de esta manera. El hierro se une a una proteína llamada transferrina en la sangre. Los receptores de transferrina específicos en la superficie de los glóbulos rojos se unen a las moléculas de hierro-transferrina y la célula endocitosa los complejos receptor-ligando. En contraste con la endocitosis, exocitosis (sacar “fuera de la célula”) es el proceso de una célula que exporta material mediante transporte vesicular (Figura 10).

Muchas células fabrican sustancias que deben secretarse, como una fábrica que fabrica un producto para la exportación. Estas sustancias normalmente se empaquetan en vesículas unidas a la membrana dentro de la célula. Cuando la membrana de la vesícula se fusiona con la membrana celular, la vesícula libera su contenido en el líquido intersticial. La membrana de la vesícula pasa a formar parte de la membrana celular. Las células del estómago y el páncreas producen y secretan enzimas digestivas a través de la exocitosis (Figura 11). Las células endocrinas producen y secretan hormonas que se envían por todo el cuerpo, y ciertas células inmunitarias producen y secretan grandes cantidades de histamina, una sustancia química importante para las respuestas inmunitarias.

Figura 11. Células pancreáticas y productos enzimáticos n. ° 8217. Las células acinares pancreáticas producen y secretan muchas enzimas que digieren los alimentos. Los diminutos gránulos negros en esta micrografía electrónica son vesículas secretoras llenas de enzimas que se exportarán de las células a través de la exocitosis. LM × 2900. (Micrografía proporcionada por los Regentes de la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan © 2012)

Enfermedades de la célula: fibrosis quística

La fibrosis quística (FQ) afecta aproximadamente a 30.000 personas en los Estados Unidos, y cada año se informan alrededor de 1.000 casos nuevos. La enfermedad genética es más conocida por su daño a los pulmones, que causa dificultades respiratorias e infecciones pulmonares crónicas, pero también afecta el hígado, el páncreas y los intestinos. Hace solo unos 50 años, el pronóstico para los niños que nacían con FQ era muy desalentador, una esperanza de vida que rara vez superaba los 10 años. Hoy en día, con los avances en el tratamiento médico, muchos pacientes con FQ viven hasta los 30 años.

Los síntomas de la FQ son el resultado de un mal funcionamiento de un canal de iones de membrana llamado regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística o CFTR. En personas sanas, la proteína CFTR es una proteína de membrana integral que transporta los iones Cl - fuera de la célula. En una persona que tiene FQ, el gen del CFTR está mutado, por lo tanto, la célula fabrica una proteína de canal defectuosa que normalmente no se incorpora a la membrana, sino que la célula la degrada. El CFTR requiere ATP para funcionar, por lo que su transporte de Cl - es una forma de transporte activo. Esta característica desconcertó a los investigadores durante mucho tiempo porque los iones Cl - en realidad fluyen abajo su gradiente de concentración cuando se transporta fuera de las células. El transporte activo generalmente bombea iones. contra su gradiente de concentración, pero el CFTR presenta una excepción a esta regla. En el tejido pulmonar normal, el movimiento de Cl - fuera de la célula mantiene un ambiente rico en Cl - cargado negativamente inmediatamente fuera de la célula. Esto es particularmente importante en el revestimiento epitelial del sistema respiratorio.

Las células epiteliales respiratorias secretan moco, que sirve para atrapar polvo, bacterias y otros desechos. Un cilio (plural = cilios) es uno de los apéndices parecidos a pelos que se encuentran en ciertas células. Los cilios en las células epiteliales mueven el moco y sus partículas atrapadas por las vías respiratorias lejos de los pulmones y hacia el exterior. Para que se mueva efectivamente hacia arriba, el moco no puede ser demasiado viscoso, sino que debe tener una consistencia fina y acuosa. El transporte de Cl - y el mantenimiento de un ambiente electronegativo fuera de la célula atraen iones positivos como Na + al espacio extracelular. La acumulación de iones Cl - y Na + en el espacio extracelular crea un moco rico en solutos, que tiene una baja concentración de moléculas de agua. Como resultado, a través de la ósmosis, el agua se mueve desde las células y la matriz extracelular hacia el moco, "adelgazándolo". Así es como, en un sistema respiratorio normal, el moco se mantiene lo suficientemente diluido como para ser expulsado del sistema respiratorio.

Si el canal CFTR está ausente, los iones Cl - no se transportan fuera de la célula en cantidades adecuadas, lo que les impide atraer iones positivos. La ausencia de iones en el moco secretado da como resultado la falta de un gradiente de concentración de agua normal. Por lo tanto, no hay presión osmótica que atraiga agua al moco. El moco resultante es espeso y pegajoso, y el epitelio ciliado no puede eliminarlo eficazmente del sistema respiratorio. Los conductos de los pulmones se bloquean con moco, junto con los desechos que transporta. Las infecciones bacterianas ocurren más fácilmente porque las células bacterianas no se eliminan eficazmente de los pulmones.


C1. Dinámica de membranas

Las moléculas no son estáticas, sino dinámicas. Esto también se aplica a los agregados moleculares. En la primera parte de la sección, discutiremos el movimiento rígido de moléculas lipídicas completas en una bicapa, dentro de un folíolo y entre folíolos. En la segunda parte y el siguiente suplemento, consideraremos el movimiento de los átomos dentro de una molécula. Los movimientos incluyen movimientos como flexión de enlace, estiramiento de enlace y cambios de ángulo de torsión como vimos en la sección del capítulo anterior sobre las conformaciones del n-butano. La posición de todos los átomos dentro de una molécula se puede simular en función del tiempo, una simulación de dinámica molecular. Dichos movimientos afectan la energía de la molécula, que se puede calcular para determinadas posiciones de los átomos utilizando la mecánica molecular clásica y la electrostática.

Los liposomas y las bicapas en general deben ser algo dinámicos, de lo contrario serían barreras impenetrables a través de las cuales nada podría pasar. Las membranas celulares deben separar el exterior de una célula del interior, pero también deben permitir el paso de moléculas e incluso iones a través de la membrana. ¿Cuál es la evidencia de que las membranas son dinámicas?

Primero, los lípidos pueden difundirse lateralmente en la membrana. Esto se puede demostrar de la siguiente manera. Haga un liposoma de fosfatidiletanolamina, PE, que ha sido marcado con TNBS (Trinitrobencensulfonato). El NH2 en el grupo principal de PE puede unir el TNBS que sufre una sustitución aromática nucleofílica con la expulsión del SO3-2. El grupo TNB unido al grupo de cabeza de PE absorbe la luz ultravioleta y emite luz de mayor longitud de onda en un proceso llamado fluorescencia. A continuación, utilizando un microscopio fluorescente, se puede registrar la intensidad de la fluorescencia de una región de la superficie. Luego, haga brillar un láser en un área pequeña de la superficie, que puede fotoblanquear la fluorescencia en el área. Con el tiempo, se puede volver a detectar fluorescencia en la región. La velocidad a la que regresa es una medida de la difusión lateral de los lípidos marcados en la región. Los lípidos pueden experimentar difusión lateral a una velocidad de aproximadamente 2 mm / s. Esto implica que los lípidos pueden transitar por la superficie de una bacteria en 1 segundo.

La difusión transversal o en flip-flop (movimiento de un fosfolípido de una hoja a otra, no dentro de una hoja determinada) debería ser más difícil. Experimentalmente, esto se investiga como se muestra en los siguientes diagramas.

Experimentos con liposomas: para probar la difusión de flip-flop en una membrana artificial, los liposomas se fabrican con una mezcla de PC y un derivado de PC con una etiqueta de giro de nitróxido (tiene un solo electrón desapareado). Tanto los folletos internos como los externos de la membrana tienen la etiqueta PC. Como un protón en la espectroscopia de RMN, un solo electrón tiene un espín que puede dar lugar a una señal de resonancia de espín de electrones (ESR) (como un protón da lugar a una señal de resonancia magnética nuclear) cuando se irradia con la frecuencia adecuada de radiación electromagnética (microondas frecuencia para ESR, radiofrecuencia para RMN) en presencia de un campo magnético. Los liposomas se mantienen a 0oC y se determina la señal de VSG. Se añade a los liposomas ácido ascórbico, una vitamina soluble en agua y un agente antioxidante / reductor. Esto reduce la PC etiquetada con espín en el prospecto exterior, pero no en el prospecto interior de la bicapa, ya que el ácido ascórbico no puede entrar en el liposoma ni interactuar con él. Esto reduce la señal de ESR a un valor constante más bajo. La muestra se divide en dos. Una muestra se deja a 0oC y la otra se eleva a 30oC. La señal de ESR se registra en función del tiempo. La preparación a 0 ° C no muestra cambios en la ESR con el tiempo, mientras que la señal de ESR de la preparación a 30 ° C disminuye con el tiempo. Esta disminución se debe a la difusión en flip-flop del PC marcado desde el prospecto interior al exterior, y la subsiguiente reducción por el ácido ascórbico. Estos experimentos en sistemas experimentales de dos capas como los liposomas muestran que la difusión en flip-flop es órdenes de magnitud más lenta que la difusión lateral.

Figura: Difusión Flip / Flop en liposomas A: Fabricación de vesículas con análogo de PC activo de ESR solo en el prospecto exterior

Figura: Difusión flip / flop en liposomas B: aumento de la temperatura para iniciar la difusión flip / flop

Experimentos celulares: se puede realizar un experimento análogo con bacterias. Se agrega 32 PO4 radiomarcado a las células durante un minuto, lo que conduce al marcaje del fosfolípido (PL) recién sintetizado que se localiza en el prospecto interno. Luego, las células se dividen en dos muestras. Una muestra se hace reaccionar inmediatamente con TNBS, que marcará solo PE en el prospecto exterior. La otra muestra se incuba durante 3 minutos (para permitir la síntesis de PL) y luego se hace reaccionar con TNBS. Después de un breve período de marcado, las células se destruyen mediante la adición de disolventes orgánicos que previenen la biosíntesis de nuevos lípidos. Los lípidos se extraen en el disolvente y luego se someten a TLC.

Los lípidos se pueden etiquetar de tres formas. Algunos se etiquetarán con 32 P solo, algunos con TNBS solo y algunos con 32P y TNBS. La TLC (u otras técnicas como HPLC o GC) pueden separar fácilmente la PC y la PC marcada con TNBS, ya que tienen estructuras diferentes y, por lo tanto, migrarán a diferentes lugares en una placa de TLC. Sin embargo, ninguna técnica cromatográfica podría separar PC y 32 P-PC, ya que su estructura molecular es la misma, con la única diferencia en los núcleos de la P (diferente número de neutrones).

Aquellos lípidos con etiquetas dobles (TNB y 32 P) deben haberse volteado desde el folíolo interno al folículo externo donde podrían etiquetarse con TNBS. Las células incubadas durante 3 minutos antes de la adición de TNBS tienen un nivel mucho más alto de PL doblemente marcadas. La cuantificación de estos datos en función de diferentes tiempos de incubación a temperaturas elevadas muestra que la tasa de difusión de flip-flop es mucho mayor en las células que en los liposomas, lo que sugiere que el proceso está catalizado, presumiblemente por un transportador de proteínas (flipasa o transportador de anfipato transbicapa). - TAT) en células.

Figura: Difusión flip / flop en células bacterianas A: Etiquetado de fosfolípidos de las valvas internas con 32 P

Figura: Difusión Flip / Flop en células bacterianas B: Etiquetado de células en A con TNBS para detectar Flip / Flop


Hay dos clases principales de proteínas transportadoras de membrana: portadoras y canales.

Al igual que las bicapas lipídicas sintéticas, las membranas celulares permiten que el agua y las moléculas apolares penetren por simple difusión. Sin embargo, las membranas celulares también tienen que permitir el paso de varias moléculas polares, como iones, azúcares, aminoácidos, nucleótidos y muchos metabolitos celulares que cruzan las bicapas lipídicas sintéticas muy lentamente. Las proteínas de transporte de membrana especiales son responsables de transferir tales solutos a través de las membranas celulares. Estas proteínas se encuentran en muchas formas y en todo tipo de membranas biológicas. Cada proteína transporta una clase particular de molécula (como iones, azúcares o aminoácidos) y, a menudo, solo ciertas especies moleculares de la clase. La especificidad de las proteínas de transporte de membrana se indicó por primera vez a mediados de la década de 1950 mediante estudios en los que se encontró que las mutaciones de un solo gen abolían la capacidad de las bacterias para transportar azúcares específicos a través de su membrana plasmática. Ahora se han descubierto mutaciones similares en humanos que padecen una variedad de enfermedades hereditarias que afectan el transporte de un soluto específico en el riñón, el intestino o muchos otros tipos de células. Individuos con la enfermedad hereditaria cistinuria, por ejemplo, son incapaces de transportar ciertos aminoácidos (incluida la cistina, el dímero de cisteína ligado a disulfuro) desde la orina o el intestino a la sangre, la acumulación resultante de cistina en la orina conduce a la formación de cálculos de cistina en los riñones. .

Se ha descubierto que todas las proteínas de transporte de membrana que se han estudiado en detalle son proteínas transmembrana de múltiples pasos, es decir, sus cadenas polipeptídicas atraviesan la bicapa lipídica varias veces. Al formar una ruta proteica continua a través de la membrana, estas proteínas permiten que solutos hidrófilos específicos atraviesen la membrana sin entrar en contacto directo con el interior hidrófobo de la bicapa lipídica.

Las proteínas transportadoras y las proteínas de los canales son las dos clases principales de proteínas transportadoras de membrana. Proteínas portadoras (también llamadas portadores, penetra, o transportadores) se unen al soluto específico que se va a transportar y experimentan una serie de cambios conformacionales para transferir el soluto unido a través de la membrana (figura 11-3). Las proteínas del canal, por el contrario, interactúan con el soluto para ser transportadas mucho más débilmente. Forman poros acuosos que se extienden a través de la bicapa lipídica cuando estos poros están abiertos, permiten que solutos específicos (por lo general iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados) pasen a través de ellos y, por lo tanto, atraviesen la membrana (véase la figura 11-3). No es sorprendente que el transporte a través de las proteínas del canal se produzca a una velocidad mucho más rápida que el transporte mediado por las proteínas transportadoras.

Figura 11-3

Proteínas portadoras y proteínas de canal. (A) Una proteína transportadora alterna entre dos conformaciones, de modo que el sitio de unión del soluto es secuencialmente accesible en un lado de la bicapa y luego en el otro. (B) Por el contrario, una proteína de canal forma una (más.)


Biología de nivel: movimiento a través de las membranas celulares

Las membranas celulares son una barrera para la mayoría de las sustancias, y esta barrera permite que los materiales se excluyan de las células, es decir, permite que el entorno intracelular se mantenga separado del entorno extracelular. Las membranas celulares también permiten que las cosas se empaqueten dentro de las células; piense en todos esos orgánulos celulares como las mitocondrias, los ribosomas y los ácidos nucleicos como el ADN y el ARN.

La compartimentación celular también es esencial para la vida, ya que permite que se produzcan todas esas reacciones bioquímicas que de otro modo no podrían tener lugar; recuerde que el citoplasma de las células es un lugar muy ocupado, no solo proporciona el citosol para & # 39; acomodar & # 39 orgánulos, ¡pero también es el lugar en el que tiene lugar mucha bioquímica celular! y no olvides que las células eucariotas también pueden compartimentar materiales dentro de orgánulos (por ejemplo, mitocondrias y cloroplastos).

Entonces, las células tienen esta barrera. esta membrana celular, pero obviamente las cosas necesitan poder entrar y salir de las células, y hay varios métodos por los cuales las sustancias pueden moverse a través de la membrana celular.

Difusión de lípidos (también conocida como difusión simple / pasiva).

Vesículas (por ejemplo, exocitosis y pinocitosis).

Biología de un nivel: difusión simple / pasiva

¡Compruebe dónde encaja esta lección en la especificación de su examen!

En esta lección aprendimos acerca de la difusión pasiva (también puede conocer esto como difusión de lípidos, ya que las sustancias se difunden directamente a través de la bicapa de fosfolípidos, o puede que la conozca como simple difusión antigua. De cualquier manera, solo unas pocas sustancias pueden difundirse directamente a través de la bicapa de fosfolípidos). bicapa lipídica parte de la membrana celular.

Las únicas sustancias que pueden hacer esto son las moléculas solubles en lípidos, como los esteroides, o las moléculas muy pequeñas, como el agua, el oxígeno y el dióxido de carbono.

mv2.png / v1 / fill / w_142, h_170, al_c, usm_0.66_1.00_0.01, blur_2 / Passive% 20Diffusion% 20Image% 201.png "/>

Para estas moléculas, la membrana celular no es una gran barrera en absoluto. Dado que la difusión de lípidos es (obviamente) un proceso de difusión pasiva, es decir, NO hay ENERGÍA involucrada y las sustancias solo pueden moverse hacia abajo en su gradiente de concentración.

La difusión pasiva (de lípidos) no puede ser controlada por la célula, en el sentido de que está encendida o apagada (regulada), como por ejemplo, el transporte activo puede ser regulado por la célula.

También debe comenzar a pensar en la difusión en términos del efecto que tienen el Área de superficie y la Distancia en la tasa de difusión.

La relación entre el tamaño de un organismo (o estructura) y la relación Área de superficie: volumen: la importancia de esto para el intercambio de sustancias y de calor es importante para comprender y aplicar a muchas áreas de la biología. Para empezar, piense en las células de los organismos multicelulares que pueden diferenciarse y adaptarse para funciones específicas. Los tejidos son agregaciones de células similares y los órganos son estructuras que realizan funciones fisiológicas específicas. Las adaptaciones de las formas corporales en los organismos y el desarrollo de sistemas multicelulares en organismos más grandes son adaptaciones que facilitan los intercambios a medida que se reduce la relación Superficie: Volumen.

Es importante tener en cuenta el área de superficie: la relación de volumen (SA: V) a medida que aprende sobre las diversas formas en que las sustancias se mueven a través de las membranas celulares y, en particular, es la razón por la que los sistemas de intercambio de gases han evolucionado en organismos multicelulares más grandes.

El desarrollo de superficies internas de intercambio de gases en organismos más grandes ha evolucionado para mantener tasas de intercambio adecuadas.

Los organismos con superficies internas de intercambio de gases necesitan sistemas para transportar gases entre el medio ambiente y estas superficies. Es importante que pueda considerar estas estructuras y adaptaciones en términos de función (de las superficies / sistemas de intercambio de gases) en relación con el entorno en el que los organismos se han adaptado para vivir.

Por ejemplo, considere comparar y contrastar los sistemas de intercambio de gases de los mamíferos (alvéolos, bronquiolos, bronquios, tráquea, pulmones) con el sistema de ventilación de los peces óseos (laminillas branquiales y filamentos branquiales, y el principio contracorriente). Compare cómo los insectos terrestres con sus sistemas traqueales intercambian gases respiratorios con su entorno. No se olvide de las formas en las que las hojas de las plantas dicotiledóneas (mesófilo y estomas) también intercambian gases: ¿cómo se comparan y contrastan estas adaptaciones entre sí (¿por qué no crear una bonita tabla que muestre las similitudes y diferencias?)

A estas alturas, a medida que aprende acerca de los muchos temas de su biología A-Level, debería darse cuenta del alcance y la profundidad de este tema vasto e interconectado y es una buena idea comenzar a pensar desde el principio sobre el tema de manera integral, o quotsinópticamente. Haga las conexiones, mapas mentales, tablas para comparar y contrastar y enumere ideas para escribir ensayos sinópticos. (Según lo que ha aprendido hasta ahora, puede comenzar a agregar & # 39 más & # 39 a medida que aumenta su comprensión y cobertura de los temas).

Biología de nivel: difusión facilitada

¡Compruebe dónde encaja esta lección en la especificación de su examen!

En esta lección aprendimos sobre la difusión facilitada. Aprendimos que

La difusión facilitada es un proceso pasivo en el que el transporte de sustancias a través de una membrana es asistido (es decir, facilitado) por una proteína transmembrana.

La difusión facilitada es un proceso de difusión pasiva.

¡Recordar! El hecho de que las proteínas de membrana estén involucradas en la difusión de moléculas a través de la membrana celular NO significa que se necesite energía.

En la difusión facilitada, NO se requiere energía y las sustancias se difunden a través de la membrana celular con la ayuda de proteínas de membrana, PERO, las moléculas solo pueden moverse hacia abajo en su gradiente de concentración.

Hay dos tipos de proteínas de transporte:

Las proteínas de canal forman un poro o canal lleno de agua en la membrana.

Esto permite que las sustancias cargadas, típicamente iones, se difundan a través de las membranas celulares.

La mayoría de los canales se pueden bloquear (abrir o cerrar), lo que permite que la celda controle la entrada y salida de iones.

Las proteínas transportadoras tienen un sitio de unión para una molécula específica, las proteínas transportadoras & # 39flip & # 39 entre dos estados, de modo que el sitio de unión está alternativamente abierto a los lados opuestos de la membrana. Las sustancias se unen a la proteína transportadora en el lado de la membrana celular donde se encuentra en una alta concentración y se liberan en el lado de la membrana celular donde la concentración es baja.

Factores que afectan la tasa de difusión pasiva y facilitada

¡Compruebe dónde encaja esta lección en la especificación de su examen!

Verifique las especificaciones de su examen

★ Referencia de la especificación AQA: - 3.2.3 Transporte a través de las membranas celulares. El movimiento a través de las membranas se produce por: difusión simple (que implica limitaciones impuestas por la naturaleza de la bicapa de fosfolípidos). Las células pueden adaptarse para un transporte rápido a través de sus membranas internas o externas mediante un aumento en el área de superficie de, o un aumento en el número de canales de proteínas y moléculas portadoras en sus membranas.

★ Referencia de especificación CIE: - 4 Membranas celulares y transporte. 4.2 Movimiento de sustancias dentro y fuera de las células: a) describir y explicar los procesos de difusión.

★ Referencia de la especificación de Edexcel (Biología A & ndash Salters-Nuffield): - Tema 2: Genes y salud: 2.4 i) Comprender qué se entiende por transporte pasivo (difusión).

★ Referencia de especificación de Edexcel (Biología B): - Tema 4: Intercambio y transporte. 4.2 Mecanismos de transporte celular: ii Comprender cómo la difusión produce el transporte pasivo.

★ Referencia de la especificación OCR (Biología A): - Módulo 2: Fundamentos en biología: 2.1.5 Membranas biológicas. (d) (i) el movimiento de moléculas a través de membranas: Incluir la difusión y la difusión facilitada como métodos pasivos.

★ Referencia de la especificación OCR (Biología B): - Módulo 2: Células, productos químicos para la vida, transporte e intercambio de gases. (I) el movimiento de moléculas a través de las membranas plasmáticas. Incluir la difusión y la difusión facilitada como métodos pasivos de transporte a través de membranas.

★ Referencia de la especificación WJEC: - Conceptos básicos: 3. Membranas celulares y transporte. Resumen: Las membranas celulares son esenciales en el control del movimiento de sustancias dentro y fuera de la célula. También juegan un papel vital en el reconocimiento celular. (c) los siguientes mecanismos de transporte: difusión y factores que afectan la velocidad de difusión.

★ Referencia de la especificación AQA: - 3.2.3 Transporte a través de las membranas celulares. El movimiento a través de las membranas se produce por: Difusión facilitada (que implica limitaciones impuestas por la naturaleza de la bicapa de fosfolípidos). Las células pueden adaptarse para el transporte rápido a través de sus membranas internas o externas mediante un aumento en el área de superficie de, o un aumento en el número de canales de proteínas y moléculas portadoras en sus membranas.

★ Referencia de especificación CIE: - 4 Membranas celulares y transporte. 4.2 Movimiento de sustancias dentro y fuera de las células: a) describir y explicar los procesos de difusión facilitada.

★ Referencia de especificación de Edexcel (Biología A & ndash Salters-Nuffield): - Tema 2: Genes y salud: 2.4 i) Comprender qué se entiende por transporte pasivo (difusión y difusión facilitada).

★ Referencia de especificación de Edexcel (Biología B): - Tema 4: Intercambio y transporte. 4.2 Mecanismos de transporte celular: ii Comprender cómo se produce el transporte pasivo mediante Difusión y Difusión facilitada.

★ Referencia de la especificación OCR (Biología A): - Módulo 2: Fundamentos en biología: 2.1.5 Membranas biológicas. (d) (i) el movimiento de moléculas a través de las membranas: Incluir la difusión y la difusión facilitada como métodos pasivos.

★ Referencia de la especificación OCR (Biología B): - Módulo 2: Células, productos químicos para la vida, transporte e intercambio de gases. (I) el movimiento de moléculas a través de las membranas plasmáticas. Incluir la difusión y la difusión facilitada como métodos pasivos de transporte a través de membranas.

★ Referencia de la especificación WJEC: - Conceptos básicos: 3. Membranas celulares y transporte. Resumen: Las membranas celulares son esenciales en el control del movimiento de sustancias dentro y fuera de la célula. También juegan un papel vital en el reconocimiento celular. (c) los siguientes mecanismos de transporte: difusión, difusión facilitada y factores que afectan la velocidad de difusión.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de tejidos

Se cultivaron células PtK2 en DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado con suero bovino fetal al 15% (FBS Sigma-Aldrich) y 1% de l -glutamina (Sigma-Aldrich). Las células CHO se cultivaron en DMEM / F12 (Lonza) suplementado con FBS al 10% y l-glutamina al 1%. Se cultivaron células T Jurkat en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) que contenía FBS al 10%, l-glutamina al 1% y ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 10 mM. Las células RBL se cultivaron en DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado con FBS al 10% y l-glutamina al 1%. Para la producción de GPMV, las células se cultivaron en placas de Petri de 30 mm, y para las mediciones de difusión en células vivas, se cultivaron en cubreobjetos redondos de 18 o 25 mm (nº 1.5). Por lo general, las células alcanzaron una confluencia del 50 al 70% antes de que se realizara la medición.

Etiquetado celular

Las células se marcaron en medio L15 sin rojo fenol (Sigma-Aldrich) a una concentración de lípidos de 1 μg / ml (Atto647N-DPPE, -SM, -DOPE) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de dos lavados con L15, las mediciones se realizaron inmediatamente. El marcaje con Atto647N-H-GM1 se realizó en medio completo (2 μg / ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Los análogos de lípidos no estaban acoplados con albúmina de suero bovino (BSA).

Los análogos de lípidos Atto647N-DOPE, Atto647N-DPPE y Atto647N-SM se adquirieron de Atto-Tec. Atto647N-GM1 (C18: 1, C18: 0) fue sintetizado por Guenter Schwartzmann (Universidad de Bonn, Bonn, Alemania Eggeling et al., 2009). TF-Chol se adquirió de Avanti Polar Lipids. Las transfecciones para células PtK2 se realizaron usando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher) y las transfecciones para células CHO se realizaron usando Turbofect (Thermo Fisher), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Ver Ozhan et al. (2013) para Lypd6-GFP y Lypd-RFP. GPI-SNAP fue un regalo del laboratorio de Stefan Hell (Instituto Max Planck de Química Biofísica, Göttingen, Alemania), VAMP7 se obtuvo del Wolfson Imaging Center (Oxford, Reino Unido) y se obtuvieron GPI-GFP y GPI-RFP del laboratorio de Kai Simons (Instituto Max Planck de Biología Celular Molecular y Genética, Dresde, Alemania).

El etiquetado de GPI-RFP o Lypd6-RFP se realizó con un nanocuerpo de unión a RFP marcado con Atto647N (ChromoTek). El nanocuerpo se diluyó a 100 μg / ml en BSA al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenó a 4 ° C. El marcaje se realizó a una concentración final de 1 µg / ml.

El etiquetado SNAP con Abberior Star Red (Abberior) se realizó a 2 μg / ml en medio completo a 37 ° C durante 30 min. Después de dos pasos de lavado con medio completo a 37 ° C (30 min cada uno), las mediciones de STED-FCS y la formación de imágenes se realizaron en L15.

El marcado de la máscara celular se realizó añadiendo 0,5 µM (concentración final) CellMask Deep Red (Thermo Fisher) en medio completo. Se incubó durante 15 min a temperatura ambiente y posteriormente se lavó dos veces con L15.

GPMV

Las GPMV derivadas de células se prepararon de acuerdo con Sezgin et al. (2012a). Brevemente, las células se cultivaron hasta una confluencia de ~ 70%, se lavaron con tampón GPMV (que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl 2 mM2, pH 7,4), y después de añadir DTT 2 mM y PFA 25 mM, las células se incubaron durante al menos 4 h (células PtK2) o 2 h (células CHO / RBL) a 37 ° C para permitir que las células produzcan suficiente cantidad de GPMV. En el caso del agente de formación de vesículas NEM, las células se lavaron con tampón GPMV y se incubaron con NEM 2 mM en tampón GPMV durante no más de 2 h. Se prepararon GPMV de células T usando NEM como se describió anteriormente (Koller et al., 2017).

Etiquetado e inmovilización de GPMV

Se recogió el sobrenadante que contenía GPMV. Se añadió DSPE-PEG-biotina (Avanti Polar Lipids) hasta una concentración final de 0,2 µg / ml en la suspensión de GPMV. Después de 1,5 h, las GPMV se marcaron con el análogo lipídico disuelto en etanol Atto647N-DPPE, Atto647N-SM o Atto647N-DOPE. Se agregaron a la solución de GPMV hasta una concentración final de 0,1, 0,2 y 0,14 μg / ml, respectivamente. Se disolvió Atto647N-GM1 en dimetilsulfóxido y se añadió a una concentración final de 4 µg / ml. Después de otros 15 minutos de incubación, las GPMV se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante se reemplazó por tampón nuevo. El último paso fue crucial para la eliminación de lípidos biotinilados libres. Para las mediciones de GPI-RFP o Lypd6-RFP, se añadió un nanocuerpo de unión a RFP marcado con Atto647N a una concentración final de 2 μg / ml antes de girar las GPMV hacia abajo.

Las GPMV se inmovilizaron usando biotina y estreptavidina. Se recubrieron cubreobjetos de vidrio con una mezcla 5: 1 de BSA / BSA biotinilada (Sigma-Aldrich) durante 1,5 h, se lavaron exhaustivamente y se incubaron con una solución de estreptavidina 200 ng / ml (Life Technologies) en PBS. Después de lavar con tampón GPMV, se añadieron las GPMV biotiniladas. Las mediciones se realizaron después de 20 min. Las GPMV inmovilizadas se mantuvieron estables durante varias horas.

La formación de GPMV a partir de otras líneas celulares (CHO o Jurkat) fue mucho más rápida que para PtK2 (en 2 h). De lo contrario, estas GPMV se formaron y trataron de la misma manera. Las GPMV se probaron antes para la separación de fases para asegurarse de que no estaban separadas en fases a temperatura ambiente. Se encontró que las GPMV de las células PtK2 se separaron en fases por debajo de 10 ° C y, por lo tanto, no se separaron en fases a temperatura ambiente (Figura complementaria S4). Se añadieron Fast-DiO (Sigma Aldrich) y Abberior Star Red-PEG-DSPE a GPMV con una concentración final de 100 ng / ml para marcar las fases desordenadas y ordenadas, respectivamente.

Las GUV se prepararon mediante electroformación (García-Saez et al., 2010). Se extendió una solución de DOPC (Avanti Polar Lipids) con una concentración de 1 mg / ml en cloroformo sobre alambres de platino. Después de la evaporación del disolvente, los electrodos se sumergieron en sacarosa 300 mM. Se aplicó un campo eléctrico con una frecuencia de 10 Hz y un potencial de 2 V durante 1 h, seguido de una frecuencia de 2 Hz. Las GUV se manipularon con puntas cortadas y las mediciones se realizaron en PBS. Los cubreobjetos se revistieron con BSA. Las GUV se marcaron añadiendo los análogos de lípidos TopFluor-Cholesterol (Avanti Polar Lipids), Atto47N-DOPE, Atto647N-SM o Atto647N-DPPE hasta una concentración final de 0,05 μg / ml. Se utilizó Atto647N-GM1 a una concentración final de 0,005 µg / ml.

Bicapas lipídicas compatibles

Las bicapas lipídicas soportadas se prepararon mediante recubrimiento por rotación (Clausen et al., 2015). Los cubreobjetos se limpiaron y bordearon previamente con ácido piraña (ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno 3: 1). Los cubreobjetos se almacenaron en agua durante no más de 1 semana.

Se revistió por centrifugación una solución de 1 mg / ml de DOPC en cloroformo / metanol sobre un cubreobjetos a 3200 rpm durante 45 s. La bicapa lipídica se formó mediante rehidratación con tampón SLB que contenía HEPES 10 mM y NaCl 150 mM, pH 7,4. El SLB se etiquetó con AbberiorStar Red-DPPE (relación ∼1: 2000 M Abberior) contenido en la solución inicial de DOPC.

Adquisición y evaluación de datos

Se tomaron imágenes confocales, FCS confocal y mediciones de FCCS en un microscopio confocal invertido Zeiss780 LSM equipado con un objetivo 40 × C-Apochromat NA 1.2 W Corr FCS (Zeiss). Usamos partículas de lipoproteínas de alta densidad etiquetadas (un obsequio de Herbert Stangl, MedUni Wien, Viena, Austria) como control positivo de FCCS y una mezcla de Alexa 488 y Alexa 647 como control negativo para asegurar que el microscopio estuviera alineado y con una correlación cruzada completa. podría obtenerse. Aparte del control de Atto647N-GM1 en GPMV (37 ° C), todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente.

Todos los datos de imágenes STED-FCS y STED se tomaron en un microscopio Abberior STED personalizado (Abberior Instruments) como se describió anteriormente (Clausen et al., 2014 Galiani et al., 2016). El microscopio estaba equipado con un correlador de hardware (Flex02-08D, operado por el software del fabricante Correlator.com). Los tintes se excitaron usando un láser de diodo pulsado de 640 nm (frecuencia de repetición PicoQuant de 80 MHz) con una potencia de excitación promedio de 5-10 μW en el objetivo (UPlanSApo 100 × / 1.4 aceite Olympus). Para las grabaciones STED, la emisión de fluorescencia se inhibió utilizando un láser pulsado sintonizable Mai Tai a 780 nm (velocidad de repetición de 80 MHz Newport) con un patrón de intensidad focal en forma de rosquilla formado por una placa de fase dentro de la trayectoria del haz. El microscopio se operó con el software Imspector de Abberior.

Usando el software de ajuste FoCuS-point (Waithe et al., 2016), todos los datos de FCS sobre la difusión de membrana en SLB, GUV y GPMV se ajustaron a un modelo de difusión bidimensional (2D) que incluye cinética de estado triplete (con un tiempo de relajación fijo de 5 μs). Para las mediciones en la membrana plasmática de las células vivas, se tuvo que suponer una cinética de estado oscuro adicional (con un tiempo de relajación fijo de 100 μs) para los datos de todos los lípidos marcados con Atto647N (como se señala en Mueller et al., 2013). Los datos sobre GFP citoplásmico libre y Lifeact-GFP se ajustaron utilizando una ecuación de difusión tridimensional con uno o dos componentes después de la determinación del parámetro estructural mediante mediciones de Alexa 488 en agua.

En las medidas STED-FCS, el diámetro, D, del punto de observación está sintonizado por la potencia promedio PAGSTED del láser STED. Realizamos mediciones STED-FCS de AbberiorStar Red-DPPE en SLB y GUV en diferentes PAGSTED para calibrar con precisión el D(PAGSTED) Dependencia más específicamente, realizamos estas mediciones de calibración antes de cada experimento en SLB (100% DOPC) para las grabaciones de STED-FCS en células vivas y en GUV (100% DOPC) para aquellas en GPMV. Debido a que AbberiorStar Red-DPPE se difunde libremente en ambas membranas modelo, podemos calcular el D(PAGSTED) dependencia utilizando la siguiente ecuación: y son los tiempos de tránsito de las moléculas investigadas a través del punto de observación en confocal y en una determinada potencia láser STED, respectivamente. El diámetro del punto de observación confocal de D = 240 nm se determinó a partir de imágenes confocales de perlas Crimson de 20 nm (Life Technologies) esparcidas sobre un cubreobjetos de vidrio recubierto de polilisina (Sigma Aldrich).

El coeficiente de difusión (aparente), D, se calculó a partir de y de acuerdo a

At least 5–10 different cells were measured for each probe within a single measurement session, resulting in multiple FCS measurements (5–15 s) at different spots across the cell for every STED power. All measurements were repeated at least three times to confirm the reproducibility. Each single set of measurement was carried out in the same region of the cell at different spot sizes (STED laser powers). Power gradient was applied in the reverse order as well to avoid any artifacts due to the increasing laser power (confocal to high STED power and vice versa). Each data point in the graphs show the average of the different days and different cells. Error bars are the SDs of the mean.

Simulations

We performed Monte Carlo simulations to generate molecular tracks that characterized the different diffusion modes in our investigation. We generated fluorescence traces by passing the generated tracks through Gaussian spots of varying diameter, representative of the effect that different STED powers would have on the detection volume. Simulations were performed in a 2D circular space of radius 2500 nm and iterated using a 0.02-ms time step for a 20-s total duration. One hundred molecules were randomly initiated within the simulation, each with a free diffusion rate of 0.8 µm 2 /s. Molecules that diffused across the simulation boundary were wrapped to the opposite edge of the simulation boundary.

Trap diffusion in the first instance was simulated using a stochastic trapping model in which free diffusion is hindered randomly by molecular complex formation (Ringemann et al., 2009). In this mode, at each time step, we evaluate a probability for switching from the free diffusion state to the hindered state (D = 0.1 × 10 −9 µm 2 /s) and vice versa (in this case, with a probability of pag = 0.002 in both directions) corresponding to rates ksobre = kapagado = 8 × 10 5 for binding and release. For the simulation of hop diffusion, we first generated a mesh by randomly dispersing points on a grid and then applying a Voronoi transform on these points. Enough points were added to yield an average Voronoi region size of 100 nm in diameter (diameter calculated as ). Molecules in the hop diffusion simulation that randomly walked into new regions were only allowed to pass into that region based on probability pagbrincar = 0.25. If, upon evaluation, the molecule failed pagbrincar, it would move randomly in its existing region for that time step, whereas otherwise it would transition into the new region.

The spatial domain trapping simulation—an alternative to trapping through molecular complex formation—was performed by distributing circular domains of diameter 20 nm across the simulation area. Enough domains were distributed to cover 50% of the simulation space, and the positions were randomly perturbed over many iterations to ensure that the distribution of domains was random. Furthermore, during the random perturbation process, the domains were prevented from overlapping through a hard constraint. During the simulation, particles that crossed into or out of the domains would only be allowed to do so after evaluation of a probability test with a probability less than the pagbrincar valor (pag = 0.002), corresponding to the same rate constant as in the stochastic trapping model. During the simulation, particles that crossed into or out of the domains would only do so if, upon evaluation of a probability, the test was less than the pagbrincar valor (pag = 0.002), corresponding to the same rate constant as in the stochastic trapping model. Diffusion inside the circular domains was reduced to Den = D/3.0, one-third of 0.8 µm 2 /s.

For each simulation, 10 random locations for focal spots were chosen, and in each location, nine different focal spots sizes (40–300 nm) were applied each simulation was repeated five times, generating 50 replicates for each focal spot size. Intensity traces were correlated using a multiple-tau correlation algorithm (Wahl et al., 2003) and fitted using the foregoing procedure.


Discusión

The most plausible interpretation of the influence of polymer molar mass and the coexistence of fast and slow diffusion in the same system is that polymer adsorption created nanodomains of lipid whose mobility was determined by the occluded area of the adsorbed polymer. The multivalency of these nanodomains, the multiple potential adsorption sites to which the lipid can bind, localizes lipids because the tendency to adsorb at any individual spot is amplified by the large number of potential binding sites. The data in Fig. 4 show that as norte → 150, D extrapolates to that characteristic of the naked lipid, implying that the slow mode disappears below a critical adsorbate size, the projected area of � lipid head groups. This result also explains why the slow mode disappears at saturated surface coverage: then there no longer exist localized multivalent binding sites. When surface coverage by the adsorbed polymers saturated, the multivalency of the discrete nanodomain situation disappeared. The ensuing homogeneous environment possessed a local binding energy only negligibly different from that of the naked bilayer.

Exploring this argument, we note that the size of these molecular-sized domains can tentatively be estimated from Rgramo, the radius of gyration of the two-dimensional adsorbed polymer. For adsorbed QPVP chains, the persistence length can be estimated as 1.4 nm and the monomer length can be set as 0.26 nm. This estimate implies Rgramo ≈ 4 and 9 nm for the molar masses 18,100 and 81,500 g·mol -1 , respectively, in turn implying surface areas A ≈ 50 and 250 nm 2 , respectively. To put these results into perspective, for those lipids trapped in such nanodomains, these arguments suggest that collective diffusion as a unit replaced the independent diffusion of individual lipid molecules. The translational mobility of a particle embedded in biological membranes has been considered theoretically (22). These experiments show that lipid mobility is itself modified.

In summary, these measurements show how adsorption of objects of variable size modifies the mobility of lipids underneath the adsorbed object. The dependence on molar mass of the adsorbed molecule displays the same phenomenology as the diffusion of that same adsorbed macromolecule diffusion of the lipid appears to be slaved to it. Much prior work has taken the approach of considering the area-average mobility in membranes, but we have shown here that this approach is not always a good one mobility may vary from spot to spot on the membrane surface, despite the lipid composition being the same.

This work offers a mechanism of domain formation in lipid membranes. Traditionally, one thinks of situations where the spatial composition differs in the case of multiple lipid components, owing either to limited miscibility or the presence of stiffness-altering components such as cholesterol (23). The role of ensuing “rafts” in particular sees extensive discussion (24). In the present simpler system, this work shows that the process of polymer adsorption accomplishes this same function. The mechanism is possibly related to the known fact that adsorption modifies the local bending rigidity and the local spontaneous radius of curvature (25). This finding provides a perspective from which to interpret the physical heterogeneity that has been observed repeatedly over the years in more complicated systems involving multiple lipid components (8). By rational extension, there are possible implications for understanding dynamical events that depend on lipid mobility. If this effect generalizes to cellular environments, adsorption of peripheral membrane proteins to the outside of a cell may affect not just the mobility of the lipids underneath but also of those on the other leaflet, on the cytosolic side (and conversely). Similarly, one can imagine that it may have bearing on protein distributions in the membrane and in this manner influence docking, formation of synapses, and other membrane-mediated functions.


PROTEIN TURNOVER AT THE INM: AN ENHANCER OF COMPARTMENTAL IDENTITY?

While membranes play a defining role for compartment identity, compartment-specific proteins carry out specific functions. This poses a key problem for the NE of eukaryotes with an open mitosis, as the repeated breakdown of the NE and nuclear lamina during every mitotic cycle leads to loss of compartment identity by mixing of integral proteins of the ER and INM (Ellenberg et al., 1997). The detailed events underlying NE reformation were reviewed recently (Ungricht and Kutay, 2017). Here we review mechanisms that maintain the NE proteome in interphase after the NE has formed, which is critical for cellular homeostasis since INM proteins that became effectively diluted due to cell duplication or are constantly removed via proteolysis (the average half-life of INM proteins is ∼3–4 d Buchwalter et al., 2019b) need to be replaced. Equally important, particular physiological situations may require tailored compositions of INM proteins, for example in the context of cellular differentiation or stress responses, requiring dynamic adjustments through synthesis, nuclear import, and degradation.

Once the NE has reformed and the permeability barrier of the NPC has been established, INM components replenish the INM protein pool. Those INM proteins that bind lamin can diffuse from the ER to the INM and the reformed nuclear lamina, where they are locally retained by specific interaction with lamins and chromatin (Boni et al., 2015 Ungricht et al., 2015). Importantly, the NPC imposes a diffusion barrier effectively separating the ER and contiguous ONM from the INM by restricting the passage to membrane proteins with cytosolic domains of less than 40–60 kDa (Ohba et al., 2004 Ungricht et al., 2015). The molecular basis accounting for this property of the NPC is currently unknown. Structural information on the NPC-membrane interface at higher resolution is needed to resolve this conundrum. While this diffusion barrier can effectively exclude sizable membrane proteins, membrane proteins with smaller cytosolic domains may also need to be excluded from the INM as their presence there could potentially interfere with INM function.

One possible mechanism to enhance INM identity is to selectively remove proteins that do not belong to the INM and have “breached” the first selectivity filter. Indeed, a specialized branch of the ubiquitin (Ub)/proteasome system (UPS) is operative at the INM in both lower (Deng and Hochstrasser, 2006 Foresti et al., 2014 Khmelinskii et al., 2014) and higher (Tsai et al., 2016 Buchwalter et al., 2019b) eukaryotes, where it performs functions analogous to the ER-associated degradation (ERAD) machinery (Smoyer and Jaspersen, 2019). In brief, a typically polytopic Ub E3 ligase recognizes the substrate destined for degradation and mediates its ubiquitylation in conjunction with an Ub-conjugating enzyme. The ubiquitylated substrate is then extracted from the membrane and delivered to the 26S proteasome for degradation (Vembar and Brodsky, 2008). In yeast, the Asi1/2/3 complex and Doa10 are the E3 ligases responsible for turnover of INM proteins (Deng and Hochstrasser, 2006 Foresti et al., 2014 Khmelinskii et al., 2014) while the AAA+ ATPase Cdc48 and its human orthologue p97 mobilize the polyubiquitylated substrate from the INM in yeast and human cells, respectively (Foresti et al., 2014 Tsai et al., 2016) (Figure 2). The E3 ligases responsible for INM turnover in mammalian cells remain to be identified, though recently developed methodology relying on LBR-based model substrates for INM turnover may aid in their identification through proteomics-based or genome-wide screening approaches (Tsai et al., 2019). Intriguingly, proteasomes were directly observed in association with the NE and in juxtaposition to nuclear pores in Chlamydomonas reinhardtii via cryo-EM tomography (Albert et al., 2017), suggesting important roles for proteolytic systems at these sites. In yeast, the Asi2 subunit specifically recognizes transmembrane domains of orphan subunits of mislocalized ER proteins, leading to their removal from the INM through ubiquitylation, extraction by Cdc48, and subsequent turnover by the 26S proteasome (Natarajan et al., 2019). It will be interesting to test whether the concept of “proteolytic sharpening” of compartmental identity via removal of proteins that “leak” into INM territory extends to the NE of mammalian cells, or even to other compartments.

FIGURE 2: A fusion checkpoint for nuclear pore biogenesis. Nuclear pore assembly after nuclear envelope reformation proceeds through an inside-out protrusion mechanism starting from the nuclear side. Early assembly intermediates contain NPC constituents that deform the inner nuclear membrane (INM). This structure needs to expand to bring the INM and outer nuclear membrane (ONM) in close proximity for fusion. Either the integrity of the NPC assembly intermediate is sensed or the transport competence of a late assembly intermediate is required to initiate fusion. This hypothetical checkpoint mechanism would prevent a transient perturbation of NE integrity and can potentially explain why multiple, distinct NPC assembly defects lead to NE blebs resembling late assembly intermediates that got arrested before fusion (see the text).

The turnover of polytopic membrane proteins from the INM of mammalian cells can be very rapid. The half-life of truncated LBR variants is about ∼10–15 min (Tsai et al., 2016), which is significantly faster than the turnover of unrelated polytopic ERAD substrates, typically in the range of hours (Cambridge et al., 2011). Thus, the INM-resident proteolytic system would be perfectly suited for rapid regulatory switches to initiate, for example, transcriptional responses following physiological stimuli. Given that regulatory proteolysis, such as the processing of transcription factors, plays key roles in mounting transcriptional responses to regulate lipid abundance (Goldstein and Brown, 2015) and phospholipid saturation (Rape et al., 2001), it is tempting to speculate that additional roles of the UPS in lipid sensing or regulation will be identified at the INM. The close proximity to the transcriptional machinery would make the NE an ideal relay station to sense and amplify changes in membrane composition, through either alterations in lipid composition or membrane fluidity caused by packing defects. Similar functions linking mechanosensation to a transcriptional output can be envisioned.


Lipid Diffusion - Biology

Lipids make up the bulk of biological membranes, and it's reasonable to suppose their large numbers greatly influence membrane structure and function. Indeed, it's not too far-fetched to say membrane lipids and their interactions "create" biological membranes. How do such small molecules exert such a large role? To answer this question we need to examine the structure of lipids themselves.

Most cellular lipids are derived chemically from the three-carbon alcohol, glycerol, through covalent linkages with up to three fatty acids. Specifically, a fatty acid may form an ester with each of glycerol's three alcohol residues, and the resulting lipids are called glycerides All membrane glycerides have fatty acid (hydrocarbon or acyl) residues attached to two adjacent glycerol carbons and a polar, often charged, residue linked covalently with the third carbon, and are called diacyl glycerides o simplemente diglycerides. Diglycerides containing phosphate as part of the polar residue are called, not surprisingly, phospholipid. Another major plasma membrane lipid is cholesterol. Different structural representations of these two membrane lipids are presented on the facing page. Note in particular, that both types of molecules consist of regions that are hydrophilic, or water-loving, and hydrophobic, or water-hating.

This schizophrenic nature of membrane lipids seems to be no accident! Scroll through the Table of Membrane Lipids on the next page and note all of the more common forms share this important feature: all membrane lipids have a hydrophobic region as well as a hydrophilic one. The long hydrocarbon chains of the fatty acids (or the fatty-acid like residues) projecting to the left of each lipid will not spontaneously interact with dipolar water molecules (or readily dissolve in aqueous solutions). Conversely, the different residues projecting to the right of each lipid are all polar and will readily interact with water. More technically, membrane lipids are called anfipático molecules, because they possess distinct regions with such different affinities for oil and for water. Even the very hydrophobic and insoluble cholesterol is slightly amphipathic, by virtue of its single alcohol residue.

The amphipathic nature of membrane lipids contrasts strikingly with the neutral triglycerides and cholesterol esters which are more abundant in our bodies than their amphipathic relatives.

How do you think these amphipathic molecules would behave if their concentrations were increased in an aqueous environment? in an organic solvent? at the interface between an aqueous and an organic solvent? Go on to the next page to consider the formation of lipid structures called micelles.


Abstracto

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) measurements are widely used for determination of diffusion coefficients of lipids and proteins in biological membranes. In recent years, several variants of FCS have been introduced. However, a comprehensive comparison of these methods on identical systems has so far been lacking. In addition, there exist no consistent values of already determined diffusion coefficients for well-known or widely used membrane systems. This study aims to contribute to a better comparability of FCS experiments on membranes by determining the absolute diffusion coefficient of the fluorescent lipid analog 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine (DiD) in giant unilamellar vesicles (GUVs) made of dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), which can in future studies be used as a reference value. For this purpose, five FCS variants, employing different calibration methods, were compared. Potential error sources for each particular FCS method and strategies to avoid them are discussed. The obtained absolute diffusion coefficients for DiD in DOPC were in good agreement for all investigated FCS variants. An average diffusion coefficient of D = 10.0 ± 0.4 μm 2 s –1 at 23.5 ± 1.5 °C was obtained. The independent confirmation with different methods indicates that this value can be safely used for calibration purposes. Moreover, the comparability of the methods also in the case of slow diffusion was verified by measuring diffusion coefficients of DiD in GUVs consisting of DOPC and cholesterol.


Ver el vídeo: Difusión simple y facilitada Transporte pasivo (Agosto 2022).