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15.6: La filogenia fúngica - Biología

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Determinar la ascendencia y parentesco de los grupos de hongos es sorprendentemente difícil. Sin embargo, hay algunos grupos principales en los que Kingdom Fungi se divide comúnmente, y estos se discutirán en la siguiente sección.

La siguiente imagen es de una publicación de acceso abierto (doi.org/10.1128/ mBio.01739-16) y presenta una posible hipótesis para las relaciones entre grupos de hongos. Esta hipótesis se llama filogenia y se basa en la genética, así como en las características fisiológicas y morfológicas. Actualmente, todos los micólogos no aceptan una filogenia única.

Chytrids: incluye Chytridiomycota y Blastocladiomycota de la filogenia anterior

Quitridios comprenden los linajes más antiguos de hongos. A diferencia de cualquier otro grupo dentro de este reino, son acuático y tiene esporas de natación (zoosporas) con un solo flagelo. Aunque muchos en este grupo son descomponedores inofensivos, el más famoso de los quítridos es Batrachochytrium dendrobatidis, un hongo que infecta la piel de los anfibios. Este quítrido está contribuyendo a una disminución mundial en muchas especies de anfibios (aunque hay muchos otros factores contribuyentes), particularmente las ranas.

Si está disponible, vea las muestras de quitridios bajo los microscopios de disección y compuestos. ¿Qué características puedes encontrar?

Zigomicetos: incluye todos los hongos divergentes tempranos no flagelados anteriores, excepto Glomeromycotina

Los zigomicetos se componen de al menos dos linajes distintos de hongos que comparten una estructura común durante la reproducción sexual, el zigosporangio. Esta es una estructura grande, ornamentada, de color naranja a marrón donde ocurren tanto la fertilización como la meiosis. Los cigomicetos no tienen tabiques en sus hifas, lo que se conoce como cenocítico. Estos hongos se encuentran comúnmente en sustratos con alto contenido de azúcar, como frutas podridas o pan moldeado, o como insectos parásitos. Los cigomicetos pueden reproducirse asexualmente produciendo mitosporangia (que se muestra a continuación), que produce esporas haploides por mitosis.

Arriba hay tres cigosporangios maduros producidos durante la reproducción sexual de Rhizopus stolonifer. En el centro de la imagen, dos micelios compatibles (+ y -) se han conectado entre sí y actualmente están formando gametangia. Inundarán estos gametangios con núcleos haploides, que se fusionarán dentro del zigosporangio para crear cigotos diploides. Cada uno de estos se someterá inmediatamente a la meiosis para producir esporas haploides.

Vea las muestras de zigomicetos disponibles en el laboratorio y registre sus observaciones a continuación. ¿Qué características le ayudarían a identificar este grupo?

Glomeromycota: listada como Glomeromycotina en la filogenia de hongos

Este linaje único dentro de Kingdom Fungi forma relaciones con las raíces de casi todas las especies de plantas terrestres y los talos de los primeros linajes de plantas, que evolucionaron antes que las raíces. Esta micorriza La relación (mico-que significa hongo, riza que significa raíz) ha existido durante 400 millones de años y probablemente estuvo involucrada en el movimiento de plantas hacia la tierra. Los glomeromicetos se llaman endomicorrícico porque las hifas fúngicas entran dentro de las células vegetales. El hongo ingresa al tejido vegetal, generalmente a través de las raíces, y penetra en las paredes celulares de las células de la corteza en la raíz. Sin embargo, estas hifas no atraviesan la membrana plasmática. En cambio, forman estructuras arbóreas muy ramificadas llamadas arbuscles. Esto proporciona una gran cantidad de superficie para que la planta y el hongo interactúen entre sí. ¿Cómo están interactuando?

Estas imágenes son de un artículo de acceso abierto (doi: 10.1038 / srep29733) que estudia la colonización fúngica de las células vegetales. En la imagen de la derecha, el tejido fúngico se tiñó con un tinte fluorescente. En los dos inferiores (B y C), las hifas de los hongos se tiñeron de oscuro y están formando arbuscules dentro de las paredes celulares de la planta.

Debido a que es un heterótrofo, el hongo toma azúcares de la planta. Las hifas de los hongos se extienden más allá de las raíces de las plantas hacia el suelo, donde pueden absorber el agua y los nutrientes que se transfieren a la planta. Cada socio obtiene un beneficio de esta relación, por lo que esto se llama simbiosis mutualista, o mutualismo.

Una relación simbiótica se refiere a una relación compartida entre al menos dos organismos de diferentes especies. Esta relación puede beneficiar a ambas partes, como se indicó anteriormente, solo beneficiará a una, potencialmente causando daño a la otra. ¿Cómo llamarías a este último tipo de simbiosis?

Observe la punta de una raíz de micorrizas bajo el microscopio compuesto, ya sea como un portaobjetos preparado o de una muestra nueva. Si es de una muestra fresca, use 5% KOH + Phloxine B o Cotton Blue para teñir el tejido fúngico. Dibuja lo que ves a continuación y etiqueta cualquier característica distintiva tanto de la planta como del hongo.

La Dikarya: Ascomycota y Basidiomycota

Estos dos grupos de hongos se conocen como dikarya porque una parte de su ciclo de vida es dicariota. Cuando dos tipos de apareamiento compatibles se encuentran, se fusionan y comienzan el proceso de fertilización con plasmogamia (fusión del citoplasma). Sin embargo, los núcleos no se fusionan. En cambio, se forma un nuevo micelio con dos núcleos haploides diferentes en cada célula, lo que hace que la ploidía n + n (a diferencia de diploide, 2n). Este estado se llama dicariótico. La cariogamia (fusión de los núcleos) no ocurre hasta que el hongo está a punto de producir esporas. Los dos núcleos se fusionan y el cigoto sufre inmediatamente la meiosis, formando esporas haploides.

¿En qué tipo de ciclo de vida clasificaría esto y por qué?

Aunque hay especies microscópicas y etapas de vida en cada grupo (incluida la levadura que vio anteriormente), los miembros de Ascomycota y Basidiomycota forman cuerpos fructíferos macroscópicos. Debido a esto, se tratarán con más detalle en Lab Macrofungi and Lichens.


Candida auris: epidemiología, biología, resistencia a los antifúngicos y virulencia

Descrito por primera vez en 2009 en Japón, el hongo patógeno emergente resistente a múltiples fármacos Candida auris se está convirtiendo en una amenaza para la salud pública mundial que ha atraído una atención considerable debido a su rápida y generalizada aparición durante la última década. Las razones detrás de la reciente aparición de este hongo siguen siendo un misterio hasta la fecha. Los análisis genéticos indican que este hongo patógeno emergió simultáneamente en varios continentes diferentes, donde se aislaron 5 clados genéticamente distintos de C. auris de distintas ubicaciones geográficas. Aunque C. auris pertenece al clado CTG (sus especies constituyentes traducen el codón CTG como serina en lugar de leucina, como en el código estándar), C. auris es una especie fúngica haploide que está más estrechamente relacionada con el haploide y, a menudo, con múltiples fármacos. especies resistentes Candida haemulonii y Candida lusitaniae y está relacionada lejanamente con los hongos patógenos diploides y clínicamente comunes Candida albicans y Candida tropicalis. Las infecciones y los brotes causados ​​por C. auris en entornos hospitalarios han aumentado durante los últimos años. La dificultad en su identificación, las propiedades de resistencia a múltiples fármacos, la evolución de los factores de virulencia, las altas tasas de mortalidad asociadas en los pacientes y la supervivencia a largo plazo en las superficies del entorno hacen que C. auris sea particularmente problemático en entornos clínicos. Aquí, revisamos el progreso realizado durante la última década en los aspectos biológicos y clínicos de C. auris. Los esfuerzos futuros deben dirigirse a comprender los detalles mecánicos de su biología, epidemiología, resistencia a los antifúngicos y patogénesis con el objetivo de desarrollar herramientas y métodos novedosos para la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de las infecciones por C. auris.

Declaracion de conflicto de interes

Clarissa J. Nobile es cofundadora de BioSynesis, Inc., una empresa que desarrolla inhibidores y diagnósticos de biopelículas.

Cifras

Fig 1. Una revisión de la literatura publicada ...

Fig 1. Una revisión de la literatura publicada sobre C . auris entre enero de 2009 y ...

Fig 2. Países con casos notificados de…

Fig 2. Países con casos notificados de C . auris infección o colonización a partir de enero ...


Fondo

Este artículo se ha publicado como corrección de [1]. Después de discutir con los productores de datos y los editores de revistas, eliminamos 9 genomas no publicados de nuestro análisis (Botryobasidium botryosum, Gymnopus luxurians, Sublateritium del hipoloma, Jaapia argillacea, Hebeloma cylindrosporum, Conidiobolus coronatus, Laccaria amethystina, Paxillus involutus, y P. rubicundulus). Las principales conclusiones de nuestro trabajo se mantienen sin cambios. Nos disculpamos por cualquier inconveniente.

Las enzimas activas en carbohidratos (CAZymes) son responsables de la descomposición, biosíntesis o modificación de glicoconjugados, oligo y polisacáridos. Más importante aún, las CAZymes producidas por parásitos juegan un papel central en la síntesis y degradación de la pared celular vegetal, así como en las interacciones huésped-patógeno [2]. En la actualidad, las CAZymes se han agrupado en cuatro clases funcionales: glucósido hidrolasas (GH), glucosiltransferasas (GT), polisacárido liasas (PL) y carbohidrato esterasas (CE) en función de sus módulos catalíticos o dominios funcionales estructuralmente relacionados [2] . Entre ellas, las CAZymes de las clases CE, GH y PL se conocen a menudo como enzimas degradantes de la pared celular (CWDE) debido a su importante función en la descomposición de la biomasa vegetal por hongos y bacterias [3]. Además de los módulos catalíticos, alrededor del 7% de las CAZymes también contienen los módulos de unión a carbohidratos (CBM), que son los módulos no catalíticos más comunes asociados con enzimas activas en la hidrólisis de la pared celular [2].

Los hongos pueden producir todo tipo de CAZymes [2, 4]. Entre ellos, las enzimas que degradan la pared celular de las plantas recibieron especial atención debido a su importancia en los patógenos fúngicos para la penetración e infección exitosa de sus huéspedes. Los carbohidratos liberados de la pared celular de las plantas también pueden proporcionar nutrición para el crecimiento de hongos. De hecho, algunos hongos saprofitos obtienen nutrición para el crecimiento y la reproducción principalmente al degradar los materiales de la pared celular de las plantas con una variedad de CWDE. Varios estudios han revelado que las actividades de las enzimas hidrolíticas de diferentes hongos mostraron preferencias por diferentes tipos de biomasa vegetal y se adaptaron a sus estilos de vida [5, 6]. Cuando se cultivaron en diferentes sustratos, se demostró que varias enzimas degradantes de la biomasa vegetal son producidas por diferentes hongos, incluido el hongo filamentoso modelo. Neurospora crassa[7-13]. Los hongos basidiomicetos de pudrición blanca como Phanerochaete chrysosporium son los principales productores de ligninasas para la descomposición sustancial de la lignina en la madera [14, 15]. Para los patógenos fúngicos, la degradación localizada de la pared celular es necesaria para acceder al citoplasma de la planta y diseminarse a través de los tejidos del huésped. En varios hongos fitopatógenos, se demostró que los CWDE, como las pectinasas y las xilanasas, están relacionados con la patogenicidad o la virulencia [16-18].

Hasta la fecha, se han secuenciado más de un centenar de genomas de hongos y están a disposición del público, incluidos hongos representativos de Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota, y Chytridiomycota. La mayoría de los hongos, excepto los Saccharomycetes y Schizosaccharomycetes, tienen una gran cantidad de genes CWDE que probablemente están involucrados en la infección de las plantas o la supervivencia en el medio ambiente. Algunos genes que codifican enzimas que degradan polisacáridos han expandido a los miembros de la familia en ciertos hongos y se ha demostrado que la redundancia de genes protege funciones críticas [19]. Sin embargo, no se ha informado de un análisis comparativo completo y sistemático de CAZymes en todo el reino fúngico. Además, todavía no está claro si la distribución de CAZymes en hongos está relacionada con los componentes de la pared celular vegetal, aunque se sabe que las paredes celulares vegetales de dicotiledóneas y monocotiledóneas están compuestas de diferentes componentes, particularmente en pectinas y hemicelulosas [6, 20, 21 ].

En este estudio, identificamos y comparamos el repertorio completo de CAZymes de hongos representativos y realizamos una comparación exhaustiva sobre la distribución y abundancia de las familias de CAZyme para obtener pistas sobre su potencial digestivo, especialmente contra los polisacáridos de la pared celular de las plantas. Se analizaron las diferencias en el número y variedad de CAZymes entre hongos saprofitos, parasitarios facultativos, hemi-biotróficos, biotróficos y simbióticos. También se examinó la relación entre el número y la variedad de CAZymes y la estrategia nutricional fúngica y la especificidad del hospedador.


Resultados

Conjunto de datos

Ensamblamos secuencias de codificación de proteínas de plastidios de 360 ​​especies (archivo adicional 1) para las cuales las secuencias del genoma de plastidios completas o casi completas estaban disponibles en GenBank. De las 360 especies, había 258 angiospermas (Angiospermas), 53 gimnospermas (Acrogymnospermae, incluyendo tres Gnetofita), siete monilófitos (Monilophyta), cuatro licofitas (Lycopodiophyta), tres hepáticas (Marchantiophyta), una hornwort (Anthocerotophyta), dos musgos (Bryophyta), seis taxones de las algas estreptofíticas parafiléticas y 26 algas clorofíticas (Clorofita). Las matrices de caracteres filogenéticos contenían secuencias de 78 genes y el siguiente número de posiciones de alineación: 58.347 pb para la matriz que contiene todas las posiciones de nucleótidos (ntAll) y la versión codificada por RY (RY) de la matriz ntAll 38.898 pb en la matriz que contiene solo el posiciones del primer y segundo codón (ntNo3rd) y 19.449 aminoácidos (AA). El número de genes presentes por taxón varió de 18 a 78 (media = 70), mientras que el número de taxones presentes por gen osciló entre 228 y 356 (media = 322 ver archivo adicional 2). Taxa con pocos genes presentes, como Helicosporidium (18 genes) y Rhizanthella (19 genes), representan genomas de plastidios completos altamente modificados de especies no fotosintéticas [70, 71]. El porcentaje de datos faltantes (espacios y caracteres ambiguos) fue

15,6% para cada uno de los cuatro conjuntos de datos. El patrón de datos en cada una de las cuatro matrices es decisivo, lo que significa que puede definir un solo árbol para todos los taxones [72]. Los datos contienen el 100% de todos los posibles tripletes de taxones y son decisivos para el 100% de todos los árboles posibles. Todas las alineaciones se han depositado en el repositorio de datos Dryad [73].

Sesgo de GC

El contenido de GC varió considerablemente entre linajes y también dentro de un solo genoma, y ​​las pruebas de chi-cuadrado rechazaron la hipótesis nula de frecuencias de base homogéneas (Tabla 1). El contenido medio de GC en la matriz ntAll fue del 38,9%, y osciló entre el 54,3% en Selaginella uncinata al 27,5% en Helicosporidium sp. (Figura 1, archivo adicional 3). Además, el contenido medio de GC varió entre la primera, segunda y tercera posición del codón, con la mayor variación entre los linajes en la tercera posición del codón (Figura 1, archivo adicional 3). Aunque hubo una gran heterogeneidad en el contenido de GC en todas las especies, hubo relativamente poca variación entre los taxones de plantas de semillas (Figura 2). También hubo una correlación significativa entre la composición de nucleótidos y la composición de aminoácidos. Los genomas de plastidios que son ricos en GC tenían un porcentaje significativamente mayor (Figura 3 p & lt 0,001) de aminoácidos que están codificados por codones ricos en GC (es decir, G, A, R y P). De manera similar, los genomas de plastidios ricos en GC tenían un porcentaje significativamente menor (Figura 4 p & lt 0.001) de aminoácidos que están codificados por codones ricos en AT (es decir, F, Y, M, I, N y K).

Diagramas de caja del porcentaje de contenido de GC en los conjuntos de datos ntAll y ntNo3rd, así como en las posiciones de codón primero, segundo y tercero del conjunto de datos ntAll.

Diagramas de caja del porcentaje de contenido de GC en plantas con semillas ( Espermatophyta a la izquierda) y el conjunto de datos en su conjunto ( Viridiplantae a la derecha) en los conjuntos de datos ntAll y ntNo3rd, así como las posiciones de codón primero, segundo y tercero del conjunto de datos ntAll. Para cada par de diagramas de caja, los valores de las plantas con semillas (Espermatophyta) están a la izquierda, y los valores para todos los taxones de plantas verdes (Viridiplantae) están a la derecha.

Correlación entre el porcentaje de contenido de nucleótidos GC en la matriz ntAll y el porcentaje de aminoácidos en la matriz AA que están codificados por codones ricos en GC (G, A, R y P).

Correlación entre el porcentaje de contenido de nucleótidos GC en la matriz ntAll y el porcentaje de aminoácidos en la matriz AA codificados por codones ricos en AT (F, Y, M, I, N y K).

Análisis filogenéticos

En los análisis filogenéticos de todos los conjuntos de datos y esquemas de partición, la estrategia de partición con la mayoría de las particiones se ajusta mejor a los datos según el AICc (Tabla 2). Estos modelos de mejor ajuste dividieron la matriz AA por gen (78 particiones) y las matrices de nucleótidos (ntAll, ntNo3rd) y RY por posición de codón y gen (234 particiones). Todos los análisis de arranque a posteriori indicaron que la convergencia de los valores de soporte se había alcanzado después de 100 repeticiones y, por lo tanto, nuestra elección de 200 repeticiones fue más que suficiente para obtener valores de arranque fiables.

Nos centraremos en informar las relaciones de los principales clados de Viridiplantae se muestra en los árboles de resumen de consenso de arranque de regla de mayoría de probabilidad máxima (ML) del 50% para cada conjunto de datos: ntAll (Figura 5), ​​ntNo3rd (Figura 6), RY (Figura 7) y AA (Figura 8). Estos árboles de resumen colapsan algunos clados para facilitar la visualización de las principales relaciones dentro Viridiplantae. En la Tabla 3 se ofrece un resumen de los resultados importantes y los conflictos entre estos cuatro conjuntos de datos. Proporcionamos árboles de consenso de arranque de la regla de la mayoría completa para ntAll (Figuras 9, 10, 11, 12, 13 y 14), ntNo3rd (archivo adicional 4), RY (archivo adicional 5) y AA (archivo adicional 6) conjuntos de datos. También se proporcionan árboles ML con longitudes de rama y valores BS: ntAll (archivo adicional 7), ntNo3rd (archivo adicional 8), RY (archivo adicional 9) y AA (archivo adicional 10). Los valores de soporte promedio entre todos los nodos internos en los árboles ML fueron ligeramente más altos en la filogenia ntAll (

94% de compatibilidad con bootstrap [BS] Archivo adicional 7) en comparación con los otros conjuntos de datos (

90-91% BS Archivos adicionales 8, 9 y 10). La filogenia ntAll también tuvo la mayor cantidad de clados resueltos con ≥ 70% BS (92% 327 biparticiones resueltas de 357 posibles) mientras que los conjuntos de datos ntNo3rd, RY y AA tuvieron 87%, 87% y 86% de las posibles biparticiones resueltas a ≥ 70% BS, respectivamente. Todos los árboles resultantes se han depositado en el repositorio de datos Dryad [73].

Cincuenta por ciento de probabilidad máxima, regla de la mayoría, árbol de resumen de consenso de arranque de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Los terminales con un triángulo representan clados colapsados ​​con & gt 2 taxones. Anote la posición de Lycopodiophyta como hermana de Espermatophyta es probable que se deba a un sesgo de composición de la base (ver texto). Consulte las Figuras 9, 10, 11, 12, 13 y 14 para ver el árbol completo y el archivo adicional 1 para la taxonomía. Lami. = Lamiidae Campanuli. = Campanulidae Lyco. = Lycopodiophyta.

Cincuenta por ciento de probabilidad máxima, regla de la mayoría, árbol de resumen de consenso de arranque de Viridiplantae inferido del análisis de posiciones de codón primero y segundo (ntNo3rd). Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 38,898 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Los terminales con un triángulo representan clados colapsados ​​con & gt 2 taxones. Consulte el archivo adicional 4 para ver el árbol completo y el archivo adicional 1 para ver la taxonomía. Lami. = Lamiidae Campanuli. = Campanulidae.

Cincuenta por ciento de probabilidad máxima, regla de la mayoría, árbol de resumen de consenso de arranque de Viridiplantae inferido del análisis con codificación RY (RY). Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Los terminales con un triángulo representan clados colapsados ​​con & gt 2 taxones. Consulte el archivo adicional 5 para ver el árbol completo y el archivo adicional 1 para ver la taxonomía. Lami. = Lamiidae Campanuli. = Campanulidae.

Cincuenta por ciento de probabilidad máxima, regla de la mayoría, árbol de resumen de consenso de arranque de Viridiplantae inferido del análisis de aminoácidos (AA). Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plástido (ntax = 360 19,449 AAs datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Los terminales con un triángulo representan clados colapsados ​​con & gt 2 taxones. Consulte el archivo adicional 6 para ver el árbol completo y el archivo adicional 1 para ver la taxonomía. Lami. = Lamiidae Campanuli. = Campanulidae.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Chlorophyta, Chlorokybophyceae, Mesostigmatophyceae, Charophyceae, Coleochaetophyceae, Zygnematophyceae, Marchantiophyta, Bryophyta, y Anthocerotophyta. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. El árbol continúa en la Figura 10.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Monilophyta, Lycopodiophyta , y Acrogymnospermae. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. Anote la posición de Lycopodiophyta como hermana de Espermatophyta es probable que se deba a un sesgo de composición de la base (ver texto). El árbol continúa en las Figuras 9 y 11.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Amborellales, Ninfas, Austrobaileyales, Cloranthales, y Magnoliidae. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. El árbol continúa en las Figuras 10 y 12.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Monocotiledóneas. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. El árbol continúa en las Figuras 11 y 13.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Ceratophyllales, Ranunculales, Sabiaceae, Proteales, Trochodendrales, Buxales, Gunnerales, y Superasteridae. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. El árbol continúa en las Figuras 12 y 14.

Cincuenta por ciento de máxima probabilidad árbol de consenso de arranque de la regla de la mayoría de Viridiplantae inferido del análisis de todas las posiciones de nucleótidos (ntAll). Porción de árbol mostrando Dilleniaceae y Superrosidae. Conjunto de datos derivado de 78 genes que codifican proteínas del genoma del plastidio (ntax = 360 58,347 pb de datos faltantes

15,6%). Se indican valores de soporte de Bootstrap ≥ 50%. Consulte también la Figura 5 para ver un árbol resumido de las principales Viridiplantae clades y archivo adicional 1 para taxonomía. El árbol continúa en la Figura 13.

La monofilia de Clorofita recibe 100% BS en todos los análisis. Prasinofíceas consistentemente no son monofiléticos. En cambio, el prasinofito Nephroselmis es hermana de todos los demás Clorofita (Figura 9 Archivos adicionales 4, 5 y 6), mientras permanecen Prasinofíceas forman un clado que se apoya de diversas formas (ntAll 97% BS, ntNo3rd 78% BS, RY 93% BS y AA 68% BS) y es hermano de un clado de los restantes Clorofita. Clorofíceas son monofiléticos (100% BS en todos los análisis), pero Trebouxiophyceae y Ulvophyceae no son monofiléticos, y la relación de Clorofíceas a estos linajes está sin resolver.

Recuperamos consistentemente un solo conjunto de relaciones entre las algas estreptofíticas que subtienden el clado de plantas terrestres. Zygnematophyceae son hermanas de las plantas terrestres, Coleochaetophyceae eres hermana de Zygnematophyceae + Embryophyta, Charophyceae eres hermana de Coleochaetophyceae + (Zygnematophyceae + Embryophyta), y un clado de Mesostigmatophyceae + Clorokybophyceae es hermana de todos los demás Estreptophyta. Cada una de estas relaciones tiene un soporte de BS ≥86% (Figuras 5, 6, 7 y 8).

El orden de ramificación de los linajes de plantas terrestres no vasculares difiere entre los análisis. En los análisis de los conjuntos de datos ntAll y RY, Marchantiophyta (hepáticas), seguido de Bryophyta (musgos), y luego Anthocerotophyta (hornworts) son los linajes de plantas terrestres de ramificación más temprana, con Anthocerotophyta la hermana inmediata de las plantas vasculares (Traqueofita Figuras 5 y 7). En los análisis ntAll y RY, estas relaciones tenían ≥89% de apoyo BS, excepto para el Bryophyta + (Anthocerophyta + Traqueofita) en el análisis ntAll, que recibió solo un 69% de BS (Figura 5). Por el contrario, en los análisis ntNo3rd y AA, Bryophyta y Marchantiophyta formó un clado (78% BS [Figura 6] y 99% BS [Figura 8], respectivamente), seguido de Anthocerophyta como hermana de Traqueofita (94% [Figura 6] y 53% BS [Figura 8], respectivamente).

Dentro de Traqueofita, los conjuntos de datos ntNo3rd, RY y AA se ubican Lycopodiophyta hermana de un Euphyllophyta cladeMonilophyta + Espermatophyta ≥89% BS, Figuras 6, 7 y 8). Sin embargo, el análisis de los lugares del conjunto de datos ntAll Monilophyta hermana de un clado de Lycopodiophyta + Espermatophyta (75% BS, Figuras 5, 6, 7, 8, 9 y 10).

Nuestros análisis de Monilophyta generalmente revelan un fuerte apoyo para un clado de Equisetales + Psilotales como hermana de Marattiales + helechos leptosporangiados (representados por Cyatheales y Polypodiales). El menor apoyo obtenido fue para Equisetales + Psilotales en el análisis ntNo3rd (84% BS Figura 6) y ntAll (89% BS Figura 5) todos los demás nodos en todos los análisis recibieron & gt 90% BS, con Marattiales + helechos leptosporangiados que reciben ≥ 99% BS.

Dentro de Espermatophyta, todos los análisis colocan las gimnospermas existentes (Acrogymnospermae) hermana de Angiospermas con 100% BS. Dentro de las gimnospermas existentes, Cycadales y Ginkgoales forman un clado (≥ 98% BS en ntAll, ntNo3rd y AA 51% BS en RY) que es hermano de un clado en el que Gnetofita (100% BS en todos los análisis) se anidan dentro de las coníferas parafiléticas. Generalmente hay un alto apoyo (100% BS en ntAll [Figura 5], ntNo3rd [Figura 6] y AA [Figura 7] 87% BS [Figura 8] en RY) colocando Gnetofita como hermana de un clado de Araucariales + Cupressales. Este clado "Gnecup" [sensu 16, 30, 41] es entonces hermano de Pinales, que tiene 100% BS en todos los análisis.

En todos los análisis, Angiospermas recibir 100% BS, y Amborella (Amborellales) es hermana de todas las demás angiospermas, seguida de Ninfas, y luego Austrobaileyales. Estas relaciones están respaldadas en su mayoría por BS al 100%. Sin embargo, Ninfas + (Austrobaileyales + Mesangiospermas) recibe 81% BS (Figura 6) en los análisis ntNo3rd y 70% BS (Figura 8) en los análisis AA. Las angiospermas restantes (Mesangiospermas) reciben 100% BS en todos los análisis. Dentro de Mesangiospermas, las relaciones entre Monocotiledóneas, Magnoliidae, Eudicotyledoneae, y Ceratophyllum (Ceratophyllales) no están bien respaldados y varían según el análisis. El soporte más fuerte para la colocación de Ceratophyllales es 75% BS como hermana de Eudicotyledoneae en el análisis RY (Figura 7).

Cloranthales recibir 61-69% BS como hermana de los bien apoyados (100% BS en ntAll, RY 83% BS en ntNo3rd) Magnoliidae. Sin embargo, Magnoliidae no son monofiléticos en los análisis de AA, donde Piperales eres hermana de Ceratophyllales (67% BS Figura 8).

Dentro del clado de las monocotiledóneas (Monocotiledóneas), Acorales, seguido por Alismatales, tienen 100% BS en todos los análisis como hermanas posteriores a las monocotiledóneas restantes. En tres de nuestros análisis (ntAll, ntNo3rd y AA), un clado con soporte diverso (72%, 69% y 80% BS, respectivamente) de Liliales + (Pandanales + Dioscoreales) es hermana de un clado (& gt95% BS en estos tres análisis) de las monocotiledóneas restantes (Asparagales + Commelinidae). Sin embargo, en el análisis codificado por RY, Pandanales + Dioscoreales (100% BS) es hermana de un clado de Liliales + (Asparagales + Commelinidae), que recibe un 69% de BS (Figura 7). Aquí Asparagales + Commelinidae es compatible con 80% BS.

Dentro de los eudicots (Eudicotyledoneae), que reciben 100% BS en todos los análisis, Ranunculales son hermanas de los taxones restantes. En los análisis ntAll, ntNo3rd, RY y AA, el grupo de estos taxones restantes recibe 100%, 85%, 100% y 62% de BS, respectivamente. Las relaciones varían entre Sabiaceae, Proteales, y un clado de los taxones restantes, según el análisis. En los análisis ntAll y ntNo3rd, Proteales + Sabiaceae se admiten como clado, aunque con solo 63% y 60% BS, respectivamente. Sin embargo, en el análisis de RY, Proteales son hermanas de un clado que contiene Sabiaceae más el resto de taxones, que tiene 79% BS. En el análisis de AA, las relaciones entre estos tres clados están sin resolver.

Entre los eudicots restantes, recuperamos constantemente Trochodendrales como hermana de Buxales + Pentapetalas y Gunnerales como hermana de los linajes restantes de Pentapetalas: Dilleniaceae, Superrosidae, y Superasteridae. La colocación de Dilleniaceae sigue siendo incierto. La familia es hermana de Superrosidae en los análisis ntAll (95% BS), ntNo3rd (77% BS) y RY (57% BS), pero aparece como hermano de Superasteridae (70% BS) en el análisis AA.

Dentro de Superrosidae, un clado de Vitales + Saxifragales es compatible con los análisis ntAll (75% BS), ntNo3rd (70% BS) y AA (78% BS). En el análisis RY, la relación entre Saxifragales, Vitalesy restante Rosidae (Fabidae + Malvidae) no está resuelto. Fabidae y Malvidae ambos se recuperan con ≥ 99% BS en los análisis ntAll y RY. Sin embargo, cada clado recibe solo el 70% de BS en el análisis ntNo3rd. En el análisis de AA, ninguno de los clados es monofilético. Zygophyllales están incrustados (68% BS) dentro de un clado de Malvidae taxones. El clado COM (Celastrales, Oxalidales, Malpighiales) es hermana de un clado de Fagales, Cucurbitales, Rosales, y Fabales en Fabidae en los árboles AA (69% BS Figura 8), RY (82% BS Figura 7) y ntAll (81% BS Figura 5) y forma una tricotomía con Zygophyllales y el clado de Fagales, Cucurbitales, Rosales, y Fabales en el árbol ntNo3rd (70% BS Figura 6). Zygophyllales eres hermana de Geraniales (69% BS Figura 8) en el árbol AA y hermano de todos los demás Fabidae en los árboles ntAll y RY (con 100% [Figura 5] y 99% BS [Figura 7], respectivamente).

Superasteridae (Santalales, Berberidopsidales, Caryophyllales, y Asteridae) se recuperan en todos los análisis. Este clado recibe 100% BS en los análisis ntAll y RY, 95% BS en el análisis ntNo3rd y 66% BS en el análisis AA. Santalales y Berberidopsidales son fuertemente apoyadas como hermanas posteriores a Caryophyllales + Asteridae. Dentro de Asteridae, Cornales, seguido por Ericales, son hermanas posteriores de un clado fuertemente apoyado que comprende Campanulidae y Lamiidae clados. Dentro de Lamiidae, la colocación de Boraginaceae es débil entre los diversos análisis. Boraginaceae eres hermana de Gentianales (59% BS Figura 8) en el árbol AA, parte de una tricotomía (100% BS Figura 5) con Lamiales y Solanales + Gentianales en el árbol ntAll, y hermana de un clado débilmente sostenido que incluye Gentianales, Lamiales, y Solanales en los árboles ntNo3rd (Figura 6) y RY (Figura 7).

El análisis de sólo las posiciones del tercer codón (nt3rdOnly, archivo adicional 11) resultó en varios conflictos muy fuertes a lo largo de la columna vertebral de Viridiplantae en comparación con la topología de los análisis ntNo3rd. Estos conflictos incluyen las relaciones troncales dentro Chlorophyta, the placements of Cycadales y Lycopodiophyta, the relationships of the three major bryophyte lineages, and backbone relationships within Poales. Removal of four taxa (Epifagus, Helicosporidium, Neottia, y Rhizanthella) with elevated rates of molecular evolution and few genes present in the data sets did not significantly affect the resulting topologies.


Conclusión

We investigated the frequency of recent interkingdom gene transfer between CTG and bacterial species. We located two strongly supported incidences of HGT, both within the C. parapsilosis genoma. We also located independent transfers into the Pezizomycotina, Basidiomycotina and Protozoan lineages.

We cannot determine the exact origin of the PR homolog (CPAG_02038) found in the C. parapsilosis genoma. However, based on its phylogenetic position it either originated from a Burkholderia source, or more likely an organism not yet represented in the sequence databases. Our PR phylogenetic analysis also suggests there were two independent transfers into Pezizomycotina species, one from an Actinobacterial source, and the second is from an unknown proteobacterial source. También hay evidencia de que T. cruzi has obtained its PR homolog from a Firmicutes species. The transferred PR genes analyzed here belong to a superfamily of proline racemases, although we cannot determine their exact function in the fungal species examined. Their proximity to an amino acid transporter (in C. parapsilosis) and a FAD dependent oxidoreductase (in A. niger y G. zeae) suggests they do have a role in amino acid metabolism. Furthermore, evidence of multiple independent transfers into fungi suggests the protein does confer a biological advantage, although we cannot determine what is. The bacteria-derived PR gene has the potential to be a novel antifungal drug target as there would be no undesired host protein-drug interactions.

The bacterial PhzF homolog (CPAG_03462) found in C. parapsilosis most likely originated from a proteobacterial source. Most CTG species examined contained PhzF homologs, with the exception of L. elongisporus. The crystal structure the PhzF homolog in S. cerevisiae has been determined and while its function remains unknown, it is not thought to be involved in phenazine production [62]. We postulate that the PhzF homolog present in other CTG species was initially lost by the ancestor of C. parapsilosis y L. elongisporus, but subsequently regained by C. parapsilosis through HGT. The loss of eukaryote genes and subsequent reacquisition of a prokaryotic copy has previously been described in yeast, and can confer specific metabolic capabilities. An analysis of the biotin biosynthesis pathway discovered that the ancestor of Candida, Debaryomyces, Kluyveromyces y Saccharomyces lost the majority of the pathway after the divergence from the ancestor of Y. lipolytica. Sin embargo, Saccharomyces species have rebuilt the biotin pathway through gene duplication/neofunctionalization after horizontal gene transfer from α and γ proteobacterial sources [20]. The acquisition of the URA1 gene (encoding dihydroorotate dehydrogenase) from Lactobacillus and replacement of the endogenous gene in S. cerevisiae, allowed growth under anaerobic conditions [19]. Similarly, acquisition of BDS1 (alkyl-aryl-sulfatase) from proteobacteria may have enabled the survival of S. cerevisiae in a harsh soil environment [19]. Our PhzF phylogeny suggests that the PhzF homolog found in most CTG species originated from an ancient HGT event, from a member of the proteobacteria. Our analysis also shows that S. pombe has obtained a PhzF homolog from a CTG species, most likely one closely related to D. hansenii. There is also phylogenetic evidence showing that an ancestral Ustilaginomycotina species gained a PhzF gene from an unknown bacterial source. We cannot however, determine the biological advantage to the organisms.

Although it was not the major goal of this study, we did locate HGT from bacteria into fungal genomes outside the CTG clade, and also inter-fungal transfers. In a previous analysis of HGT in diplomonads, fifteen genes were found to have undergone HGT [18]. There is phylogenetic evidence that these genes have undergone independent transfers into other eukaryotic lineages including Fungi. Therfore, in eukaryotes just as HGT has affected some species more than others [63], there may be groups of genes that are more likely to be taken up through HGT than others. We cannot test this directly however, as we have not identified all cases of HGT from bacteria to fungi outside the CTG clade.

Our analysis indicates that recent interkingdom gene transfer into extant CTG species is negligible. This supports a previous hypothesis that genetic code alterations blocks horizontal gene transfer [64]. It should be noted however that we searched for recent bacterial gene transfers into individual CTG species, and not for more ancient transfers. We took this approach because the presence of recently gained bacterial genes in a eukaryote genome should be readily detected compared to older transfers. Similarly, we have not investigated eukaryote-to-eukaryote transfers. It is therefore possible that we have underestimated the overall rate of HGT into the CTG lineage. The discovery of HGT in other fungal lineages implies that HGT plays an important role in fungal evolution and deserves further analysis. In particular a strategy which can detect ancient gene transfers would be meaningful.


A comparison of fungal endophytic community diversity in tree leaves of rural and urban temperate forests of Kanto district, eastern Japan

To clarify the effects of forest fragmentation and a change in tree species composition following urbanization on endophytic fungal communities, we isolated fungal endophytes from the foliage of nine tree species in suburban (Kashiwa City, Chiba) and rural (Mt. Wagakuni, Ibaraki Mt. Takao, Tokyo) forests and compared the fungal communities between sites and host tree species. Host specificity was evaluated using the index of host specificity (Si), and the number of isolated species, total isolation frequency, and the diversity index were calculated. From just one to several host-specific species were recognized in all host tree species at all sites. The total isolation frequency of all fungal species on Quercus myrsinaefolia, Quercus serrata, y Chamaecyparis obtusa and the total isolation frequency of host-specific species on Q. myrsinaefolia, Q. serrata, y Eurya japonica were significantly lower in Kashiwa than in the rural forests. The similarity indices (nonmetric multidimensional scaling (NMS) and CMH) of endophytic communities among different tree species were higher in Kashiwa, as many tree species shared the same fungal species in the suburban forest. Endophytic fungi with a broad host range were grouped into four clusters suggesting their preference for conifer/broadleaves and evergreen/deciduous trees. Forest fragmentation and isolation by urbanization have been shown to cause the decline of host-specific fungal species and a decrease in β diversity of endophytic communities, i.e., endophytic communities associated with tree leaves in suburban forests were found to be depauperate.

Reflejos

► We focused on both host specificity and sympatry of endophytes. ► We isolated endophytes from foliages of nine tree species in urban and rural forests. ► Host-specific species were recognized in all host tree species at all sites. ► Suburban forest showed a decrease in β diversity of endophytic communities. ► The similarity indices of endophytic communities were higher in suburban forest.


15.6: The Fungal Phylogeny - Biology

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Plant evolution overwhelms geographical origin in shaping rhizosphere fungi across latitudes

Xinmin Lu, State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei 430070, China.

State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

School of Life Sciences, Central China Normal University, Hubei, China

State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

College of Plant Sciences & Technology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

School of Life Sciences, Central China Normal University, Hubei, China

State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

College of Plant Sciences & Technology, Huazhong Agricultural University, Hubei, China

Xinmin Lu, State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Hubei 430070, China.

Chunqiang Wei and Lunlun Gao contributed equally to this work.

Abstracto

As the number of non-native invasive species in the world is increasing, there is a pressing need to understand the effects of invasive species on recipient biotic communities to improve our ability to migrate or relieve their potential negative effects on biodiversity and ecosystem functions. Plant invasions have been shown to impose great threats to aboveground biotic communities however, invasive impacts on soil biota remain ambiguous, partially because of the paucity of studies with a large number of species across biogeographic gradients. Here, we characterized rhizosphere fungal communities of 53 native and invasive plants spanning approximately 1800 km in China, as well as eight pairs of phylogenetically related native versus invasive plants in a greenhouse experiment. The results of both field survey and greenhouse experiment showed that rhizosphere fungal composition was primarily predicted by plant phylogeny (e.g. family and species), and plant geographic origin (native vs. invasive) and abiotic factors had much smaller effects. We detected no differences in the number and relative abundance of total and family/species-specific OTUs (i.e. overall, pathogens and mutualists) associated with these native and invasive plants on average, suggesting novel co-evolution between native soil fungi and these invasive plants. These results suggest that non-native plant invasions had only a weak impact on soil fungi, partially due to stronger controls of plant evolution on rhizosphere fungi and adaptation of native fungi to these invasive species. Interestingly, rhizosphere fungal composition was more variable between invasive plants than between native plants at middle latitudes, potentially creating spatial variations in plant–soil interactions and, in turn, invasion dynamics. These novel findings highlight the importance of integrating phylogenetic and biogeographical approaches to explore invasive effects on native biota.


Materiales y métodos

Genome sequences.

Genome sequence and open reading frame (ORF) annotations for the saccharomycete species were obtained from P. Cliften, M. Kellis, and the Saccharomyces Genome Database (Goffeau et al. 1996 Cliften et al. 2003 Kellis et al. 2003). Sequences for other genomes were downloaded from the published or listed Web sites as follows. K. waltii (Kellis et al. 2004), A. gossypii (Dietrich et al. 2004), C. albicans (Assembly 6 http://www-sequence.stanford.edu/group/candida/) (Jones et al. 2004), N. crassa (Release 3 Galagan et al. 2003), M. grisea (Release 2 http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/) , Como. nidulanos (Release 3.1 http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/) , and Sch. Pombe (Wood et al. 2002). A conservative list of putative ORFs from S. kudriavzevii, S. castellii, and S. kluyveri was generated, taking all ORFs of more than 100 amino acids as putative genes. ORFs orthologous to S. cerevisiae genes were identified as described below some intron-containing S. cerevisiae genes that may also contain introns in these species (namely ribosomal protein genes) were identified by tBLASTn and manually added to the list of orthologs for these species.

Orthologs between S. cerevisiae and S. paradoxus, S. mikatae, and S. bayanus (Kellis et al. 2003) were downloaded from the Saccharomyces Genome Database ( http://www.yeastgenome.org/) . All other orthologs to S. cerevisiae genes were assigned using the method of Wall et al. (Wall et al. 2003) using a BLAST e-value cutoff of 10 -5 and the requirement for fewer than 20% gapped positions in the Clustal W alignments. The number of orthologs assigned in each species is listed in Table 1, and the complete results are available in Datasets S5–S12.

S. cerevisiae gene clusters.

Groups of known or putatively coregulated genes were identified in three ways. First, we used hierarchical (Eisen et al. 1998) and fuzzy k-means (Gasch and Eisen 2002) clustering to organize publicly available yeast gene expression data (DeRisi et al. 1997 Spellman et al. 1998 Gasch et al. 2000 Lyons et al. 2000 Ogawa et al. 2000 Primig et al. 2000 Gasch et al. 2001 Yoshimoto et al. 2002), taking gene clusters that were correlated by more than about 0.7 or with a membership of 0.08 or greater (Gasch and Eisen 2002). Second, we identified genes or transcripts whose flanking regions are physically bound by the same DNA or RNA binding proteins, as indicated by immunoprecipitation experiments (Simon et al. 1993 Iyer et al. 2001 Lieb et al. 2001 Simon et al. 2001 Lee et al. 2002 Gerber et al. 2004): For the DNA immunoprecipitation experiments, genes were ranked according to the published binding pag values, and a sliding pag value (between 10 -2 and 10 -4 ) was applied such that at least 20 genes were selected in each group. Transcripts that are bound by RNA binding proteins were taken from (Gerber et al. 2004). Finally, genes with the same functional annotations (Weng et al. 2003), and genes known to be coregulated by various transcription factors (Gasch et al. 2000 Lyons et al. 2000 Ogawa et al. 2000 Shakoury-Elizeh et al. 2004), were grouped together. In all, we identified 264 partially redundant groups of S. cerevisiae genes that are likely to be coregulated. These gene groups ranged in size from four to 570 genes, with a median size of 17 genes per group. The complete gene groups are available in Dataset S2.

Motif identification and enrichment.

We compiled from the literature a list of 80 known transcription factor-binding sites, represented by IUPAC consensus sequences (Dataset S1) (Costanzo et al. 2001 Weng et al. 2003). Unless otherwise noted, we searched 1,000 bp upstream or 500 bp downstream of the genes from each group in each fungal genome for sequences that matched the consensus binding sites, by doing string comparisons on both strands using PERL scripts. For each group of genes identified above, we scored the enrichment of genes whose flanking regions (either 500 bp upstream, 1,000 bp upstream, or 500 bp downstream) contain one or more example of each cis-regulatory element, using the hypergeometric distribution

dónde METRO is the number of genes that contain the motif in a group of I selected genes, relative to norte genes that contain the motif in a genome of l genes. A pag ≤ 0.0002 (approximately 0.01/80 tests) was deemed statistically significant for the consensus sequences, although if the sequence was enriched in the known group of target genes, we relaxed the cutoff to pag = 0,01. A cutoff of pag ≤ 2 × 10 –5 was applied to sequences that matched the MEME matrices. For the Mig1p and GATA binding sequences, which are sufficiently short and occur frequently in each genome, we also scored the enrichment of genes whose upstream region contained two or more examples of the known binding sites.

For each group of genes, we also ran the motif-finding algorithm MEME (Bailey and Elkan 1994) on the upstream regions of S. cerevisiae genes or their orthologs in each species, using a two-component mixture model both with and without a motif-width specification of 8 bp. Unless otherwise noted, we used 500 bp upstream (for the hemiascomycetes) or 1,000 bp upstream (for the euascomycetes and Sch. Pombe) of the genes in each group. Thus, for each group of coregulated genes, we performed 14 MEME analyses (each identifying three matrices) on the upstream regions of the genes from a given species. Matrices that matched known S. cerevisiae regulatory elements were identified by manual and automated comparisons, similar to that previous described (Hughes et al. 2000). A position-weight matrix was calculated for each motif on the basis of norte motif examples MEME identified by counting the number of occurrences of each base at each position in norte motifs, adding one pseudocount, and dividing by norte + 4. A log-likelihood score S was calculated for each motif example as follows.

En esta fórmula, pag is each position in the motif, B is the base y X is a matrix of indicator variables representing the sequence, where Xpb = 1 if the sequence has base B at position pag, and zero otherwise. The probabilities of bases in the motif according to the position-weight matrix are represented by f motif , and the probabilities of bases in the genomic background are represented by f background (vea abajo). The score S′ was assigned to each matrix, equal to 0.75× the average S of the motif examples, using the base frequency from each genome as the background model (G/C = 0.2 and A/T = 0.3 for all species except N. crassa , where G/C/A/T = 0.25). This score was used as a cutoff to identify genomic examples of the matrix.

To identify genes whose upstream regions contained examples of each motif, we calculated the log-likelihood S of each 8-bp sequence within the 1,000 bp upstream region of each gene. The background model was based on the genomic nucleotide frequency in the 50 bp upstream window corresponding to the position of the sequence being assessed. We used this model to overcome the species-specific positional nucleotide biases immediately upstream of coding sequences (A. M. M., A. P. G., D. Y. C., and M. B. E., unpublished data). A sequence was considered a match to the matrix if S & gt S ′. The enrichment of genes that contained each motif was scored using the hypergeometric distribution, as described above. A pag ≤ 1 × 10 –5 (0.01 divided by the number of matrices tested in each species) was considered statistically significant. Out of the MEME matrices trained on the non- S. cerevisiae species, 53 were enriched in the gene group in which they were identified. Of these elements, 28 were similar to S. cerevisiae elements shown in Figure 2 and were enriched in the S. cerevisiae genes. An additional six matrices were redundantly identified in nearly identical gene groups (namely, Fhl1p targets and ribosomal protein genes) from the same species, and two elements were very similar and identified in the same gene group from Como. nidulanos yM. grisea. Thus, in all, 19 novel elements were identified. The complete list of matrices is available in Dataset S47.

Positional distribution and spacing of cis-sequences.

Genes that contained sequences that matched theS. cerevisiae position-weight matrices were identified as described above. We then calculated the frequency of each sequence in 50-bp windows upstream of the potential target genes and compared it to the frequency of that element in the corresponding upstream window for all of the genes in that genome. To identify distributions that were statistically different from the background, we identified 50-bp windows that contained a disproportionate number of the cis-sequences in the target upstream regions compared to the background, using the hypergeometric distribution presented above, where I was the total number of elements identified upstream of the genes in each group, METRO was the number of those elements that fell within a given 50-bp window, l was the total number of elements upstream of all of the genes in that genome and norte was the number of those elements that fell within the same 50-bp window. We considered an element's distribution to be significant if there was at least one 50-bp window with pag ≤ 0.01 only 5%–10% of the elements had distributions that met this criterion in gene groups other than their putative target genes. We calculated the correlation between element positions in S. cerevisiae and each of the other species by taking all possible pairwise combinations of a cis-element's positions in a given S. cerevisiae upstream region and in the orthologous region from other species and plotting these values for each group of coregulated genes (example scatter plots shown in Figures S4 and S5).

Genes that contained sequences that matched the S. cerevisiae Cbf1p and Met31/32p position-weight matrices were identified in each species as described above. The average spacing between Cbf1p and Met31/32p binding sites within the 500 bp-upstream regions of the methionine biosynthesis genes and of all of the genes in each genome was measured by calculating the distance between all pair-wise combinations of the two motifs in each upstream region and taking the average spacing for the respective group of genes.

Rpn4p matrix comparisons.

To compare the upstream sequences identified in proteasome genes fromS. cerevisiae y C. albicans, and to ensure that the identified sequences were not obtained by sampling bias, we performed the following permutation analysis. We ran MEME on the entire set of upstream regions of 26 proteasome genes with orthologs in both species, using the conservative one-per-sequence model. This produced a “meta-matrix” that identified exactly one putative binding site from each gene, leaving us with a set of exactly 52. We calculated the likelihood-ratio statistic, testing the hypothesis that the sequences were drawn from a single multinomial, or from multinomials estimated separately for each species. In order to test the significance of this statistic, we randomly divided the data into two equal-sized groups 10,000 times, recalculated the statistic, and found that matrix positions 2, 3, and 9 had values ofpag & lt 0,001. The results were similar when the test was performed on all cis-sequences that matched the meta-matrix: These sequences were identified in both species using the S. cerevisiae background model (which identified a list of sequences that was nearly identical to that generated when the C. albicans background model was used to identify motifs from each species).

This set of elements was organized by sequence similarity as follows. Each basepair was represented by a four-dimensional binary vector of indicator variables: G = 1,0,0,0 A = 0,1,0,0 C = 0,0,1,0 T = 0,0,0,1. Each basepair in each 10-mer sequence was replaced by the corresponding vector of indicator variables, translating the 10-mer sequence into a 40-dimensional binary vector. The sequences were organized by hierarchically clustering the binary vectors that represented them, using the program Cluster (Eisen et al. 1998). The organized sequences were visualized using the program TreeView ( available at http://rana.lbl.gov) as shown in Figure S6.

Cloning and culture growth.

The S. cerevisiae RPN4 ORF and its orthologs in C. albicans (orf6.4920) y N. crassa (NCU01640.1) were cloned by PCR from genomic DNA ( S. cerevisiae strain S288C, C. albicans strain NIH 3147 [#10231D American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, United States], and N. crassa Mauriceville strain) using Bio-X-act DNA polymerase (BioLine, Boston, Massachusetts, United States). Primers that exactly spanned each ORF (excluding the first ATG) and introduced XmaI and NcoI sites at the 5′ and 3′ ends, respectively, of each PCR product, were used to amplify each ORF. The digested products were cloned into pCAL-n (Stratagene, La Jolla, California, United States) to add an amino-terminal calmodulin-binding protein tag to each protein. In addition, a hybrid protein was generated from the amino-terminal portion of Sc_ RPN4 (corresponding to nucleotide position 4–1,247) and the DNA binding-domain from C. albicans orf6.4920 (position 1,235–1,611), guided by Clustal W (Thompson et al. 1994 Chenna et al. 2003) alignments of the proteins. los orf6.4920 fragment was amplified by PCR, generating an EcoRI site in the amino end of the fragment. The digested fragment was ligated to a natural EcoRI site inSc_RPN4 (present in a region of high sequence conservation between the proteins), and the hybrid was cloned into pCAL-n as described above. The wild-type amino acid sequences of Sc_Rpn4p, Ca_Rpn4p, and the hybrid clones were verified by DNA sequencing. (The Mauriceville Rpn4p ortholog had five amino acid differences compared to the published sequence from strain 74A. Because we recovered the identical sequence from multiple independent PCRs, we take this to be the wild-type Nc_Rpn4p for this strain.) Each plasmid was used to transform BL21DE3-RIL E. coli cells (Stratagene).

Yeast overexpression plasmids were constructed by PCR amplification of Sc_RPN4, Ca_RPN4, o Hybrid_RPN from the above plasmids and cloned into the GAL-inducible expression plasmid pRS-TAP (provided by D. Nix) by homologous recombination and gapped plasmid repair. Reporter constructs were generated by cloning 40-bp fragments that contained either one or five copies of Sequence A or Sequence B upstream of the HIS3 minimal promoter in pDC204 (provided by D. Y. C.). Yeast strain BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0, provided by M. Kobor) was transformed with each overexpression construct and each reporter construct. Liquid cultures were grown to mid-log phase and washed three times with synthetic-dropout medium lacking histidine and glucose. Serial culture dilutions were spotted onto solid SC medium lacking uracil, leucine, and histidine, with 2% galactose, and containing 0–15 mM 3-amino triazole (Sigma, St. Louis, Missouri, United States). Photos were taken after growth for 3 d at 30 °C.

Protein purification and Biacore measurements.

The proteins were purified from bacteria by affinity purification. 250 ml of LB medium containing 50 ng/ml carbenicillin (Sigma) was inoculated with 8 ml of saturated cultures and grown at 37 °C to OD600 of approximately 1.0. The cells were induced with 0.3 mM IPTG (Sigma) at 30 °C for 1 h, collected by centrifugation at 4 °C, and flash-frozen in liquid nitrogen. The cells were resuspended in ice-cold 8V calcium binding buffer (50 mM Tris-Cl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM magnesium acetate, 1 mM imidazole, 2 mM calcium chloride, and 1 mM PMSF) and lysed on ice by sonication. The lysate was cleared by centrifugation, and the soluble extract was loaded onto 0.5 ml of calmodulin resin (Stratagene) in a 2-ml column (BioRad, Hercules, California, United States) at 4 °C. The column was washed with 8V calcium binding buffer followed by 8V binding buffer adjusted to 0.5 M NaCl. The resin was eluted with elution buffer (50 mM Tris-Cl [pH 7.5], 0.5 M NaCl, and 2 mM EGTA), and the eluates were flash-frozen and stored at –80 °C.

The interaction of each purified protein with three predicted Rpn4p binding sites was measured using a Biacore 3000 system (Biacore, Piscataway, New Jersey, United States). Complementary 40-nucleotide oligonucleotides were designed, with one oligonucleotide containing a 5′ biotinylated group (Qiagen, Valencia, California, United States). Each of the three sequences contained a different 10-bp core flanked by the same 15 bp that flanked a natural Rpn4p site from the C. albicans orf6.8078 gene: Sequence A ( GCGTGCCAGATAATC GGTGGCAAAA CGGAAGAAAAAGTGA) Sequence B ( GCGTGCCAGATAATC GAAGGCAAAA CGGAAGAAAAAGTGA) and Sequence C ( GCGTGCCAGATAATC AGTGGCAACA CGGAAGAAAAAGTGA). (The flanking sequence did not noticeably contribute to the binding properties, as a 40-bp fragment consisting of the natural Rpn4p site and flanking sequence from the S. cerevisiae gene PUP2 performed nearly indistinguishably from Sequence A in competition experiments [unpublished data].) The HPLC-purified oligonucleotides were combined at a ratio of 2:1 unbiotinylated:biotinylated oligonucleotides in 10 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1 mM EDTA, and 50 mM NaCl, heated to 95 °C for 10 min, and incubated at room temperature overnight. Each double-stranded, biotinylated sequence was bound to one flow cell of an SA sensor chip (Biacore) in HBS buffer (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% P20) at a flow rate of 10 μl/min. Each cell was coated with roughly the same DNA (approximately 46–56 response units) according to the manufacturer's instructions. The fourth flow cell was not coated with DNA and served as a control. A single cell on a second SA chip was coated in the same way with double-stranded, biotinylated Sequence I ( ACTTGTTCCCGCTCGCT GGAGCT CCTCCAACGACACGGGC), representing an instance of the GGAGCT site and flanking sequence from the N. crassa proteasome gene NCU06712.1.

Protein was diluted to 10–100 nM in ice-cold HBS buffer and maintained on ice until injection into the Biacore system. Proteins were passed through four flow cells at a flow rate of 10 μl/min for 90 s at room temperature, then HBS buffer was flowed over the chip at 10 μl/min for 180 s. The protein was desorbed by flowing 0.5% SDS over the chip for 30 s followed by HBS. The kinetics of binding were examined using the Biacore software, and the fit of each calculation was acceptable according to the manufacturer's instructions.

Double-stranded competitor DNA was generated by mixing equimolar amounts of complementary 30-nucleotide fragments, heating to 95 °C for 10 min, and allowing the mixture to cool to room temperature overnight. The DNAs were quantified before and after annealing by replicate absorbance measurements. Four different competitor fragments were used: Sequence D ( CCAGATAATC GGTGGCAAAA CGGAAGAAAA), Sequence E ( CCAGATAATC AGTGGCAAAA CGGAAGAAAA), and Sequence F ( CCAGATAATC GGTGGCAACA CGGAAGAAAA) the fourth sequence, Sequence G, ( CCAGATAATC CTGCATTTGG CGGAAGAAAA) was chosen as the worst-scoring sequence to the Sc_Rpn4p position-weight matrix and served as a negative control. Each fragment was mixed with 50 nM protein at a 1:1 or 5:1 molar ratio (or buffer was added for mock experiments), incubated for 50 min on ice, then injected into the Biacore system, as described above. The maximum response units of each protein binding to the three sequences on the chip were measured using the Biacore software.


Expresiones de gratitud

We thank M. Appenheimer, J. Black, and M. Messmer for helpful comments on the manuscript, E. Smith and UC Berkeley Natural Resources Library for assistance with archived citations, and J. Muhitch for providing the photomicrograph depicting lymph node HEV. This work was supported by the US National Institutes of Health (CA79765, <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"CA085183","term_id":"34938490","term_text":"CA085183">> CA085183, and <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"AI082039","term_id":"3418831","term_text":"AI082039">> AI082039) and the Jennifer Linscott Tietgen Family Foundation. We also acknowledge the significant contributions of colleagues in the field that could not always be cited due to space limitations.


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